BAY 60-6583對MK-801介導(dǎo)小鼠腦髓鞘損傷的保護(hù)作用

王聃，李金霞，孫金萍，劉娟，馬全瑞

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，銀川 750004）

精神分裂癥（schizophrenia，SCZ）是一種相對常見的，受環(huán)境和遺傳等多種因素影響的復(fù)雜神經(jīng)精神疾病，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率約為1%，其臨床癥狀包括陽性癥狀（妄想、幻覺、行為異常等）、陰性癥狀（抑郁、焦慮、失語癥等）以及認(rèn)知障礙（注意力缺陷、學(xué)習(xí)記憶能力受損等）[1]。現(xiàn)階段主要的治療手段是應(yīng)用抗精神病藥物，其可有效緩解陽性癥狀和減少復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，但對陰性癥狀的臨床療效有限[2]。SCZ的復(fù)雜性之一是其發(fā)病機(jī)制尚未明確，缺乏具有臨床診斷價(jià)值的病理學(xué)或生物學(xué)標(biāo)記物。截至目前，相關(guān)研究表明多種多樣的影響因素對疾病的發(fā)生發(fā)展起到關(guān)鍵作用，主要有以下假說：環(huán)境因素、遺傳基因、神經(jīng)遞質(zhì)異常學(xué)說、神經(jīng)發(fā)生異常學(xué)說[3-4]。其中神經(jīng)發(fā)生異常學(xué)說中髓鞘異常假說認(rèn)為脫髓鞘和髓鞘再生障礙是SCZ重要的發(fā)病機(jī)制，近年來備受關(guān)注。已有研究證實(shí)SCZ患者大腦額葉及穹窿存在脫髓鞘改變[5]。尸檢報(bào)道顯示，SCZ患者少突膠質(zhì)細(xì)胞（oligodendrocytes，OLs）數(shù)量和相關(guān)蛋白表達(dá)顯著降低，發(fā)育、髓鞘化過程受損[6-7]。在動物模型的研究中，Xiu等[8]也報(bào)道SCZ模型小鼠胼胝體髓鞘丟失的現(xiàn)象。髓鞘異常與SCZ的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，對髓鞘的保護(hù)已成為SCZ新的治療靶點(diǎn)[9]。

腺苷受體A2B（adenosine receptor A2B，A2-BAR）是腺苷受體四種亞型（A1AR、A2AAR、A2BAR、A3AR）之一，在生理狀態(tài)下，A2BAR與腺苷的親和力較低，故長期以來被認(rèn)為發(fā)揮作用極小[10]，近年來有研究[11-13]表明，A2BAR選擇性激動劑BAY 60-6583在心肌再灌注損傷、腦缺血以及咪達(dá)唑侖誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙中發(fā)揮積極的治療作用，課題組前期研究[14]證明，A2BAR在低氧所誘導(dǎo)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）分化過程中發(fā)揮著重要作用，但是否在SCZ中發(fā)揮髓鞘保護(hù)作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)參照課題組前期研究方法[15]，選擇腹腔注射N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）非競爭性抑制劑地卓西平馬來酸鹽（dizocilpine maleate，MK-801）制備SCZ模型，以此來探討A2BAR選擇性激動劑BAY 60-6583在SCZ模型中對髓鞘的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取6周齡SPF級別ICR雄性小鼠36只，體質(zhì)量18～22 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供［質(zhì)量檢測單位：陜西省實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量監(jiān)督檢測中心；許可證號：SCXK（寧）2020-0001］，該實(shí)驗(yàn)經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理審查委員會批準(zhǔn)（2018-006），所有動物自由飲水進(jìn)食，鼠房環(huán)境溫度為（22±1）℃，光照/黑暗周期為12 h。

1.1.2 主要試劑及材料MK-801購自Sigma-Aldrich公司，A2BAR選擇性激動劑BAY 60-6583購自Tocris Bioscience公司，小鼠抗少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2（olineage transcription factor 2，Olig2）抗體、大鼠抗髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）抗體購自Abcam公司，兔抗Ki67抗體購自萬類生物科技有限公司，小鼠抗Tubulin抗體購自愛博泰克生物科技有限公司，動物行為學(xué)記錄分析系統(tǒng)購自Panlab公司，H7650型透射式電子顯微鏡為日本HITACHI公司產(chǎn)品。

