響應面法優(yōu)化銀葉金合歡組培快繁體系

武愛龍，潘浩漢，吳建陽，卜 浩

(1.湛江幼兒師范?？茖W校， 廣東 湛江 524037；2.嶺南師范學院基礎教育學院， 廣東 湛江 524037)

銀葉金合歡Acaciapodalyriifolia屬豆科含羞草亞科植物，國內(nèi)早期又叫珍珠相思、真珠相思、昆士蘭銀條等，原產(chǎn)澳大利亞[1]。該樹適應性強，生長速度快，樹形優(yōu)美，花繁葉茂，花朵金黃色，花期長，葉片呈銀綠色，同時銀葉金合歡可用于景觀造型，觀葉、觀花效果都非常好，是園藝園林綠化的優(yōu)良樹種，具有較高的生態(tài)、經(jīng)濟和社會價值。因此，銀葉金合歡廣泛應用于華南地區(qū)城市綠化和生態(tài)景觀林中[2]。

銀葉金合歡優(yōu)良的種苗主要來自進口，成本昂貴。目前，銀葉金合歡主要采用播種、扦插、壓條、嫁接、分株等方法進行繁殖，但效果不理想。國內(nèi)關于銀葉金合歡的繁殖主要是通過播種繁殖[3-7]，但是其種皮結構致密，且種子外部具有蠟狀角質層，透氣性透水性極差，不經(jīng)處理的種子發(fā)芽率很低。植物組織培養(yǎng)技術具有增殖系數(shù)大、生產(chǎn)周期短、可以常年生產(chǎn)等優(yōu)點, 因此組培技術廣泛應用于各種植物種苗的快速繁殖，但是有關銀葉金合歡的組培快繁研究不是很多，只有李蕊萍等[6-7]對銀葉金合歡做過初步的組培研究，方法比較傳統(tǒng)。響應面分析法(response surface methodology，RSM)是近幾年來國內(nèi)外學者常用的試驗設計優(yōu)化方法，可以減少試驗次數(shù)，使用方便，回歸預測性好[8]，已在植物組織培養(yǎng)研究中廣泛應用[9-10]。本研究采用組培所需的基本培養(yǎng)基MS、激素(6-BA、IBA、GA3、NAA)為培養(yǎng)基原料，并基于單因素的預試驗基礎上，參考Box-Behnken試驗設計原理，用響應面法將各因素的相互關系進行擬合分析，研究各因素與響應值的關系，從而優(yōu)化銀葉金合歡的組培條件，以期為今后相關研究提供理論實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

銀葉金合歡采自于湛江東盟城的東菊公園。2018年1月，選擇連續(xù)晴天3 d以上，挑生長健壯、無病蟲害的植株切取當年生含腋芽枝條作為誘導材料。

1.2 材料預處理

先用酒精消毒后的手術刀將含有腋芽的當年枝條，從其母株上切下，切除枝條上的葉部結構后，用流水沖洗干凈，放室內(nèi)晾3 d。隨后，將其放入5%洗潔精溶液中浸泡30 min，軟毛刷洗凈后流水沖洗30 min，切成長1.0～2.0 cm帶腋芽的莖段，在超凈工作臺上先用75%酒精消毒1 min，再用0.2% 升汞(加幾滴吐溫-20)浸泡消毒20 min，最后用無菌水沖洗5～7次備用。

1.3 接種

將消毒洗凈后的帶腋芽莖段放在無菌超凈臺上1 h，等帶腋芽莖段表面水分晾干后，切去帶腋芽莖段兩端壞死部分，最后將帶腋芽莖段接種到誘導培養(yǎng)基中,每次接種每種處理10瓶，每瓶接種1株，3次重復，所用培養(yǎng)瓶直徑6.6 cm，高度9.5 cm，容量為240 mL。

