利用細(xì)菌表面展示技術(shù)強(qiáng)化細(xì)胞固定化生產(chǎn)吲哚-3-乙酸

蘇 愉，劉晴浩，包心茹，黃建忠，祁 峰*

(1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院工業(yè)微生物發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心， 福建 福州 350117; 2.福建師范大學(xué)細(xì)胞逆境響應(yīng)與代謝調(diào)控福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350108)

固定化細(xì)胞是指固定在水不溶性載體上，在特定的空間限度內(nèi)完成生命活動(dòng)的細(xì)胞[1-2]。由于固定化細(xì)胞能實(shí)現(xiàn)正常的生長(zhǎng)、增殖和代謝，所以又稱固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。和游離細(xì)胞培養(yǎng)相比，固定化細(xì)胞可以容易地從反應(yīng)介質(zhì)中去除，減少細(xì)胞在介質(zhì)中的損失，可以具有高熱穩(wěn)定性，對(duì)pH變化和有機(jī)溶劑的耐受性，細(xì)胞可反復(fù)使用、能實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作等優(yōu)點(diǎn)[3]。目前，固定細(xì)胞的方法根據(jù)細(xì)胞固定原理的不同，主要分為五類：吸附、離子結(jié)合、共價(jià)結(jié)合、包埋和交聯(lián)[4-5]。生物炭是一種含炭量較為豐富的成本低廉的材料,通常由各種廢棄生物質(zhì)在高溫高壓條件下熱解制作而成，其具有相對(duì)較大的比表面積、高孔隙率、較好的穩(wěn)定性和豐富的官能團(tuán)[6]，生物炭能為細(xì)菌提供一個(gè)穩(wěn)定的環(huán)境，使細(xì)菌免受外界環(huán)境的傷害，因此生物炭是適合細(xì)菌固定的優(yōu)良載體[7]。已知生物炭的吸附能力與表面積、孔徑分布、表面官能團(tuán)、陽離子交換能力等理化性質(zhì)直接相關(guān)[8]。據(jù)報(bào)道大多數(shù)未改性的生物炭表面都帶有負(fù)電荷[9]，對(duì)生物炭進(jìn)行改性可以增加表面正電荷，從而吸附帶負(fù)電的物質(zhì)，提高吸附能力，Zhang等[10]用NaOH改性山桃木生物炭，改性后提高了吸附金屬離子的能力。Liu等[11]用十六烷基三甲基溴化銨改性稻殼生物炭吸附2,4-二氯苯酚，改性生物炭和未改性生物炭的最大吸附量分別為59.81、20.89 mg·g-1，表明改性生物炭的吸附量顯著高于未改性生物炭。

細(xì)菌表面展示(Bacterial SurfaceDisplay)，是將目標(biāo)蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)并錨定細(xì)菌表面的一種重要技術(shù)[12]，主要通過DNA重組把外源功能蛋白的編碼基因(Coding Gene)與宿主細(xì)菌的錨定域(Anchoring Domain)編碼基因融合，融合蛋白可以在錨定基序引導(dǎo)下，在宿主細(xì)菌中表達(dá)、分泌并錨定在細(xì)胞膜上，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌表面展示，蛋白可以維持原有的構(gòu)象和生物學(xué)功能，具備生物誘導(dǎo)催化的活性[13]。Wee等[14]利用鳳梨歐氏桿菌的冰晶核蛋白INaA,成功地將木聚糖酶展示在E.coli細(xì)胞表面。Zhang等[15]利用源于丁香假單胞菌的冰晶核蛋白INaK將MalE和TorA信號(hào)肽以及3個(gè)帶電多肽6×Lys、6×Glu和6×Asp錨定在INaK-N的N端，以提高對(duì)人精氨酸酶1(ARG1)的表面顯示效率。

