隱秘小環(huán)藻無(wú)菌化處理研究?

張 裕，劉 雨，朱葆華，李 赟，潘克厚,2??

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))，山東 青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237)

自然環(huán)境或?qū)嶒?yàn)室條件下，微藻與細(xì)菌關(guān)系密切。在微藻生長(zhǎng)過(guò)程中，有些細(xì)菌不僅能夠促進(jìn)藻類生長(zhǎng)，誘導(dǎo)微藻活性物質(zhì)的產(chǎn)生，還有助于絮凝[1-4]，還有些細(xì)菌能產(chǎn)生鼠李糖脂或胞外絲氨酸蛋白酶，這些活性物質(zhì)具有對(duì)赤潮藻類的殺藻作用[5-6]。因此，研究細(xì)菌對(duì)藻類生長(zhǎng)及代謝的影響，對(duì)于優(yōu)化藻類的培養(yǎng)技術(shù)及藻類產(chǎn)品的開發(fā)、應(yīng)用具有重要意義，而進(jìn)行微藻無(wú)菌化處理是獲得微藻無(wú)菌培養(yǎng)物，開展微藻相關(guān)細(xì)菌功能研究的前提，也是實(shí)現(xiàn)微藻兼養(yǎng)、異養(yǎng)培養(yǎng)的基礎(chǔ)。

因微藻種類及培養(yǎng)條件不同，微藻相關(guān)細(xì)菌組成也具有種間特異性。微藻無(wú)菌化方法既包括渦流、超聲波處理[7-8]、密度梯度離心、連續(xù)稀釋[9]和紫外線照射[10]等物理方法，也包括抗生素處理[11]、溶菌酶處理[12]及抗菌物質(zhì)處理[13]等化學(xué)方法。而最常用的方法是抗生素法[4]。由于每種抗生素都有其特定的作用方式和靶細(xì)胞，因此了解微藻種類及其相關(guān)菌群結(jié)構(gòu)，有助于選擇合適的抗生素組合進(jìn)行除菌，成功獲得無(wú)菌藻株[14]。

隱秘小環(huán)藻(Cyclotellacryptica)作為一種廣鹽性海洋硅藻[15-16]，其脂質(zhì)含量可達(dá)總生物量的42%，其中TAG含量占總脂含量的55%左右[17]，已被證明是一種良好的脂質(zhì)生產(chǎn)者[18]。除了可進(jìn)行傳統(tǒng)的自養(yǎng)生長(zhǎng)外，隱秘小環(huán)藻還能以葡萄糖為碳源進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)[19-21]。與很多硅藻相似，隱秘小環(huán)藻也具有納米級(jí)到微米級(jí)的多孔結(jié)構(gòu)，具有良好的止血、藥物緩釋能力[22-24]。這顯示出隱秘小環(huán)藻具有非常廣闊的綜合利用前景。

本研究探究了不同抗生素對(duì)隱秘小環(huán)藻藻液中細(xì)菌的抑制效果及對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響，同時(shí)對(duì)比分析了抗生素處理前后藻液細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而設(shè)計(jì)了有效的抗生素組合進(jìn)行隱秘小環(huán)藻的無(wú)菌化處理，為隱秘小環(huán)藻的培養(yǎng)方式優(yōu)化以及藻際細(xì)菌功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藻種來(lái)源及培養(yǎng)條件