1.1.3 MK-801介導(dǎo)SCZ模型小鼠的制備與分組 小鼠連續(xù)腹腔注射MK-801［0.6 mg·（kg·d）-1］14 d以制備SCZ模型。將36只小鼠隨機(jī)分為3組，分別為對照組（Control組）、模型組（MK-801組）、模型+BAY 60-6583組（MK-801+BAY組），每組12只小鼠，對照組給予相同體積的生理鹽水處理，在制備模型的7 d后隔天腹腔注射A2BAR激動劑BAY 60-6583［80 μg·（kg·d）-1］。

1.2 方法

1.2.1 曠場實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)在安靜密閉的環(huán)境中進(jìn)行，抓住小鼠尾部三分之一的位置，輕輕放入曠場實(shí)驗(yàn)箱的中央，同時進(jìn)行攝像和計(jì)時，計(jì)時5 min，記錄小鼠在中央?yún)^(qū)域和邊緣區(qū)域停留的時間、總移動距離。中央?yún)^(qū)域停留時間越長、邊緣區(qū)域停留時間越短、總移動距離越遠(yuǎn)，反映小鼠焦慮程度越輕，反之，則反映小鼠焦慮程度越重。計(jì)時結(jié)束后將小鼠取出。每只小鼠實(shí)驗(yàn)后，用70%乙醇擦拭曠場箱內(nèi)壁和底面，避免前一只小鼠余留的信息（如大小便、氣味）影響后一只小鼠。

1.2.2 懸尾實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)應(yīng)在安靜密閉的環(huán)境中進(jìn)行，將小鼠尾尖用膠帶固定，懸掛于支架上，頭部距離臺面15 cm，進(jìn)行攝像和計(jì)時，計(jì)時5 min，記錄處于該環(huán)境中小鼠靜止不動時間。不動時間越長反映其抑郁狀態(tài)越嚴(yán)重。

1.2.3 堅(jiān)牢藍(lán)（luxol fast blue，LFB）染色 小鼠麻醉后用4%多聚甲醛灌注固定；取腦后用4%多聚甲醛繼續(xù)后固定12 h，流水沖12 h。將腦組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，切片厚度為5 μm。將載有腦組織切片的載玻片脫蠟、復(fù)水下行至95%乙醇，然后切片轉(zhuǎn)入LFB染色液，在37℃溫箱染色過夜。次日將切片放入95%乙醇洗去多余染色液，自來水沖洗5 min后放入luxol分化液分色15 s，隨后放入70%乙醇分色30 s。自來水沖洗5 min后，常規(guī)脫水、透明，中性樹脂封片。光鏡下觀察各組切片胼胝體相近區(qū)域髓鞘著色情況。

1.2.4 透射電子顯微鏡 將灌注取出的腦組織放在2%戊二醛溶液4℃固定2 h，隨后每2 h更換0.1 mol·L-1二鉀砷酸鈉緩沖液，共3次；次日4℃條件下1%鋨酸溶液浸泡2 h，0.1 mol·L-1二鉀砷酸鈉緩沖液浸洗2次，15 min/次；梯度乙醇脫水后環(huán)氧丙烷滲透，15 min/次，共2次；1∶1滲透液（不完全包埋液∶環(huán)氧丙烷=1∶1）滲透1 h；2∶1滲透液（不完全包埋液∶環(huán)氧丙烷=2∶1）滲透1 h；不完全包埋液滲透過夜；于35℃溫箱完全包埋液浸泡6 h后轉(zhuǎn)移至包埋板，42℃溫箱過夜后于60℃溫箱干燥48 h。完成組織包埋后修塊、切片定位，在各組小鼠胼胝體相近區(qū)域內(nèi)隨機(jī)選取視野進(jìn)行拍照，觀察髓鞘超微結(jié)構(gòu)。