大多數(shù)細(xì)菌表面含有磷酸基和羧基，在水溶液中會(huì)因?yàn)榧?xì)胞膜表面基團(tuán)電離而帶負(fù)電，因此細(xì)菌在水溶液中會(huì)顯負(fù)電性[16]。本研究利用細(xì)菌表面展示技術(shù)，以冰晶核蛋白INaA(來源于鳳梨歐氏桿菌Erwiniaananas)、INaK(來源于丁香假單胞菌pseudomonassyringae)為錨定蛋白，將能夠攜帶負(fù)電荷的氨基酸(例如谷氨酸、天冬氨酸)錨定在E.coli表面，增加E.coli細(xì)胞膜表面攜帶的負(fù)電荷，以強(qiáng)化重組E.coli細(xì)胞與改性生物炭的吸附作用。

吲哚-3-乙酸(IAA)是生長(zhǎng)素中最常見的激素，它調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的各個(gè)方面，在植物的生理學(xué)中起關(guān)鍵作用，參與細(xì)胞分裂、伸長(zhǎng)、分化、果實(shí)發(fā)育和向光性反應(yīng)[17]，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)。本實(shí)驗(yàn)室已開發(fā)了1株高產(chǎn)IAA的E.coli菌株，利用此策略將其表達(dá)有冰晶核蛋白和負(fù)電荷氨基酸融合蛋白的質(zhì)粒導(dǎo)入IAA高產(chǎn)菌株，用FeCl3改性玉米秸稈生物炭，使表面呈正電性，利用靜電吸附原理，強(qiáng)化細(xì)胞與生物炭之間的吸附能力，能夠延長(zhǎng)生命周期，使其在全細(xì)胞催化中具有更大的潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒 本研究中大腸桿菌E.coliTOP 10用于構(gòu)建質(zhì)粒，菌株E.coliMG1655為全細(xì)胞催化反應(yīng)產(chǎn)IAA的工程菌株。質(zhì)粒pRB1K用于載體的構(gòu)建，合成的基因均來自通用生物有限公司。玉米秸稈生物炭(BC)購買自河南立澤環(huán)?？萍加邢薰?。本研究所用的菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 菌株和質(zhì)粒

1.1.2試劑和儀器 氨芐和卡那青霉素均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純；2×Phanta MaX Master Mix聚合酶購自Vazyme公司；Gibson Assembly無縫連接酶購自NEB公司；Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)，配置Waters2998紫外檢測(cè)器。