本研究的實(shí)驗(yàn)藻種——隱秘小環(huán)藻(Cyclotellacryptica)由中國(guó)海洋大學(xué)應(yīng)用微藻生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室種質(zhì)庫(kù)提供(編號(hào)LAMB 147)。微藻培養(yǎng)基采用f/2培養(yǎng)液，固體培養(yǎng)基追加1%的瓊脂。海水經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，加入f/2母液，高溫滅菌冷卻后使用。原藻種長(zhǎng)期保存于低溫液體培養(yǎng)基中，先進(jìn)行涂板挑取單藻落進(jìn)行活化，再將活化后的藻種用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)溫度為22 ℃，光照強(qiáng)度為40 μmol·m-2·s-1，光照周期(光∶暗)為12 h∶12 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)所用抗生素均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，實(shí)驗(yàn)開始前配制抗生素母液，其中硫酸慶大霉素、硫酸卡那霉素、硫酸新霉素、硫酸鏈霉素、氨芐青霉素、氯霉素母液濃度為50 mg·mL-1；鹽酸環(huán)丙沙星母液濃度為25 mg·mL-1?？股啬敢航?jīng)0.22 μm微孔過(guò)濾器過(guò)濾后，置于-20 ℃冷凍保存。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)菌培養(yǎng)基為2216E固體培養(yǎng)基及2216E液體培養(yǎng)基，均購(gòu)自海博生物有限公司。

1.3 除菌抗生素種類及濃度的確定

1.3.1 藻液中細(xì)菌對(duì)不同抗生素的敏感性 選取硫酸慶大霉素、硫酸卡那霉素、硫酸新霉素、硫酸鏈霉素、氨芐青霉素、氯霉素6種抗生素。將母液進(jìn)行稀釋，使各抗生素終濃度為200、400、600和800 μg·mL-1，將直徑為6 mm的濾紙片浸泡在相應(yīng)濃度的抗生素中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱烘干備用。取100 μL處于指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液，稀釋后涂布于2216E固體培養(yǎng)基，分別將含有不同濃度抗生素的濾紙片平貼在培養(yǎng)基上，各濃度抗生素做3個(gè)平行。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h，觀察并測(cè)量抑菌圈大小。選擇對(duì)藻液中細(xì)菌抑制作用強(qiáng)的抗生素作為除菌工具。

1.3.2 藻細(xì)胞對(duì)不同抗生素的耐受性比較 取適量處于指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液接種于120 mL新鮮滅菌f/2培養(yǎng)基中，初始OD750為0.050。分別向培養(yǎng)基中添加上述6種抗生素，使其終濃度分別為200、400、600和800 μg·mL-1，并以不添加抗生素(0 μg·mL-1)作為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別設(shè)置3個(gè)平行。培養(yǎng)方式同1.1，連續(xù)培養(yǎng)7 d，每天定點(diǎn)搖藻，并隨機(jī)變換位置。每隔48 h取1 mL藻液，利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)測(cè)定細(xì)胞密度。后續(xù)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)中鹽酸環(huán)丙沙星的作用終濃度分別為25、50、75和100 μg·mL-1，處理方式同上。根據(jù)不同抗生素對(duì)隱秘小環(huán)藻生長(zhǎng)的影響，選擇對(duì)微藻毒害作用小的抗生素種類及濃度用于后續(xù)除菌。

1.4 單一抗生素除菌后藻液細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)分析

取適量處于指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液接種于120 mL新鮮滅菌f/2培養(yǎng)基，分別使用800 μg·mL-1氨芐青霉素、800 μg·mL-1硫酸卡那霉素、800 μg·mL-1硫酸鏈霉素以及600 μg·mL-1的硫酸新霉素和600 μg·mL-1硫酸慶大霉素處理3 d，以不加抗生素的藻液作為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別設(shè)置3個(gè)平行。處理結(jié)束后各取藻液50 mL，用0.22 μm的濾膜過(guò)濾，富集黏附細(xì)菌及游離細(xì)菌。將各處理組的3個(gè)平行混合作為一個(gè)樣品，并分別對(duì)樣品進(jìn)行編號(hào)。將樣品送至聯(lián)川生物有限公司進(jìn)行16S rRNA基因高通量測(cè)序，比較抗生素處理及未處理隱秘小環(huán)藻藻液細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)變化。

采用CTAB法提取樣品總DNA，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA提取質(zhì)量，并使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總DNA的濃度和純度。以樣品DNA為模板，選擇細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)引物序列341F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)和805R(5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’),進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用AMPure XT beads純化試劑盒進(jìn)行純化。將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，檢測(cè)合格后，使用Illumina NovaSeq高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序。