1.2.5 Western blot將新鮮的腦皮層組織稱重，用全蛋白提取試劑提取出蛋白上清液，測定蛋白濃度，制作蛋白上樣緩沖液，設(shè)定其濃度為7 μg·μL-1，置于-20℃冰箱中保存。配制10%SDS-PAGE凝膠，上樣后用150 V電壓電泳，根據(jù)條帶及蛋白分子質(zhì)量的大小選擇合適的聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，在低溫環(huán)境下（4℃）用0.2 A恒流轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后使用加入Tween-20的Tris鹽緩沖液（Tris Buffered Saline with Tween-20，TBST）稀釋的5%脫脂牛奶封閉非特異性抗原2 h。然后棄掉封閉液并加入一抗（大鼠抗MBP 1∶1 000），置于搖床上，在4℃冰箱過夜。第2天在室溫條件下復(fù)溫1 h后棄去一抗，TBST刷洗3遍；加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗（山羊抗大鼠IgG 1∶5 000），室溫孵育1 h；TBST刷洗3遍后加入發(fā)光液A液、B液（1∶1），上機(jī)曝光。用Image J軟件分別測量并計(jì)算對應(yīng)的目的蛋白和內(nèi)參蛋白的灰度值比值，采用正常對照組灰度值比值均一化處理各組灰度值比值，每個樣本至少重復(fù)3遍。

1.2.6 免疫熒光染色 將腦組織石蠟切片放置于65℃烘箱加熱1 h，用二甲苯脫蠟后，用梯度乙醇水化；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3遍，每遍3 min；0.01 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液高壓抗原修復(fù)10 min，待恢復(fù)至室溫后，PBS漂洗3遍，每遍3 min；在37℃恒溫箱中用山羊血清封閉30 min后棄血清，并滴加相應(yīng)一抗（小鼠抗Olig2 1∶100；兔抗Ki67 1∶100），4℃冰箱過夜孵育。第2天室溫繼續(xù)孵育1 h后，PBS漂洗3遍，每遍3 min；于避光環(huán)境下滴加熒光二抗混合液山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG（稀釋比例均為1：300）孵育1 h；PBS漂洗3遍，每遍3 min；隨后用4＇，6-二脒基-2-苯基吲哚（4＇，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）于避光環(huán)境下封片。熒光顯微鏡下，在每組樣本的胼胝體相近區(qū)域選取3個20倍物鏡視野觀察并拍照計(jì)數(shù)。比較各組胼胝體3個20倍物鏡視野內(nèi)雙標(biāo)陽性細(xì)胞平均數(shù)的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），GraphPad Prism 8作圖。數(shù)據(jù)以均數(shù)±均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤（x±SEM）表示，所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布及方差齊性，多組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腹腔注射BAY 60-6583改善SCZ模型小鼠焦慮、抑郁樣行為異常

曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MK-801組小鼠相較Control組，邊緣區(qū)域停留時間延長（P＜0.05），中央?yún)^(qū)域停留時間縮短（P＜0.05），總移動距離變短（P＜0.05）；MK-801+BAY組小鼠較MK-801組曠場邊緣區(qū)域停留時間縮短（P＜0.05），中央?yún)^(qū)域停留時間延長（P＜0.05），總移動距離延長（P＜0.05），見圖1。

懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MK-801組小鼠與Control組相比，不動時間延長（P＜0.05），MK-801+BAY組小鼠與MK-801組相比，不動時間縮短（P＜0.05），見圖1。

圖1 腹腔注射BAY 60-6583后SCZ小鼠焦慮、抑郁樣行為的改變

2.2 腹腔注射BAY 60-6583后SCZ模型小鼠損傷髓鞘的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)明顯改善

LFB屬于銅－酞菁染料，在乙醇溶液中具有與髓鞘磷脂結(jié)合的染色特性，屬于脂溶性染料浸染法中常用且可靠的髓鞘染色方法。LFB染色結(jié)果顯示，Control組顯示出致密的深藍(lán)色絲狀物，在胼胝體內(nèi)延伸；與Control組相比，MK-801組髓鞘著色少而淺，胼胝體內(nèi)大面積呈淺藍(lán)色；在MK-801+BAY組中，髓鞘較MK-801組著色明顯變深，淺藍(lán)色面積明顯減少，見圖2。