1.4 試驗方法

1.4.1不定芽誘導培養(yǎng) 采用統(tǒng)計軟件Design-expert 8.0.5進行中心組合試驗(Central Composite Design,CCD)設計，對影響銀葉金合歡莖段誘導出不定芽培養(yǎng)基激素濃度配比進行研究,以獲得不定芽最佳誘導培養(yǎng)基?；谇捌趩我蛩仡A試驗,得知影響銀葉金合歡莖段誘導不定芽誘導率的激素有6-BA、IBA、GA3。本研究采用響應面試驗設計優(yōu)化方案,以6-BA、IBA、GA33種激素的濃度為三因素，以誘導率為響應值(表1)，共17個處理。將步驟1.3所選取的帶腋芽莖段外植體接種于誘導培養(yǎng)基中無菌的帶腋芽莖段接入到誘導培養(yǎng)基上,每個處理接種30瓶,每瓶接種1個莖段,光照時間12 h·d-1，光照強度為2 000 lx。培養(yǎng)30 d后觀察記錄發(fā)芽個數(shù),并計算各誘導培養(yǎng)基誘導率，探討最佳的誘導培養(yǎng)基。

表1 銀葉金合歡不定芽誘導培養(yǎng)基響應面試驗因素水平

1.4.2增殖培養(yǎng) 本試驗在前期單因素預試驗基礎上, 得知增殖培養(yǎng)3種激素6-BA、IBA、GA3有效的濃度范圍分別為0.2～0.8 mg·L-1、0.2～1.0 mg·L-1、0.1～0.3 mg·L-1。根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，以增殖系數(shù)為響應值(表2),確定增殖培養(yǎng)中激素組合的最佳配比，共17個處理。將誘導培養(yǎng)所得的不定芽分成單株，轉接至含有不同的增殖培養(yǎng)基中進行增殖。每個試驗接種30瓶,每瓶1個不定芽,培養(yǎng)30 d后觀察記錄不定芽的增殖情況,探討最佳的增殖培養(yǎng)基。

表2 銀葉金合歡增殖培養(yǎng)基響應面試驗因素水平

1.4.3生根培養(yǎng) 本試驗在前期單因素試驗基礎上,得到銀葉金合歡生根培養(yǎng)2種激素IBA、NAA有效濃度范圍分別為0.4～0.8 mg·L-1、0～0.2 mg·L-1,通過CCD中心試驗設計，以生根率為響應值(表3)，確定生根培養(yǎng)中激素組合的最佳配比,共13個處理。將增殖培養(yǎng)所得的2～3 cm高的無根芽苗分成單株,接種生根培養(yǎng)基中。每個處理接種10瓶,每瓶2個外植體，重復3次；培養(yǎng)40 d后觀察記錄生根情況，并計算各生根培養(yǎng)基中生根率。

表3 銀葉金合歡生根培養(yǎng)基響應面試驗因素水平

1.5 培養(yǎng)條件

以上培養(yǎng)基中，誘導以及增殖基本培養(yǎng)基都是MS培養(yǎng)基，蔗糖濃度均為30 g·L-1，而生根基本培養(yǎng)基是1/2MS培養(yǎng)基，蔗糖濃度為15 g·L-1，培養(yǎng)基瓊脂粉濃度均為6 g·L-1，pH 5.8～6.2。培養(yǎng)溫度26℃左右，光照強度2 000 lx左右,光照時間12 h·d-1。

1.6煉苗移栽 移栽前將生根瓶苗放在室溫25～30℃的環(huán)境下不開蓋煉苗7 d，在移栽前1 d洗凈根部的培養(yǎng)基之后用多菌靈或者高錳酸鉀進行浸泡2 min消毒，隨后移栽到消毒好的基質中，基質配置比例為黃心土∶沙(2∶1)，澆透水，再用薄膜覆蓋保濕保溫，并用遮陰網(wǎng)遮陰。20 d后，揭開薄膜進行常規(guī)水肥管理。經(jīng)30 d的常規(guī)養(yǎng)護，即可成活。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Design Expert 8.0.6軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析,推測出最佳組合配方并進行實際試驗驗證。

誘導率(%)=(誘導出不定芽的瓶數(shù)/接種瓶數(shù))×100;

增殖系數(shù)=新增芽數(shù)/接種總芽數(shù);