1.1.3培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 LB培養(yǎng)基、酵母提取粉0.5%(W/V)、蛋白胨1%(W/V)、氯化鈉1%(W/V)用于培養(yǎng)大腸桿菌,37℃、220 r·min-1搖床培養(yǎng)。2 g·L-1的色氨酸用于大腸桿菌的全細(xì)胞催化，Tris/HCL緩沖液(pH=7.5)。質(zhì)粒pRB1K的抗性為卡那霉素，卡那霉素終濃度50 μg·L-1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1質(zhì)粒的構(gòu)建 (1)來源于鳳梨歐氏桿菌Erwiniaananas的冰晶核蛋白INaA為瞄定蛋白。pRB1K-INaA-EGFP、pRB1K-INaA-9NCAs-EGFP和pRB1K-INaA-45NCAs-EGFP載體的構(gòu)建：采用GibsonAssembly連接技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒。設(shè)計(jì)引物，通過引物INaA-45NCAs-EGFP-F、INaA-45NCAs-EGFP-R擴(kuò)增出帶有同源片段及RBS序列的冰晶核和帶45個(gè)負(fù)電荷氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)的融合蛋白基因INaA-45NCAs-EGFP，再通過設(shè)計(jì)引物V-INaA-45NCAs-EGFP-F和V-INaA-45NCAs-EGFP(以載體pRB1K-EGFP為模板)擴(kuò)增出含有對(duì)應(yīng)骨架同源的片段V-INaA-45NCAs-EGFP，將片段和骨架片段混合,通過GibsonAssembly技術(shù)，得到pRB1K-INaA-45NCAs-EGFP質(zhì)粒。設(shè)計(jì)引物，通過引物INaA-EGFP-F、INaA-EGFP-R(以pRB1K-INaA-45NCAs-EGFP質(zhì)粒為模板)擴(kuò)增出帶有同源片段及RBS序列的冰晶核蛋白基因INaA-EGFP，再通過設(shè)計(jì)引物V-INaA-EGFP-F、V-INaA-EGFP-R(以pRB1K-INaA-45NCAs-EGFP質(zhì)粒為模板)擴(kuò)增出含有對(duì)應(yīng)骨架同源的片段V-INaA-EGFP，將片段和骨架片段混合,通過GibsonAssembly技術(shù)，得到pRB1K-INaA-EGFP質(zhì)粒。設(shè)計(jì)引物，通過引物INaA-9NCAs-EGFP-F、INaA-9NCAs-EGFP-R(以pRB1K-INaA-45NCAs-EGFP質(zhì)粒為模板)擴(kuò)增出帶有同源片段及RBS序列的冰晶核和帶有9個(gè)負(fù)電荷氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)的融合蛋白基因INaA-9NCAs-EGF，再通過設(shè)計(jì)引物V-INaA-9NCAs-EGFP-F、V-INaA-9NCAs-EGFP-R(以pRB1K-INaA-45NCAs-EGFP質(zhì)粒為模板)擴(kuò)增出含有對(duì)應(yīng)骨架同源的片段V-INaA-9NCAs-EGFP，將片段和骨架片段混合,通過GibsonAssembly 技術(shù)，得到pRB1K-INaA-9NCAs-EGFP質(zhì)粒。(2)來源于丁香假單胞菌(pseudomonassyringae)的冰晶核蛋白INaK為瞄定蛋白。pRB1K-INaK-EGFP、pRB1K-INaK-9NCAs-EGFP和pRB1K-INaK-45NCAs-EGFP載體的構(gòu)建：采用Gibson連接技術(shù)重組質(zhì)粒。設(shè)計(jì)引物，通過引物INaK-45NCAs-EGFP-F、INaK-45NCAs-EGFP-R擴(kuò)增出帶有同源片段及RBS序列的冰晶核和帶45個(gè)負(fù)電荷氨基酸的融合蛋白基因INaK-45NCAs-EGFP，再通過設(shè)計(jì)引物V-INaK-45NCAs-EGFP-F、V-INaK-45NCAs-EGFP(以載體pRB1K-EGFP為模板)擴(kuò)增出含有對(duì)應(yīng)骨架同源的片段V-INaK-45NCAs-EGFP，將片段和骨架片段混合,通過GibsonAssembly 技術(shù)，得到pRB1K-INaK-45NCAs-EG1FP質(zhì)粒。設(shè)計(jì)引物，通過引物INaK-EGFP-F、INaK-EGFP-R(以pRB1K-INaK-45NCAs-EGFP質(zhì)粒為模板)擴(kuò)增出帶有同源片段及RBS序列的冰晶核蛋白基因INaK-EGFP，再通過設(shè)計(jì)引物V-INaK-EGFP-F、V-INaK-EGFP-R(以pRB1K-INaK-45NCAs-EGFP質(zhì)粒為模板)擴(kuò)增出含有對(duì)應(yīng)骨架同源的片段V-INaK-EGFP，將片段和骨架片段混合,通過GibsonAssembly技術(shù)，得到pRB1K-INaK-EGFP質(zhì)粒。設(shè)計(jì)引物，通過引物INaK-9NCAs-EGFP-F、INaK-9NCAs-EGFP-R(以pRB1K-INaK-45NCAs-EGFP質(zhì)粒為模板)擴(kuò)增出帶有同源片段及RBS序列的冰晶核和帶有9個(gè)負(fù)電荷氨基酸融合蛋白基因INaK-9NCAs-EGFP，再通過設(shè)計(jì)引物V-INaK-9NCAs-EGFP-F、V-INaK-9NCAs-EGFP-R(以pRB1K-INaK-45NCAs-EGFP質(zhì)粒為模板)擴(kuò)增出同源片段的骨架V-INaK-9NCAs-EGFP，將片段和骨架片段混合,通過GibsonAssembly技術(shù)，得到pRB1K-INaK-9NCAs-EGFP質(zhì)粒。所有引物見表2。