透射電鏡觀察髓鞘超微結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，Control組內(nèi)髓鞘板層結(jié)構(gòu)致密完整，無局灶性溶解和水腫等病理變化；與Control組相比，MK-801組小鼠腦髓鞘正常紋理不清，結(jié)構(gòu)紊亂變形，板層結(jié)構(gòu)松散，出現(xiàn)局灶性溶解，呈空泡或空網(wǎng)狀改變，甚至增生呈乳頭狀或球狀突向軸漿；在MK-801+BAY組中，髓鞘局灶性溶解的情況明顯改善，板層清晰，結(jié)構(gòu)致密，形態(tài)完整，見圖2。

圖2 腹腔注射BAY 60-6583后SCZ小鼠損傷髓鞘的形態(tài)學(xué)改變

2.3 腹腔注射BAY 60-6583可上調(diào)SCZ模型小鼠髓鞘堿性蛋白MBP的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，相比Control組，MK-801組小鼠MBP的相對表達(dá)量降低（P＜0.05）；與MK-801組相比，MK-801+BAY組MBP的相對表達(dá)量升高（P＜0.05），見圖3。

圖3 腹腔注射BAY 60-6583對SCZ小鼠髓鞘堿性蛋白MBP表達(dá)的影響

2.4 腹腔注射BAY 60-6583可促進(jìn)SCZ模型小鼠少突膠質(zhì)譜系細(xì)胞的增殖

各組小鼠胼胝體區(qū)域的熒光結(jié)果顯示，與Control組相比，MK-801組小鼠Ki67+/Olig2+細(xì)胞數(shù)量減少（P＜0.05）。在BAY 60-6583干預(yù)后，MK-801+BAY組較MK-801組小鼠Ki67+/Olig2+細(xì)胞數(shù)量增加（P＜0.05），見圖4。

圖4 BAY 60-6583對SCZ模型小鼠少突膠質(zhì)譜系細(xì)胞增殖的影響

3 討論

SCZ的動物模型按其誘導(dǎo)策略主要分為藥物誘導(dǎo)模型、發(fā)育動物模型、轉(zhuǎn)基因動物模型[16]。近年來由于谷氨酸鹽失調(diào)假說引起了廣泛關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)，給動物注射N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體拮抗劑可引起SCZ樣行為表現(xiàn)，其中代表性藥物MK-801不僅可以同時模擬SCZ的陽、陰性癥狀，還能誘導(dǎo)出類似SCZ樣病理學(xué)變化，如OLs損傷、髓鞘脫失等[17-18]，因此MK-801已被廣泛應(yīng)用于SCZ動物模型的建立。在本實(shí)驗(yàn)中通過對MK-801誘導(dǎo)SCZ模型小鼠腹腔注射A2BAR激動劑BAY 60-6583，探究其對SCZ腦髓鞘損傷的保護(hù)作用。