生根率(%)=(生根苗數(shù)/接種總苗數(shù))×100。

2 結果與分析

2.1 激素組合對銀葉金合歡不定芽誘導的影響

外植體接種到誘導培養(yǎng)基10～15 d后莖段腋芽開始逐漸膨大，出現(xiàn)不定芽。部分莖段基部出現(xiàn)褐色分泌物，30 d開始統(tǒng)計不定芽的誘導率。從表4可知，17組組合都可以誘導出不定芽，但不同組合的誘導率存在很大的差異，誘導率的范圍在13.56%～62.14%，其中第13組組合誘導率最高(6-BA濃度為2.0 mg·L-1,IBA濃度為0.6 mg·L-1,GA3濃度為0.2 mg·L-1)，達到62.14%，第5組組合(6-BA濃度為1.0 mg·L-1，IBA濃度為0.2 mg·L-1，GA3濃度為0.2 mg·L-1)誘導率最低13.56%，兩者相差高達48.58%。通過觀察發(fā)現(xiàn)，第5組也能夠形成大量的愈傷組織，可能原因在于6-BA以及IBA濃度較高有利于誘導不定芽，而GA3濃度較高有利于能夠產(chǎn)生愈傷組織。

2.1.1誘導率回歸方程分析 以培養(yǎng)基中6-BA(A)、IBA(B)、GA3(C)為自變量因素，莖段誘導出芽的誘導率(Y)為響應值，根據(jù)試驗結果(表4)得到回歸方程為:Y=57.40+10.01A+1.33B-0.59-6.68×B-0.33A×C-2.73B×C-15.56A2-10.40B2-7.23C2,其中,相關系數(shù)R2=0.946 9,校正決定系數(shù)R2=0.878 7。該回歸方程的P值=0.001 1<0.01,有極顯著性；方程經(jīng)失擬性檢驗分析得F=0.355 55,P>0.1,失擬不顯著,由此可以看出，該回歸方程擬合性好。表5顯示,A、A2、B2達到差異極顯著(P<0.01),AB、C2達到差異顯著(P<0.05)。表明激素6-BA濃度對銀葉金合歡外植體莖段誘導出不定芽有著極顯著影響，且6-BA濃度與IBA濃度的交互作用對誘導出不定芽差異顯著，IBA濃度與GA3濃度的交互作用對結果差異不顯著。通過回歸方程得到最優(yōu)誘導芽的培養(yǎng)基中6-BA、IBA和GA3濃度分別為A=3.00 mg·L-1，B=0.35 (mg·L-1)，C=0.20 mg·L-1。

表4 不定芽誘導響應面試驗設計與結果

表5 響應面二次回歸方程方差分析

2.1.2響應值和等高線分析 通過擬合方程繪制因素間交互作用的等高線圖和響應面圖,6-BA、IBA和GA3濃度對銀葉金合歡誘導不定芽影響。由圖1可知,6-BA和6-BA以及6-BA和IBA的交互作用顯著,6-BA和IBA交互作用較小。其中，6-BA濃度對不定芽誘導的影響最大，其次是IBA濃度，對植株再生頻率影響最小的是GA3濃度。因此,可知銀葉金合歡外植體誘導不定芽對培養(yǎng)基中6-BA的濃度變化較為敏感，而對IBA和GA3的敏感性次之,其敏感性大小為6-BA>IBA>GA3。

圖1 6-BA、IBA和GA3濃度對銀葉金合歡誘導不定芽影響的響應面和等高線

2.1.3最佳激素濃度配比及驗證 通過二次回歸方程的分析可得出銀葉金合歡誘導培養(yǎng)基的最優(yōu)條件為A=3.00 mg·L-1,B=0.35 mg·L-1,C=0.20 mg·L-1，最佳誘導率預測值為62.89%。為驗證模型預測的有效性,本試驗研究了模型推測出的銀葉金合歡莖段芽誘導最佳激素配比為MS+3.0 mg·L-16-BA+0.35 mg·L-1IBA+0.2 mg·L-1GA3,該組合下銀葉金合歡莖段的理論出芽率為62.89%。經(jīng)實際試驗觀測,該組合的平均出芽率為62.35%,與預測值無顯著差異，證明響應面法可以有效優(yōu)化銀葉金合歡誘導培養(yǎng)基，其試驗方案具有實際意義和可行性。