首先將測(cè)序獲得的原始序列使用cutadapt軟件去除引物序列和平衡堿基序列；使用FLASH軟件將每對(duì)Pair-end reads進(jìn)行拼接；使用fqtrim軟件進(jìn)行過(guò)濾質(zhì)控，去除低質(zhì)量序列；使用Vsearch軟件去除嵌合體序列；使用Qiime2軟件去噪，獲得ASV(Feature)特征序列和ASV(Feature)豐度表。利用Qiime 2軟件計(jì)算樣品Alpha多樣性指數(shù)，包括Observed OTUs、Shannon、Simpson和Chao1。根據(jù)獲得的ASV(Feature)特征序列，使用SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)(Release 138)以及NT-16S數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋，并根據(jù)ASV(Feature)豐度表對(duì)各物種在各樣本中豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.5 抗生素組合除菌

首先，使用600 μg·mL-1硫酸慶大霉素、800 μg·mL-1硫酸卡那霉素、800 μg·mL-1硫酸鏈霉素抗生素組合進(jìn)行除菌。但這一組合處理后仍殘留少量細(xì)菌，在對(duì)殘留細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定基礎(chǔ)上，追加對(duì)殘留細(xì)菌有明顯抑制作用的鹽酸環(huán)丙沙星進(jìn)行有針對(duì)性的除菌處理。

隨后，采用2種組合方式進(jìn)行除菌。組合一：將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液接種于新鮮無(wú)菌培養(yǎng)基，同時(shí)添加600 μg·mL-1硫酸慶大霉素、800 μg·mL-1硫酸卡那霉素、800 μg·mL-1硫酸鏈霉素和25 μg·mL-1鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)合處理3 d。組合二：將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液接種于新鮮無(wú)菌培養(yǎng)基，先添加600 μg·mL-1硫酸慶大霉素、800 μg·mL-1硫酸卡那霉素、800 μg·mL-1硫酸鏈霉素聯(lián)合處理3 d，離心洗滌后重新接種于新鮮滅菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d后，再次離心洗滌，接種于新鮮培養(yǎng)基，追加25 μg·mL-1的鹽酸環(huán)丙沙星處理3 d。

1.6 無(wú)菌效果檢驗(yàn)

在每種抗生素組合處理結(jié)束時(shí)進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。另外，將除菌后微藻轉(zhuǎn)入不含抗生素的無(wú)菌培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)3次后(各代培養(yǎng)7 d)再次進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。檢驗(yàn)方式為平板培養(yǎng)法和熒光染色觀察法[11]。其中平板培養(yǎng)法中一種方式是取藻液100 μL涂布于2216E固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)數(shù)天后觀察有無(wú)菌落出現(xiàn)；另一種方式是取適量藻液接種于改進(jìn)f/2液體培養(yǎng)基，即在原f/2培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加5 g·L-1蛋白胨和1 g·L-1酵母膏，置于適宜條件下培養(yǎng)5 d后，再次進(jìn)行涂板檢驗(yàn)，觀察有無(wú)菌落出現(xiàn)。熒光染色觀察法是取100 μL藻液，加入0.1 μL SYBR Green Ⅰ進(jìn)行染色，觀察染色情況。兩種方法均以未經(jīng)抗生素處理的藻細(xì)胞作對(duì)照。

1.7 帶菌藻株和無(wú)菌藻株的生長(zhǎng)比較

無(wú)菌隱秘小環(huán)藻在不含抗生素的f/2培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)5次(各代培養(yǎng)7 d)后用于生長(zhǎng)比較實(shí)驗(yàn)。將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的無(wú)菌和帶菌隱秘小環(huán)藻按1.833×105cells·mL-1的初始密度分別接種于120 mL新鮮f/2培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)平行。培養(yǎng)條件下同1.1，培養(yǎng)周期為8 d，每天定點(diǎn)取1 mL藻液，采用血球計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)藻細(xì)胞密度。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

本研究將3組平行的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用于結(jié)果分析，計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，用Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理并作圖，采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，顯著性水平為p<0.05。

