線紋海馬早期性腺發(fā)育的組織學(xué)形態(tài)分析

陳美玲，符宏高，吳銳瓊，張雪萍，楊 瀅，閆亞楠，岑 萬，鄭樂云，黃 鎮(zhèn)

(1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117； 2.福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361006)

海馬(Hippocampus)隸屬于有頜總綱硬骨魚綱海龍目海龍科[1]．由于獨特的外觀，其具有較高的觀賞價值，一直受到人們的青睞．它也是珍稀的海洋藥源動物，在中醫(yī)藥學(xué)中占有重要地位[2]．干海馬不僅作為重要的藥源在國內(nèi)外進行貿(mào)易[3]，還是制備功能性食品的原料，具有較高的應(yīng)用價值[4]．

目前國內(nèi)最主要的海馬養(yǎng)殖品種有三斑海馬(Hippocampustrimaculatus)、膨腹海馬(Hippocampusabdominalis)和線紋海馬(Hippocampuserectus)等．線紋海馬原產(chǎn)于美洲地區(qū)、加勒比海等海域，因其具有生長速度快、繁殖和抗病能力強等特點被引進國內(nèi)養(yǎng)殖[5]．經(jīng)過十幾年的摸索，線紋海馬的人工育苗技術(shù)已經(jīng)成熟[6]．但是，線紋海馬的生殖生物學(xué)還有諸多問題有待研究．Selman[7]探索了線紋海馬卵巢的基本結(jié)構(gòu)，秦耿[8]在成年線紋海馬的性腺及生長發(fā)育方面進行了初步的研究，陳靈珍等[9]將線紋海馬精巢和卵巢皆分為6個時期，而目前線紋海馬的早期性腺發(fā)育還未見相關(guān)文獻報道．

原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells，PGCs)是能夠產(chǎn)生雄性或雌性生殖細(xì)胞的早期細(xì)胞．在胚胎發(fā)育早期，其不斷增殖并遷移至生殖嵴，與生殖上皮一起形成原始性腺，之后性別發(fā)生分化，形成精巢和卵巢[10-11]．研究表明，魚類的PGCs遷移至生殖嵴有3種方式：鱘魚是由臟壁中胚層遷移至腸系膜，最終到達生殖嵴部位；青鏘通過體節(jié)由體壁中胚層不斷遷移至生殖嵴處；部分魚類利用血液循環(huán)系統(tǒng)遷移至生殖嵴[12-13]，如真骨魚類肝中和細(xì)鱗大馬哈魚胚腎小管中的性原細(xì)胞.

近年來，vasa、dazl、boule和dnd等效應(yīng)基因已被廣泛用作生殖細(xì)胞標(biāo)記物，以進一步研究魚類原始生殖細(xì)胞的起源和遷移[14]．其中，vasa標(biāo)記后生動物生殖細(xì)胞的研究最深入．Duangkaew等[15]發(fā)現(xiàn)vasa不僅在條紋鰻鯰生殖細(xì)胞表達，而且在精子和卵黃素有很強的信號.Wu等[16]證明vasa在美洲鰣生殖細(xì)胞中特異性表達且對生殖細(xì)胞分裂必不可少．

因此本研究將以VASA抗體定位線紋海馬早期生殖嵴，之后通過組織學(xué)切片的技術(shù)解析卵巢和精巢開始分化和成熟的時間．本實驗結(jié)果不僅為海馬性腺發(fā)育生物學(xué)和性別決定機制的研究提供理論基礎(chǔ)，還將為線紋海馬的養(yǎng)殖育種提供理論指導(dǎo)．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的線紋海馬取自福建省水產(chǎn)研究所．

1.2 性腺組織切片制備與觀察

自線紋海馬出生后，每隔1 d進行取樣，每次取樣5只海馬．量取每只海馬體長后，在體視鏡下解剖，觀察性腺發(fā)育情況．隨后，整只海馬置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛(PFA)溶液中，4 ℃條件下固定24 h．固定完成后，將樣品置于體積分?jǐn)?shù)為30%、50%和70%的酒精中進行梯度脫水，之后實驗樣品可放在體積分?jǐn)?shù)70%的酒精中保存于-20 ℃冰箱．包埋切片實驗開展前，將樣品從體積分?jǐn)?shù)90%和100%的酒精中進行梯度脫水，充分脫水后的組織經(jīng)二甲苯透明和石蠟包埋，制備成蠟塊，之后進行石蠟切片，切片厚度為8 μm．

1.3 蘇木精-伊紅染色(H.E染色)

將石蠟組織切片進行蘇木精-伊紅染色，中性樹脂封片．在顯微鏡下拍照，并用配套軟件進行圖片處理．

1.4 免疫熒光技術(shù)