2.2 激素組合對銀葉金合歡莖段增殖系數(shù)及生長情況

從表6可知，15個不同組合增殖系數(shù)為1.82～3.69，其中第15組組合(6-BA0.8 mg·L-1+IBA0.3 mg·L-1+GA30.1 mg·L-1)增殖系數(shù)最高，達到3.69；第4組組合(6-BA 0.2 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+GA30.1 mg·L-1)增殖系數(shù)最低，為1.82，2個組合相差1.87。通過觀察發(fā)現(xiàn)，添加IBA 0.3 mg·L-1,隨著6-BA濃度的增加，增殖系數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當6-BA為0.8 mg·L-1時，不定芽長勢較慢，呈現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象；而GA3濃度上升的情況下，不利于不定芽的誘導分化。

表6 增殖培養(yǎng)試驗設計與結果

2.2.1增殖系數(shù)回歸方程分析 以培養(yǎng)基中6-BA(A)、IBA(B)、GA3(C)為自變量因素，增殖系數(shù)(Y)為響應值，根據(jù)試驗結果(表4)得到回歸方程為:Y=2.59+0.43A+0.28B-0.41C+0.22A×B-0.48×A×C-0.085×B×C-0.25×A2-0.050×B2+0.044×C2,其中,相關系數(shù)R2=0.987 4,校正決定系數(shù)R2=0.971 3。該回歸方程的P值<0.000 1,有極顯著性；方程經(jīng)失擬性檢驗分析得F=0.404 2，P>0.1,失擬不顯著,由此可以看出，該回歸方程擬合性好。從表7可知，A、B、C、AB、AC、A2回歸系數(shù)極顯著(P<0.01)。表明激素6-BA、IBA、GA3濃度對銀葉金合歡外植體誘導出不定芽差異極顯著，且6-BA濃度與IBA濃度的交互作用對誘導出不定芽差異顯著，但是IBA濃度與GA3濃度的交互作用對結果影響不顯著。通過回歸方程得到最優(yōu)增殖培養(yǎng)基的激素濃度6-BA、IBA和GA3分別為A=0.66 mg·L-1，B=0.45 mg·L-1，C=0.11 mg·L-1。

表7 響應面二次回歸方程方差分析

2.2.2莖段增殖響應面和等高線 根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件繪制因素間交互作用的等高線圖和響應面圖。由圖2可知, 6-BA、IBA、GA3的交互作用顯著。因此,推測銀葉金合歡增殖對培養(yǎng)基中6-BA、IBA、GA3的濃度變化都比較敏感，尤其是6-BA在培養(yǎng)基中的濃度變化對銀葉金合歡莖段的增殖倍數(shù)影響更明顯。

圖2 6-BA、IBA和GA3濃度對銀葉金合歡增殖影響的響應面和等高線

2.2.3最佳激素濃度配比及驗證 為驗證模型預測的有效性,本試驗對模型推測出的最佳激素配比MS+0.66 mg·L-16-BA+0.45 mg·L-1IBA+0.11 mg·L-1GA3進行驗證試驗,該組合配比下銀葉金合歡莖段理論增殖倍數(shù)為3.785 74。經(jīng)實際試驗可得到平均增殖系數(shù)為3.68,與預測值基本一致, 比原17個組合中最高增殖倍數(shù)高0.10，說明方程與真實試驗擬合度較好，證實了該模型的有效性。

2.3 激素組合對銀葉金合歡莖段生根率的影響

將增殖培養(yǎng)后, 將高為2～3 cm的叢生芽苗切割為單個植株接入到不同的生根培養(yǎng)基中誘導生根。由表6可知,13組組合都可以誘導出不定根，但不同組合的生根率有所不同，各組合生根率為43.31%～81.68%，其中第8組組合(IBA 0.6 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1)生根率最高，達到61.68%，第7組組合(IBA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1)生根率最低，為23.31%；兩個處理組合相差37.37%。通過觀察發(fā)現(xiàn)，當IBA、NAA激素濃度較低時，生根效果總體差異不顯著，芽長勢也無明顯區(qū)別，長勢較好，苗比較健壯，隨著IBA、NAA濃度的升高，生根率呈先上升后下降趨勢，同時形成大量愈傷組織，導致苗長勢較差，可能由于前期增殖培養(yǎng)中，所形成的叢生芽植株所蓄積的激素濃度也較多，導致后期生根過程中，激素濃度越高越會抑制苗的長勢。