2 結(jié)果

2.1 除菌抗生素種類及濃度

2.1.1 不同抗生素對(duì)藻液中細(xì)菌的抑制效果 以抑菌圈大于20 mm作為抗生素具有顯著抑菌效果的判斷標(biāo)準(zhǔn)，由表1可以看出，4個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度的氨芐青霉素、濃度不小于400 μg·mL-1的氯霉素以及濃度為800 μg·mL-1的硫酸慶大霉素抑菌效果均十分顯著，而濃度低于800 μg·mL-1的硫酸鏈霉素和硫酸卡那霉素及濃度為200 μg·mL-1的硫酸新霉素抑菌效果均較差。

表1 不同種類及濃度抗生素對(duì)隱秘小環(huán)藻藻液中細(xì)菌的抑制效果Table 1 The inhibitory effects of different types and concentrations of antibiotics on bacteria in algae liquid of Cyclotella cryptica

2.1.2 不同抗生素對(duì)隱秘小環(huán)藻生長(zhǎng)的影響 不同濃度的硫酸慶大霉素、硫酸新霉素、硫酸卡鏈霉素及硫酸卡那霉素均能促進(jìn)隱秘小環(huán)藻生長(zhǎng)(見(jiàn)圖1 A～D)。其中600 μg·mL-1的硫酸慶大霉素和硫酸新霉素以及800 μg·mL-1硫酸鏈霉素和硫酸卡那霉素對(duì)隱秘小環(huán)藻的生長(zhǎng)促進(jìn)作用最明顯，培養(yǎng)至第7天時(shí)，藻細(xì)胞密度約為對(duì)照組的1.4～1.6倍。各濃度的氨芐青霉素對(duì)隱秘小環(huán)藻均無(wú)抑制作用，各處理組與對(duì)照組的藻細(xì)胞密度無(wú)顯著差異(p>0.05)(見(jiàn)圖1 E)。隱秘小環(huán)藻對(duì)氯霉素極其敏感，當(dāng)濃度為200 μg·mL-1時(shí)，就能顯著抑制其生長(zhǎng)，隨著濃度升高，抑制程度也增強(qiáng)，培養(yǎng)至第5天時(shí)，藻液變白，藻細(xì)胞死亡(見(jiàn)圖1F)。

隱秘小環(huán)藻對(duì)鹽酸環(huán)丙沙星的耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(見(jiàn)圖1 G)，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著濃度升高、時(shí)間延長(zhǎng)，鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)隱秘小環(huán)藻的抑制效果越來(lái)越顯著。培養(yǎng)至第3天時(shí)，濃度為25 μg·mL-1的鹽酸環(huán)丙沙星處理組，藻細(xì)胞密度為4.175×105cells·mL-1，比對(duì)照組降低了3.8%左右，培養(yǎng)至第7天時(shí)，藻細(xì)胞密度比對(duì)照組降低了16.4%左右。綜合考慮，在用鹽酸環(huán)丙沙星除菌時(shí)，建議使用濃度25 μg·mL-1的鹽酸環(huán)丙沙星處理3 d。

2.2 單一抗生素除菌后藻液細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終確定分別使用600 μg·mL-1硫酸慶大霉素、600 μg·mL-1硫酸新霉素、800 μg·mL-1硫酸鏈霉素、800 μg·mL-1硫酸卡那霉素和800 μg·mL-1氨芐青霉素進(jìn)行除菌?？股靥幚砬昂笤逡杭?xì)菌多樣性指數(shù)比較結(jié)果顯示(見(jiàn)表2)，與未經(jīng)抗生素處理相比，各抗生素處理后各項(xiàng)指數(shù)均下降，這說(shuō)明抗生素處理后藻液中細(xì)菌多樣性和細(xì)菌豐富度均降低。

表2 單一抗生素處理前后隱秘小環(huán)藻藻液中細(xì)菌群落α-多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity index of the bacteria communities in algae liquid of Cyclotella cryptica before and after single antibiotic treatment