實(shí)驗(yàn)過程中，觀察到MK-801介導(dǎo)的SCZ小鼠會表現(xiàn)出運(yùn)動過度、共濟(jì)失調(diào)、刻板行為以及自發(fā)活動增加，這種行為改變可能與MK-801通過阻斷NMDA受體激活抑制性紋狀體γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能投射神經(jīng)元，間接激活黑質(zhì)紋狀體多巴胺（dopamine，DA）系統(tǒng)有關(guān)[19]。同時在曠場實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)中觀察到SCZ模型小鼠表現(xiàn)出明顯的焦慮和抑郁樣行為改變，與此前研究報(bào)道相一致[20-21]。而SCZ小鼠予以BAY 60-6583治療后其焦慮和抑郁樣行為明顯改善。髓鞘異常與SCZ的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，前期研究發(fā)現(xiàn)雙環(huán)己酮草酰二腙誘導(dǎo)小鼠脫髓鞘后可出現(xiàn)明顯的焦慮和抑郁樣行為，促進(jìn)髓鞘的修復(fù)可改善其行為異常[22]。同時，抑郁動物模型中同樣出現(xiàn)嚴(yán)重的脫髓鞘病變[23]，促進(jìn)髓鞘修復(fù)進(jìn)程能明顯改善抑郁和焦慮癥狀[24]。髓鞘是OLs包繞軸突形成的同心圓結(jié)構(gòu)，不僅能為神經(jīng)元軸突提供絕緣層，保證快速、高效地傳遞神經(jīng)沖動，還能支持軸突的能量代謝[25]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)SCZ模型小鼠胼胝體區(qū)域LFB髓鞘著色呈淺藍(lán)色；超微結(jié)構(gòu)顯示髓鞘板層結(jié)構(gòu)松散，出現(xiàn)局灶性溶解甚至形成乳頭狀突向軸漿，提示SCZ小鼠腦內(nèi)存在明顯的髓鞘損傷改變，與先前的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[8]。SCZ模型小鼠腹腔注射BAY 60-6583處理后，髓鞘LFB染色呈較致密的深藍(lán)色絲狀物，電鏡下髓鞘呈現(xiàn)致密的板層結(jié)構(gòu)，局灶性溶解的情況明顯好轉(zhuǎn)，損傷趨于恢復(fù)。MBP是形成致密髓鞘所必需的結(jié)構(gòu)蛋白，約占髓鞘總蛋白的30%，是髓鞘的整體骨架成分，常作為髓鞘特異性標(biāo)記物被廣泛應(yīng)用于判斷髓鞘的破壞程度[26]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證BAY 60-6583對SCZ模型小鼠腦髓鞘的保護(hù)作用，本研究檢測了MBP蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示腹腔注射BAY 60-6583能顯著逆轉(zhuǎn)SCZ小鼠中降低的MBP蛋白表達(dá)水平，提示對髓鞘具有保護(hù)作用。綜上所述，本文認(rèn)為腹腔注射BAY 60-6583對SCZ模型小鼠腦髓鞘損傷具有一定的保護(hù)作用。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，髓鞘由OPCs分化而來的成熟OLs突起包繞軸突形成。哺乳類動物腦內(nèi)髓鞘始終處于一種動態(tài)調(diào)節(jié)過程[27-28]，由OPCs和OLs組成的少突膠質(zhì)譜系細(xì)胞數(shù)量的減少是髓鞘修復(fù)失敗的主要原因。據(jù)報(bào)道，所有的少突膠質(zhì)譜系細(xì)胞，無論成熟狀態(tài)如何，都表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Olig2[29]，Ki67是一種存在于細(xì)胞周期活性階段的蛋白，Olig2和Ki67的雙染陽性細(xì)胞可以識別出增殖的少突膠質(zhì)譜系細(xì)胞[30]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SCZ模型小鼠腦內(nèi)Ki67+/Olig2+的細(xì)胞數(shù)明顯減少，而予以BAY 60-6583治療可明顯提高Ki67+/Olig2+細(xì)胞數(shù)量，說明A2BAR激動劑BAY 60-6583可促進(jìn)SCZ模型小鼠腦少突膠質(zhì)譜系細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期活性階段。此前有研究證明SCZ患者腦組織內(nèi)少突膠質(zhì)譜系細(xì)胞數(shù)量顯著減少[6]，少突膠質(zhì)譜系細(xì)胞的增殖會縮小病變范圍，是脫髓鞘疾病的治療關(guān)鍵[30-31]，且增強(qiáng)內(nèi)源性髓鞘再生以恢復(fù)神經(jīng)傳導(dǎo)并防止神經(jīng)變性被認(rèn)為是治療脫髓鞘類型疾病的重要策略之一[32]。

綜上所述，本研究證明A2BAR激動劑BAY 60-6583可改善SCZ焦慮和抑郁樣行為，并對腦髓鞘損傷具有一定的保護(hù)作用，猜測這種保護(hù)作用可能與其通過促進(jìn)腦少突膠質(zhì)譜系細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期活性階段相關(guān)聯(lián)，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將繼續(xù)探討相關(guān)機(jī)制。