2.3.1生根率回歸方程分析 以培養(yǎng)基中IBA(B)、 NAA(C)為自變量因素，生根率(Y)為響應值，根據(jù)試驗結果(表8)得到回歸方程為Y=78.65+5.99A+2.81B+4.95×A×B-18.62A2-4.55B2,其中,相關系數(shù)R2=0.940 9,校正決定系數(shù)R2=0.898 6。該回歸方程的P值=0.000 4<0.01,有極顯著性；方程經(jīng)失擬性檢驗分析得F=0.157 5,P>0.1,失擬不顯著,由此可以看出，該回歸方程擬合性好。從表8可知,A、A2差異極顯著(P<0.01),AB差異顯著(P<0.05)。表明激素6-BA濃度對銀葉金合歡外植體誘導出不定芽有著極顯著影響，且6-BA濃度與IBA濃度的交互作用對誘導出不定芽有顯著性影響。通過Design-Expert V 8.0.6軟件得到最優(yōu)誘導芽的培養(yǎng)基的6-BA、IBA和GA3濃度分別為A=0.64 mg·L-1，B=0.14 mg·L-1。

表8 生根培養(yǎng)試驗設計與結果

表9 響應面回歸系數(shù)方差分析

2.3.2響應面和等高線 通過擬合方程繪制因素間交互作用的等高線圖和響應面圖,考察響應面的形狀。由圖9可知,IBA和IBA以及IBA和NAA的交互作用顯著,NAA和NAA交互作用不顯著。其中，6-BA濃度對植株不定芽誘導的影響最大。因此,推測銀葉金合歡生根對培養(yǎng)基中的敏感性為IBA>NAA。

圖3 IBA和NAA濃度對銀葉金合歡生根影響的響應面和等高線

2.3.3最佳激素濃度配比及驗證 通過二次回歸方程的分析可得出銀葉金合歡生根培養(yǎng)基的最優(yōu)條件為A=0.64 mg·L-1，B=0.14 mg·L-1,經(jīng)計算，該配比培養(yǎng)條件下銀葉金合歡莖段的理論生根率為79.906 7%。而通過實際試驗測試獲得的平均生根率為85.67%,與預測值基本一致,比原13個組合中最高生根率高出3.99%，說明方程與真實試驗擬合度較好，證實了該模型的有效性。

2.4 組培苗移栽

將生根培養(yǎng)30 d后的組培苗，移至溫室中不開蓋煉苗7 d，這樣可以保持瓶內(nèi)外環(huán)境的一致，使得組培苗能夠更好地適應室外的自然環(huán)境。移栽前1 d，將培養(yǎng)瓶旋開，之后將苗取出，洗凈根上黏附的培養(yǎng)基，同時用多菌靈或者高錳酸鉀溶液浸泡消毒2 min，隨后移栽至經(jīng)消毒處理的基質中，基質配置比例為黃心土∶沙(2∶1)，覆蓋薄膜保溫保濕，并用遮陰網(wǎng)遮陰。20 d后，揭開薄膜進行常規(guī)水肥管理，1個月后調查其存活率可達到90%以上。

3 討論與結論

響應面分析法是一種可以減少試驗次數(shù)，使用方便，回歸預測性好的優(yōu)化分析方法[11]。相對于以往的分析方法，響應面分析法獲得各個試驗參數(shù)組合更加精確，可以減少試驗次數(shù)，進而減少試驗浪費。在植物組培試驗中,最常用的試驗方法是正交試驗設計,但是正交試驗方法只是對一個個孤立的試驗進行分析，無法找到各個因素與響應值之間的關系。牟會榮等[12]、蔡厚道[13]利用以上兩種試驗設計方法進行試驗設計與研究,均發(fā)現(xiàn)響應面法優(yōu)于正交法。