將石蠟組織切片按文獻的方法[13]進行免疫熒光實驗，所用的抗體為線紋海馬VASA蛋白的抗體(本實驗室自制)，二抗為Alexa Flour 488(Thermo Fisher)．完成后的切片利用激光共聚焦顯微鏡掃描熒光信號．

2 結(jié)果

2.1 VASA抗體的熒光染色定位線紋海馬生殖嵴

為了觀察線紋海馬的早期生殖嵴發(fā)育，使用VASA抗體對出生后的線紋海馬進行免疫熒光染色．出生后的線紋海馬體長為12 mm，經(jīng)過橫向切片，在體腔背部觀察到生殖嵴的組織，并且呈現(xiàn)VASA抗體的染色陽性信號(圖1a)．為進一步觀察生殖嵴的形態(tài)特征，對切片進行H.E染色(圖1b)，在切片中可見生殖嵴左右成對存在，PGCs被一層體細(xì)胞包圍，并且比周圍的體細(xì)胞大，細(xì)胞呈卵圓形或圓形，胞質(zhì)較多，細(xì)胞核較大，但此時期還沒有出現(xiàn)精巢和卵巢分化．

(a)線紋海馬性腺(熒光圖)；(b)線紋海馬性腺(H.E染色)箭頭所指為原始生殖細(xì)胞，方框圈出結(jié)構(gòu)為生殖嵴；PGC：原始生殖細(xì)胞；PN：胰臟

2.2 線紋海馬卵巢的發(fā)育和分化過程

為了追蹤線紋海馬卵巢的發(fā)育，對出生后不同體長的雌性線紋海馬進行橫切，通過H.E染色觀察卵巢的發(fā)育．當(dāng)線紋海馬體長為17 mm時，原始性腺開始分化，由圓形變成梨形，在其內(nèi)部邊緣處出現(xiàn)卵巢腔(卵巢腔的出現(xiàn)標(biāo)志著性腺開始向卵巢分化)，同時卵巢腔附近還有成簇的細(xì)胞群(圖2a).

當(dāng)線紋海馬體長為20 mm時，在性腺中觀察到初級卵母細(xì)胞(圖2b)．該時期的卵巢為Ⅱ期卵巢，其中有不同時相的卵母細(xì)胞，以Ⅰ、Ⅱ時相卵母細(xì)胞為主．

當(dāng)線紋海馬體長為40 mm時，在體視鏡下可以分離出卵巢組織并進行石蠟切片和染色，發(fā)現(xiàn)卵巢中存在成熟的卵母細(xì)胞，其核仁消失，胞質(zhì)中的卵黃顆粒逐漸融合(圖2c)．同時在卵巢組織外觀上橙色卵粒清晰可見(圖2d)，標(biāo)志卵巢已經(jīng)發(fā)育成熟．

(a)卵巢發(fā)育初期；(b)Ⅱ期卵巢；(c)Ⅴ期卵巢；(d)成熟卵巢 G：腸；KND：腎； M：肌肉組織； OC：卵巢腔；PO：初級卵母細(xì)胞；OV：卵巢；P：腹膜；SO：次級卵母細(xì)胞；標(biāo)尺為50 μm

2.3 線紋海馬精巢發(fā)育和分化過程

為了追蹤線紋海馬精巢的發(fā)育，對出生后不同體長的雄性線紋海馬進行橫切，通過對切片進行H.E染色觀察精巢的發(fā)育．當(dāng)線紋海馬體長為22 mm時，在切片中可以觀察到精小葉(圖3a)．精小葉的出現(xiàn)標(biāo)志著在這個時期原始性腺開始向精巢分化，因此該時期為精巢的發(fā)育初期．

當(dāng)線紋海馬體長為25 mm時，發(fā)育初期的精巢開始發(fā)育成為未成熟的精巢組織．從切片中可以看到，精巢外側(cè)的體細(xì)胞數(shù)量開始增多，精母細(xì)胞聚集成團并在精小囊中生長發(fā)育(圖3b)．

當(dāng)線紋海馬體長為45 mm時，雄性海馬的育兒袋已經(jīng)開始突起，精巢在形態(tài)外觀上已經(jīng)可以識別．通過對精巢的切片和H.E染色，可發(fā)現(xiàn)在精巢的白膜內(nèi)側(cè)的空腔中存在許多精子細(xì)胞和精子(圖3c)．同時在體視顯微鏡下可觀察到精巢，其形狀呈柱狀，表面覆有一層漿膜，內(nèi)部則有乳白色物質(zhì)(圖3d)