表2 引物序列

1.2.2融合蛋白的表達(dá) 將重組質(zhì)粒pRB1K-INaA-EGFP、pRB1K-INaA-9NCAs-EGFP、pRB1K-INaA-45NCAs-EGFP、pRB1K-INaK-EGFP、pRB1K-INaK-9NCAs-EGFP和pRB1K-INaK-45NCAs-EGFP轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coliTOP 10感受態(tài)中。將片段與骨架按照3∶1的比例加入PCR管中，加入6 μL的GibsonAssembly連接酶(總共10 μL)，50℃孵育1 h。然后將連接產(chǎn)物加入到大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰上放置30 min。在42℃水浴鍋中熱擊90 s，放置于冰上 2 min后，加入650 μL的LB,在37℃、150 r·min-1的搖床中震蕩1 h復(fù)蘇。4 000 r·min-1，離心4 min，留上清100 μL，輕輕吹打混勻，最后將菌液均勻地涂抹在含有卡那青霉素的固體LB平板上，在37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。待第2 d挑長(zhǎng)出的單菌落做PCR驗(yàn)證，將驗(yàn)證成功的菌株抽提質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證。驗(yàn)證成功后將含有pRB1K-INaA-EGFP、pRB1K-INaA-9NCAs-EGFP、pRB1K-INaA-45NCAs-EGFP、pRB1K-INaK-EGFP、pRB1K-INaK-9NCAs-EGFP和pRB1K-INaK-45NCAs-EGFP質(zhì)粒的E.coliTOP10菌株首先劃線培養(yǎng)在含有卡那青霉素抗性和20%阿拉伯糖的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12～15 h，第2 d挑取單菌落加去離子水稀釋，并均勻涂在載玻片上，放置烘箱烘干后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，以大腸桿菌E.coliTOP10菌株作為陰性對(duì)照，確認(rèn)融合蛋白是否表達(dá)。

1.2.3生物炭的改性 取出BC各10 g,分裝于1 L的燒杯中，加入500 mL鹽酸(1 mol·L-1)浸泡24 h，然后將BC過濾、清洗并在烘箱中過夜干燥。將鹽酸處理過的BC分別浸泡在1 mol·L-1FeCl3、2 mol·L-1FeCl3溶液(固液比為1∶10)中并放入超聲波清洗機(jī)中，在30℃下分別進(jìn)行1 h。最后，將BC用去離子水清洗至pH值不變，過濾并在烘箱中過夜干燥。改性生物炭的粒徑分布在50目范圍內(nèi)。將BC用去離子水溶解，濃度為0.5、1、1.5、2 mg·L-1，改性完的BC按照FeCl3濃度標(biāo)記為BC1和BC2,采用英國馬爾文NANO ZS-ZEN3600 Zeta電位儀測(cè)定不同濃度下BC、BC1和BC2表面電性。

1.2.4吸附試驗(yàn) 將構(gòu)建好的菌株以1‰的接種量接種于含有Kan抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r·min-1培養(yǎng)1.5 h，其間每隔0.5 h測(cè)1次600 nm處的吸光值，待OD600達(dá)到0.5～0.6時(shí)，加入20%的阿拉伯糖2%，過夜培養(yǎng)。待第2 d再次測(cè)定600 nm處的吸光值，并收集菌體，用85%的生理食鹽水調(diào)整OD至1，取10 mL的菌液，并加入終濃度為2 mg·mL-1的生物炭，150 r·min-1震蕩24 h后用濾紙過濾除去未吸附的細(xì)胞。濾液測(cè)定600 nm處的吸光值，并用以下公式計(jì)算固定化率：