目前國內(nèi)對銀葉金合歡的研究主要集中對種子萌發(fā)特征[5]、育苗技術[14]等方面，國外對銀葉金合歡的研究主要在于分類特征、種類鑒定、分布以及引種栽培，關于優(yōu)化銀葉金合歡組培培養(yǎng)基的響應面法還沒見報道，由于銀葉金合歡屬于豆科金合歡屬常綠小喬木，又屬于相思類植物，因此，本研究主要參考金合歡屬或者相思類植物的組培方法。曾少玲等[15]在馬大雜種相思無性系的組培快繁試驗中馬大雜種相思理想的外植體材料是當年生枝條第3～5個腋芽莖段；王鴻等[16]在16年生大葉相思高效芽誘導、增殖體系研究中發(fā)現(xiàn)最優(yōu)外植體是8月取當年生枝條第3～5腋芽莖段。因此，本研究在不定芽誘導培養(yǎng)中選擇的銀葉金合歡外植體為帶腋芽的莖段。同時在誘導培養(yǎng)中，采用CCD設計篩選出最優(yōu)的誘導培養(yǎng)基MS+3.0 mg·L-16-BA+0.35 mg·L-1IBA+0.2 mg·L-1GA3，實際誘導率為62.35%，高于李蕊萍等[6]報道的誘導率54.33%，當然根據(jù)響應面法因素間交互作用的等高線圖和響應面圖分析發(fā)現(xiàn)在最優(yōu)誘導培養(yǎng)基中6-BA濃度對不定芽誘導的影響最大，其次是IBA濃度，對植株再生頻率影響最小的是GA3濃度，這與李蕊萍等[6]對銀葉金合歡誘導試驗中所使用的基本培養(yǎng)基以及激素種類一致。在銀葉金合歡的增殖培養(yǎng)中，篩選出最優(yōu)的增殖培養(yǎng)基MS+0.66 mg·L-16-BA+0.45 mg·L-1IBA+0.11 mg·L-1GA3，該組合的銀葉金合歡莖段實際平均增殖系數(shù)為3.68，高于李蕊萍等[6]報道的銀葉金合歡組培增殖系數(shù)(3.44)、王鴻等[16]報道的大葉相思組培增殖系數(shù)(2.63)以及黃烈健等[17]報道的黑木相思組培增殖系數(shù)(3.12)。在增殖培養(yǎng)過程中，激素6-BA、IBA、GA3濃度對銀葉金合歡外植體誘導不定芽存在極顯著差異，且6-BA濃度與IBA濃度的交互作用對誘導不定芽影響差異顯著，但是IBA濃度與GA3濃度的交互作用對結果影響不顯著。激素6-BA濃度對銀葉金合歡外植體誘導不定芽有極顯著影響，且6-BA濃度與IBA濃度的交互作用對誘導不定芽有顯著影響。本研究篩選出的銀葉金合歡最優(yōu)生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.64 mg·L-1IBA+0.14 mg·L-16-BA，在此培養(yǎng)基配方下銀葉金合歡莖段的實際平均生根率為85.67%，高于李蕊萍等[6]報道的銀葉金合歡組培生根率(67.10%)，低于黃玉梅等報道的黑木相思組培生根率(94.45%)[18]、寧昭然等[19]報道的黑木相思組培生根率(96.63%)以及王鴻等[20]報道的卷莢相思組培生根率(96.11%)，原因可能是添加不同激素種類以及濃度配比的不同而導致?？傮w來說銀葉金合歡生根率低于其他相思類植物；同時IAA和IBA兩種生長素交互作用比單獨作用能使相思類植物生根率提高，但其具體機理還需要進一步深入研究。

本研究以銀葉金合歡誘導率、增殖系數(shù)、生根率作為響應值，結合CCD試驗設計回歸分析各處理之間的總體差異，對得到的試驗結果再進行驗證，試驗結果可靠。因此，響應面法在植物組織培養(yǎng)不同品種、不同培養(yǎng)條件、不同的培養(yǎng)過程方面應用前景將非常廣泛，極大促進植物組織培養(yǎng)研究技術的進步。