(a)精巢發(fā)育初期；(b) Ⅲ期精巢；(c)Ⅴ期精巢；(d)成熟精巢 N：脊索；KDN：腎；G：腸；SG：精原細(xì)胞；SL：精小葉；SC：謝爾托立氏細(xì)胞；PS：初級精母細(xì)胞；TA：白膜；SP：精子；ST：精子細(xì)胞；T：精巢；標(biāo)尺為50 μm

通過觀察不同體長雌性和雄性的線紋海馬的性腺發(fā)育情況，總結(jié)不同體長下線紋海馬的性腺發(fā)育特征，如表1所示．

表1 線紋海馬不同體長的性腺發(fā)育特征

3 討論

前人對海馬精巢和卵巢的形態(tài)特征已有所研究．左鎮(zhèn)生等[18]對日本海馬(Hippocampusmohnikei)的卵巢發(fā)育做了初步的探究，并且較詳細(xì)地闡述了日本海馬卵巢的形態(tài)特征；Selman等[7]對線紋海馬的卵巢進行了探索，描述了線紋海馬卵巢的基本結(jié)構(gòu)，對卵巢進行了初步的發(fā)育學(xué)分析；秦耿[8]對美國線紋海馬的性腺結(jié)構(gòu)及生殖細(xì)胞的形成機制進行了研究； Novelli等[19]研究了吻海馬(Hippocampusreidi)卵巢的形成時期，并且描述了卵巢中不同時相的卵母細(xì)胞的形態(tài)特征；除此之外，Piras等[20]運用透射電鏡對長吻海馬(Hippocampusguttulatus)的成熟精子進行超微結(jié)構(gòu)觀察．

生殖細(xì)胞方面的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)了許多有關(guān)生殖細(xì)胞的標(biāo)記基因，其中包括vasa、dazl、boule和dnd[14]．VASA已被廣泛應(yīng)用于魚類胚胎發(fā)生過程中PGCs遷移的種系標(biāo)記，其中包括斑馬魚(Daniorerio)[21]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[22]、青鳉(Oryziaslatipes)[23]和美洲鰣(Alosasapidissima)[16]．本研究利用vasa在配子形成過程中僅在生殖細(xì)胞中表達的特點[24]，對PGCs進行定位，找到線紋海馬生殖嵴的位置，從而確定其性腺發(fā)育的位置．

本研究從組織學(xué)上對線紋海馬早期性腺發(fā)育規(guī)律進行了探索．結(jié)果表明，在線紋海馬胚胎發(fā)育早期，原始生殖細(xì)胞與體細(xì)胞分離，隨后遷移至生殖嵴中，形成原始性腺．原始性腺形成后，其周圍的體細(xì)胞進入增長期，進行大量的增殖與生長，但沒有明顯的精巢和卵巢的分化特征．經(jīng)過一段時間的生長發(fā)育，原始性腺將在組織解剖學(xué)和細(xì)胞學(xué)上發(fā)生變化，出現(xiàn)明顯的精巢或卵巢的分化特征．

魚類性腺發(fā)育的相關(guān)研究通常把卵巢腔的形成作為魚類卵巢開始發(fā)育的標(biāo)志，而把生精小管或精小葉的形成作為精巢開始發(fā)育的標(biāo)志．本研究發(fā)現(xiàn)在線紋海馬體長為17 mm時，原始性腺分化，出現(xiàn)卵巢腔，隨后繼續(xù)發(fā)育形成成熟的卵巢．但在同一時期的線紋海馬中并沒有發(fā)現(xiàn)向著精巢分化的明顯特征．而在體長為22 mm的線紋海馬中發(fā)現(xiàn)了精小葉，因此在線紋海馬早期性腺發(fā)育的過程中，卵巢的發(fā)育早于精巢．據(jù)相關(guān)研究報道，在雌雄異體的硬骨魚中，多數(shù)是雌性的性腺發(fā)育早于雄性，例如布氏羅非魚(Tilapiabuttikoferi)、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevisgunther)等[25-26]．

切片觀察發(fā)現(xiàn)在線紋海馬的卵巢中存在不同時相的卵母細(xì)胞，可見線紋海馬的卵巢發(fā)育屬于不同步成熟型．Novelli等[19]對吻海馬的研究也有相同的發(fā)現(xiàn)，這一發(fā)現(xiàn)與海馬一年多次產(chǎn)卵的習(xí)性相符．在雄性線紋海馬的切片中發(fā)現(xiàn)了精小葉，由此可以確定線紋海馬的精巢屬于小葉型．隨著線紋海馬的生長發(fā)育，精巢內(nèi)出現(xiàn)空腔，當(dāng)精巢處于成熟階段時，精子細(xì)胞和精子向空腔中心移動．

本實驗對線紋海馬早期性腺發(fā)育進行了初步探究，為線紋海馬性腺發(fā)育的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)，并為海馬苗種的繁育提供理論指導(dǎo)．