式中：OD0為吸附前用生理食鹽水調(diào)整OD至1；OD1為濾紙過濾除去未吸附的細(xì)胞，濾液測(cè)定600 nm處的吸光值。

1.2.5全細(xì)胞催化 全細(xì)胞催化：將含有pTrc99a-iaam-tac-ami1質(zhì)粒的MG1655菌株制作成感受態(tài)，將質(zhì)粒pEPA01、pEPA02、pEPA03、導(dǎo)入制作好的感受態(tài)中，待第2 d挑長(zhǎng)出的單菌落做PCR驗(yàn)證，將驗(yàn)證成功的菌株抽提質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證。將驗(yàn)證成功的菌株從-80℃冰箱中取出，用槍頭沾取菌液，在含有氨芐青霉素和卡那青霉素的固體LB平板上畫線，37℃過夜培養(yǎng)。挑取大小適中的單菌落接入含有氨芐青霉素和卡那青霉素的試管液體LB中，在37℃、220 r·min-1過夜搖床震蕩培養(yǎng)。以1%的接種量接入50 mL LB 中，加入氨芐抗性和卡那抗性，37℃、220 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)。當(dāng)OD600=0.5～0.6時(shí)，加入IPTG( 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)表達(dá)，終濃度為0.5 mg·L-1，并加入2 mg·mL-1的生物炭,然后放至30℃、220 r·min-1的恒溫振蕩器培養(yǎng) 15～20 h。用孔徑為20 μm的快速定性濾紙將菌液過濾，雙蒸水洗滌3次后過濾，除去未吸附的細(xì)胞,并將固定在生物炭的細(xì)胞用50 mL的緩沖液(Tris/HCL，pH=7.5)轉(zhuǎn)移到250 mL的三角瓶中,加入2 g·L-1的色氨酸，在 30℃、220 r·min-1搖床反應(yīng)，間隔12 h取樣檢測(cè)IAA 產(chǎn)量。

1.2.6搖瓶重復(fù)分批發(fā)酵 每批發(fā)酵結(jié)束后，5 000 r·min-1離心5 min,棄去上清液，沉淀用50 mL的Tris-HCL緩沖液重懸，轉(zhuǎn)移到三角瓶中并加入2 g·L-1的色氨酸后30℃、220 r·min-1繼續(xù)發(fā)酵，間隔12 h，取樣檢測(cè)IAA 產(chǎn)量，重復(fù)10次。

1.2.7HPLC檢測(cè)IAA產(chǎn)量 Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)，配置Waters2998紫外檢測(cè)器，色譜柱為月旭科技的XB-C18反向液相色譜柱。采用梯度洗脫分離樣品，流速1 mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm,柱溫40℃，運(yùn)行時(shí)間為23 min，流動(dòng)性為由蒸餾水(0.1%甲酸)(溶劑B)和甲醇(溶劑D)組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光顯微鏡結(jié)果

融合蛋白的N端帶有EGFP標(biāo)簽，本試驗(yàn)中用20%的阿拉伯糖誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)，取誘導(dǎo)12～15 h的重組菌處理后在熒光顯微鏡下觀察,錨定蛋白為INaA的菌株EPA01-1、EPA01-2、EPA01-3成功將融合蛋錨定在細(xì)胞膜上，發(fā)出綠色熒光；錨定蛋白為INaK的菌株未能將融合蛋白錨定在細(xì)胞膜上(圖1)。

注：AE.coli TOP10(對(duì)照)；B EPA01-3；C EPA01-2；D EPA01-3

2.2 Zeta電位儀分析改性生物炭電性結(jié)果

本研究中生物炭先用1 mol·L-1的鹽酸處理后，再用1 mol·L-1FeCl3、2 mol·L-1FeCl3改性，用去離子水清洗至pH穩(wěn)定后用Zeta電位儀測(cè)定不同濃度下的生物炭電性。由圖2可知,未改性生物炭呈負(fù)電性，1 mol·L-1的FeCl3改性后的生物炭在2 mg·mL-1的濃度下Zeta電位為3.14 mV，2 mol·mL-1的FeCl3改性后的生物炭在1.5、2 mg·mL-1的濃度下Zeta電位分別為0.84、8.33 mV，說明在此濃度下生物炭表面呈電正性(圖2)。