具體分析各處理組的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示不同抗生素處理的細(xì)菌群落組成明顯不同。對(duì)照組中隱秘小環(huán)藻的優(yōu)勢(shì)菌門為Proteobacteria(變形菌門)、Planctomycetes(浮霉菌門)和Bacteroidetes(擬桿菌門)，其相對(duì)豐度分別為43.87%、30.22%和25.40%(見(jiàn)圖2 A)?？股靥幚砗螅魈幚斫M優(yōu)勢(shì)菌門均為Cyanobacteria(藍(lán)細(xì)菌門)，其豐度由原來(lái)的0.21%增加至66.02%～87.08%，變形菌門細(xì)菌相對(duì)豐度在5.90%～20.29%之間；浮霉菌門細(xì)菌相對(duì)豐度在0.95%～5.80%之間；擬桿菌門細(xì)菌相對(duì)豐度在4.05%～8.27%之間。原優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)豐度均顯著降低。

具體到屬水平上(見(jiàn)圖2 B)，對(duì)照組中Roseimaritima(玫瑰菌屬)、Marinibacterium(海桿菌屬)、Muricauda(鼠尾菌屬)、Halomonas(鹽單胞菌屬)和Alii-diomarina是隱秘小環(huán)藻藻液中5個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬，占總細(xì)菌的97%以上。而在抗生素處理后，藍(lán)細(xì)菌門的Oxyphotobacteria_unclassified則成為占比最高的細(xì)菌屬，豐度最低的氨芐青霉素處理組為66.02%，最高的硫酸鏈霉素處理組為87.08%?？股靥幚砗驛liidio-marina相對(duì)豐度也顯著增加，以氨芐青霉素處理組的變化最為顯著，由對(duì)照組的1.33%增加至13.40%。而Marinibacterium、Roseimaritima、Muricauda、Halomonas四個(gè)原有的優(yōu)勢(shì)屬在抗生素處理后相對(duì)豐度均降低。氨芐青霉素處理組Marinibacterium相對(duì)豐度僅為0.22%，顯著低于其他處理組。硫酸卡那霉素處理組和硫酸慶大霉素處理組中Roseimaritima相對(duì)豐度最低，分別由對(duì)照組的30.20%降低至0.95%和0.99%。硫酸鏈霉素處理組和硫酸卡那霉素處理組中的Muricauda相對(duì)豐度分別為4%和4.34%，也顯著低于其他處理組。氨芐青霉素處理組中的Halomonas相對(duì)豐度為5.82%，其他處理組該屬細(xì)菌的相對(duì)豐度在0.6%～0.7%，均顯著低于對(duì)照組。結(jié)果表明，不同抗生素抑菌能力存在明顯的種屬差異性。

2.3 抗生素組合的除菌效果及分析

根據(jù)單一抗生素處理前后藻液細(xì)菌多樣性及菌群結(jié)構(gòu)變化情況，選擇對(duì)隱秘小環(huán)藻藻液中優(yōu)勢(shì)菌抑菌作用最顯著的硫酸慶大霉素(600 μg·mL-1)、硫酸卡那霉素(800 μg·mL-1)和硫酸鏈霉素(800 μg·mL-1)組合進(jìn)行除菌。3種抗生素組合處理后，涂板檢驗(yàn)仍存在少量細(xì)菌，經(jīng)鑒定均為擬桿菌門的Muricaudasp.。針對(duì)Muricaudasp.，又追加對(duì)該菌具有顯著抑制作用的鹽酸環(huán)丙沙星來(lái)進(jìn)行處理。

首先，同時(shí)添加4種抗生素除菌后，經(jīng)涂板檢驗(yàn)，平板上未出現(xiàn)細(xì)菌。SYBR Green Ⅰ染色結(jié)果顯示無(wú)細(xì)菌。但除菌后的隱秘小環(huán)藻無(wú)法傳代培養(yǎng)，接種到新鮮無(wú)菌培養(yǎng)基后藻液變白，藻細(xì)胞死亡。說(shuō)明這一組合除菌方式對(duì)藻細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)，不適用于隱秘小環(huán)藻的無(wú)菌化處理。