注：BR-1 1 mol·L-1 FeCl3改性生物炭;BR-2 2 mol·L-1 FeCl3改性生物炭

2.3 不同菌株吸附率測(cè)定結(jié)果

由上述結(jié)果得知，2 mol·L-1FeCl3改性的生物炭在2 mg·mL-1的濃度下表面正電荷較多，與重組菌株進(jìn)行吸附。由圖3可知，吸附率EPA03(59.45%)>EPA02(50.1%)>EPA01(48.25%)>EMP09(27.6%)，且重組菌株融合蛋白中表面攜帶負(fù)電荷氨基酸數(shù)量EPA03>EPA02>EPA01>EMP09。

注：EM09-BC2為空白對(duì)照

2.4 全細(xì)胞催化吲哚-3-乙酸和色氨酸HPLC檢測(cè)結(jié)果

由圖4可知，在以色氨酸為底物全細(xì)胞催化條件下，用改性生物炭吸附重組菌株，菌株EPA02、EPA01負(fù)載生物炭全細(xì)胞催化連續(xù)循環(huán)2次，第1次循環(huán)IAA產(chǎn)量在60 h達(dá)到最大，分別為1.256 g·L-1和1.29 g·L-1；第2次循環(huán)IAA產(chǎn)量在60 h達(dá)到最大,分別為0.289 g·L-1和0.369 g·L-1；第3次循環(huán)IAA產(chǎn)量在60 h達(dá)到最大，分別為0.037 g·L-1和0.069 g·L-1，幾乎不產(chǎn)IAA。菌株EMP09負(fù)載生物炭和菌株EMP09游離細(xì)胞全細(xì)胞催化連續(xù)循環(huán)3次，第1次發(fā)酵IAA產(chǎn)量在60 h達(dá)到最大，分別為1.239 g·L-1和1.333 g·L-1；第2次IAA產(chǎn)量 在60 h達(dá)到最大,分別為0.854 g·L-1和1.049g·L-1；第3次IAA產(chǎn)量在60 h達(dá)到最大，分別為0.284 g· L-1和0.295 g· L-1，第4次IAA產(chǎn)量在60 h達(dá)到最大，分別為0.073 g· L-1和0.05 g· L-1，幾乎不產(chǎn)IAA。菌株EPA03負(fù)載改性生物炭全細(xì)胞催化連續(xù)循環(huán)6次，第1次循環(huán)IAA產(chǎn)量在60 h達(dá)到最大，為0.39 g· L-1；第2次循環(huán)IAA產(chǎn)量在60 h達(dá)到最大，為0.542 g·L-1；第3次循環(huán)IAA產(chǎn)量在60 h達(dá)到最大，為0.971 g·L-1；第4次循環(huán)IAA產(chǎn)量在60 h達(dá)到最大，為0.812 g·L-1；第5次循環(huán)IAA產(chǎn)量在168 h達(dá)到最大，為0.782 g·L-1，第6次循環(huán)IAA產(chǎn)量在168 h達(dá)到最大，為0.617 g·L-1。菌株EPA03和空白對(duì)照組菌株EMP09游離細(xì)胞相比連續(xù)循環(huán)周期較長(zhǎng)，IAA總產(chǎn)率最高。

注：菌株EMP09和EMP09-BC2為空白對(duì)照：(a)第1次循環(huán)IAA產(chǎn)量；(b)第1次循環(huán)色氨酸消耗量；(c)第2次循環(huán)IAA產(chǎn)量；(d)第2次循環(huán)色氨酸消耗量；(e)第3次循環(huán)IAA產(chǎn)量；(f)第3次循環(huán)色氨酸消耗量；(g)第4次循環(huán)IAA產(chǎn)量；(h)第4次循環(huán)色氨酸消耗量；(i)第5次循環(huán)IAA產(chǎn)量；(j)第5次循環(huán)色氨酸消耗量；(k)第6次循環(huán)IAA產(chǎn)量；(l)第6次循環(huán)色氨酸消耗量