隨后，采用先添加3種抗生素除菌，離心洗滌除去抗生素，重新接種到新鮮培養(yǎng)基，再添加鹽酸環(huán)丙沙星除菌，經(jīng)涂板檢驗(yàn)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，而未處理的對(duì)照組平板上出現(xiàn)大量細(xì)菌(見(jiàn)圖3)。SYBR Green Ⅰ染色20 min，在熒光顯微鏡下未觀察到被染色的細(xì)菌。除菌后的隱秘小環(huán)藻多次傳代培養(yǎng)后也未觀察到細(xì)菌(見(jiàn)圖4)。這表明該抗生素組合除菌方式用于隱秘小環(huán)藻的無(wú)菌化處理是可行的。

2.4 帶菌藻株和無(wú)菌藻株的生長(zhǎng)情況

連續(xù)培養(yǎng)初始細(xì)胞密度相同的帶菌藻株和無(wú)菌藻株8 d，與帶菌藻株相比，無(wú)菌隱秘小環(huán)藻培養(yǎng)液中藻細(xì)胞懸浮性較好，而帶菌藻株培養(yǎng)液中藻細(xì)胞容易沉底。2種培養(yǎng)液的藻細(xì)胞密度均呈現(xiàn)相似的增長(zhǎng)趨勢(shì)(見(jiàn)圖5)，但無(wú)菌藻株細(xì)胞密度總是低于帶菌藻株，培養(yǎng)至第8天，帶菌藻株的細(xì)胞密度為1.117×106cells·mL-1，無(wú)菌藻株的細(xì)胞密度為9.333×105cells·mL-1，無(wú)菌藻株比帶菌藻株的生長(zhǎng)量低16.4%左右。

3 討論

抗生素法作為一種常用的除菌方式被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室條件下微藻的無(wú)菌化處理，利用抗生素除菌的關(guān)鍵是選擇對(duì)微藻毒害作用小且能有效除菌的抗生素。本研究比較了6種常用抗生素對(duì)隱秘小環(huán)藻生長(zhǎng)的影響以及對(duì)藻液中細(xì)菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)氯霉素嚴(yán)重抑制隱秘小環(huán)藻的生長(zhǎng)，除氯霉素和氨芐青霉素外，其他抗生素均能促進(jìn)隱秘小環(huán)藻生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，藻液中細(xì)菌對(duì)濃度為600～800 μg·mL-1的抗生素敏感。Cao等[25]研究表明，抗生素的添加對(duì)微藻生長(zhǎng)的促進(jìn)作用與微藻培養(yǎng)液中有害菌被抑制有關(guān)，且500 μg·mL-1氨芐青霉素能夠改善球等鞭金藻的光合活性，從而促進(jìn)其生長(zhǎng)。在Zhong等[26]的研究中，高濃度抗生素會(huì)降低藻細(xì)胞的葉綠素a含量，同時(shí)使藻細(xì)胞中活性氧水平快速增加，這是導(dǎo)致微藻生長(zhǎng)受到抑制的重要原因。某些抗生素對(duì)微藻的影響還具有雙重性，例如，高濃度(5～100 μg·L-1)的阿奇霉素會(huì)削弱蛋白核小球藻的光合活性，造成氧化損傷，抑制生長(zhǎng)，而低濃度時(shí)(0.5和1 μg·L-1)反而會(huì)刺激小球藻生長(zhǎng)[27]。青霉素在500 μg·mL-1時(shí)會(huì)抑制普通小球藻和蛋白核小球藻生長(zhǎng)[28]，而本研究中800 μg·mL-1的氨芐青霉素對(duì)隱秘小環(huán)藻無(wú)影響。由此可見(jiàn)，除菌抗生素種類及濃度與微藻種類密切相關(guān)。

本研究根據(jù)微藻對(duì)不同抗生素的耐受性實(shí)驗(yàn)以及藥敏實(shí)驗(yàn)，確定了除菌抗生素種類及作用濃度，并對(duì)抗生素處理前后藻液細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)與未經(jīng)抗生素處理相比，抗生素處理后藻液中細(xì)菌OTU數(shù)量大幅減少且細(xì)菌多樣性降低，且不同抗生素對(duì)隱秘小環(huán)藻藻液中細(xì)菌的抑制效果存在種屬的特異性。如硫酸鏈霉素能降低隱秘小環(huán)藻中擬桿菌門細(xì)菌Muricauda的相對(duì)豐度，硫酸卡那霉素對(duì)浮霉菌門細(xì)菌Roseimaritima的抑制作用最強(qiáng)，硫酸慶大霉素能抑制大部分變形菌門細(xì)菌，如Marinibacterium、Halomonas、Aliidiomarina。以上3種抗生素對(duì)隱秘小環(huán)藻的優(yōu)勢(shì)菌具有很好的抑制效果。

在微藻無(wú)菌化過(guò)程中，抗生素組合除菌通常比單種抗生素除菌效果更佳。Su等[29]采用了慶大霉素、鏈霉素、頭孢菌素(各100 μg·mL-1)和利福平(10 μg·mL-1)的抗生素組合進(jìn)行除菌，成功獲得了塔瑪亞歷山大藻的無(wú)菌培養(yǎng)物。本研究首先選擇硫酸慶大霉素(600 μg·mL-1)、硫酸卡那霉素(800 μg·mL-1)和硫酸鏈霉素(800 μg·mL-1)的抗生素組合用于隱秘小環(huán)藻的無(wú)菌化處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論采用單種抗生素逐一添加還是3種抗生素同時(shí)添加的方式，無(wú)菌檢驗(yàn)后總有Muricauda屬細(xì)菌存在。鑒于該屬細(xì)菌對(duì)環(huán)丙沙星敏感[30]，故后續(xù)除菌時(shí)追加25 μg·mL-1鹽酸環(huán)丙沙星。但是同時(shí)添加4種抗生素除菌并未獲得無(wú)菌藻株，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中藻細(xì)胞逐漸變白直至死亡。考慮到同時(shí)添加4種抗生素對(duì)藻細(xì)胞造成了嚴(yán)重?fù)p傷，本研究首先用600 μg·mL-1硫酸慶大霉素、800 μg·mL-1硫酸卡那霉素和800 μg·mL-1硫酸鏈霉素的抗生素組合除菌后，收集藻細(xì)胞并用無(wú)菌水沖洗數(shù)次，以消除存留的抗生素，再追加鹽酸環(huán)丙沙星除菌，最終獲得了隱秘小環(huán)藻的無(wú)菌藻株。以上結(jié)果說(shuō)明，在使用抗生素進(jìn)行微藻的無(wú)菌化處理時(shí)，抗生素的添加方式也是成功獲得無(wú)菌藻株的重要因素。

除菌后的隱秘小環(huán)藻進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)，排除抗生素的影響，比較其生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示與帶菌藻株相比，無(wú)菌藻株的生長(zhǎng)速率較低，培養(yǎng)8 d的細(xì)胞密度要顯著低于未除菌對(duì)照組。這與Scholz等[8]研究結(jié)果一致，未除菌的Naviculapalpebralis生長(zhǎng)速度比無(wú)菌藻株高29%。這表明抗生素處理在除去抑制藻類生長(zhǎng)細(xì)菌的同時(shí)可能也殺死了部分能夠促進(jìn)藻類生長(zhǎng)的有益菌。這些有益菌通過(guò)分泌植物激素或?qū)⒂袡C(jī)營(yíng)養(yǎng)物礦化為無(wú)機(jī)物的方式促進(jìn)藻類生長(zhǎng)[31-32]。關(guān)于隱秘小環(huán)藻相關(guān)細(xì)菌對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響還需通過(guò)菌藻共培養(yǎng)進(jìn)行深入研究。