3 結(jié)論與討論

固定化細(xì)胞技術(shù)是指固定在水不溶性載體上，在一定空間范圍進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞。固定化細(xì)胞技術(shù)在過去30年發(fā)展迅速[18]，在環(huán)境治理領(lǐng)域、食品發(fā)酵領(lǐng)域、能源開發(fā)領(lǐng)域、藥物制備中得到廣泛的應(yīng)用，但同時(shí)許多固定化細(xì)胞載體對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，價(jià)格昂貴。生物炭具有較大的孔隙結(jié)構(gòu)，含碳量較為豐富，價(jià)格廉價(jià)，對(duì)細(xì)胞沒有損傷，并且生物炭是從一些廢棄生物質(zhì)如玉米、小麥秸稈熱解而來，較為環(huán)保，可使廢棄生物質(zhì)循環(huán)利用。目前報(bào)道過的生物炭作為載體吸附細(xì)胞，大多是利用生物炭多孔的特點(diǎn)，將細(xì)胞吸附在孔隙結(jié)構(gòu)中，然而這種吸附方式過程中往往存在載體與細(xì)胞之間結(jié)合率降低等局限性。

據(jù)Wee等[14]研究，來源于歐文鳳梨歐氏桿菌Erwiniaananas的冰晶核蛋白INaA成功將木聚糖酶展示細(xì)胞表面，相較于其他兩種冰晶核蛋白INaK和INaZ全細(xì)胞木聚糖酶的活性更高。本研究中利用細(xì)菌表面展示技術(shù)，以INaA、INaK結(jié)構(gòu)域?yàn)殄^定基序，綠色熒光蛋白(EGFP)為報(bào)告蛋白，構(gòu)建了表面展示系統(tǒng)pRB1K-INaA-EGFP，pRB1K-INaK-EGFP，通過熒光顯微鏡結(jié)果顯示，錨定蛋白為INaA的菌株EPA01、EPA02、EPA03成功將帶有負(fù)電荷氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)融合蛋白錨定在細(xì)胞膜上，以此來增加細(xì)胞表面的負(fù)電荷。

據(jù)Yao等[9]的報(bào)道，大多數(shù)未改性的生物炭表面呈負(fù)電性，本試驗(yàn)中使用FeCl3改性生物炭[19]，將生物炭從負(fù)電性改性為正電性，改性的生物炭固定化重組菌株，菌株EPA03吸附率與對(duì)照EMP09相比提高了31.85%，菌株EPA02提高了22.5%，菌株EPA01提高了20.65%。

吲哚-3-乙酸(IAA)是生長(zhǎng)素中最常見的激素，它調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的各個(gè)方面,將含有表面展示系統(tǒng)的質(zhì)粒導(dǎo)入本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的IAA高產(chǎn)菌株，以色氨酸為底物，全細(xì)胞催化連續(xù)生產(chǎn)IAA循環(huán)中，菌株EPA03具有巨大潛力，能連續(xù)循環(huán)6次，IAA產(chǎn)量還能達(dá)到0.617 g·L-1，相比于對(duì)照菌株EMP09游離細(xì)胞和生物炭固定化細(xì)胞生命周期有所提高。菌株EPA03融合蛋白中表達(dá)了較多的負(fù)電荷氨基酸，使其細(xì)胞膜表面有較多的負(fù)電荷，將帶正電荷的生物炭吸附時(shí)，由于靜電引力，彼此之間結(jié)合的較為牢固，生物炭能為細(xì)菌提供一個(gè)穩(wěn)定的發(fā)酵微環(huán)境，使固定化細(xì)胞能較好地生長(zhǎng)和代謝，在全細(xì)胞催化連續(xù)生產(chǎn)IAA中能夠維持更長(zhǎng)的生長(zhǎng)周期和活性，使菌株一直持續(xù)不斷產(chǎn)IAA。