良驗益真咀嚼片高效液相色譜指紋圖譜的建立及4種成分的含量測定

馬群，姚東，胡北，許子華（北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，沈陽 110000）

我國寒區(qū)面積廣闊，涵蓋東北、西北、華北，約占我國陸地面積的43.5%。我國東、北、西分別與朝鮮、俄羅斯、蒙古、巴基斯坦、印度接壤，邊境線長，是國防戰(zhàn)略要地。北部戰(zhàn)區(qū)所轄的東北地區(qū)冬季寒冷期長、氣溫極低、氣候條件惡劣，這種極端環(huán)境給官兵在戶外訓(xùn)練、執(zhí)行任務(wù)帶來了極大困難[1]。為了解決上述困難，本課題組依據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，利用中藥“治未病”的特色優(yōu)勢，將寒冷損傷的醫(yī)學(xué)干預(yù)前移，尋找具有機(jī)體產(chǎn)熱作用、能夠抵御寒冷、在寒冷環(huán)境下能夠維持機(jī)體正常生理機(jī)能的有效中藥方劑[2]。課題組通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接等藥物虛擬篩選技術(shù)[3]，選取了中醫(yī)經(jīng)典理論中具有溫里散寒之功的良驗益真方。此方源自唐代中醫(yī)古籍《元和紀(jì)用經(jīng)》中的良驗益真散，由黃芪和肉桂兩味藥材組成，具有補(bǔ)火散寒、溫腎之功效，及防治凍傷、促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)熱之作用。方中以黃芪健脾益氣，使清氣升，精血得攝；以肉桂補(bǔ)火助陽，散寒；黃芪和肉桂先、后天互補(bǔ)，可使血止而真氣得復(fù)。黃芪和肉桂的藥效在既往的藥理學(xué)研究中也得到了驗證[4-6]。在前期研究確證其具有產(chǎn)熱功效的基礎(chǔ)上，課題組經(jīng)過系統(tǒng)深入的藥效、安全性、質(zhì)量控制和制備工藝研究，結(jié)合現(xiàn)代中藥制劑的研究技術(shù)及各劑型的特點，以甘露醇、糊精作為輔料，研制開發(fā)了基于機(jī)體產(chǎn)熱作用的提升寒區(qū)適應(yīng)能力和戰(zhàn)斗效能、預(yù)防寒冷損傷的北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院院內(nèi)制劑——良驗益真咀嚼片。本制劑服用運(yùn)攜方便、質(zhì)量穩(wěn)定，在冷暴露前后服用，可提高人體核心體溫，促進(jìn)肢端能力的恢復(fù)。

中藥指紋圖譜作為衡量制劑質(zhì)量的重要依據(jù)[7-8]，是一種綜合的、宏觀的、可量化的手段，可反映中藥化學(xué)成分的整體組成和特征。為保證良驗益真咀嚼片的質(zhì)量，本研究按照中藥指紋圖譜研究的技術(shù)要求[9-10]，建立了該制劑的HPLC指紋圖譜，同時測定了制劑中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素及桂皮醛4 種成分的含量，為良驗益真咀嚼片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-16 系列高效液相色譜儀（配有SPD-16 型紫外檢測器、LC-16 型二元泵、SIL-16 型自動進(jìn)樣器、CTO-16 型柱溫箱）（日本Shimadzu 公司）；AUW 120D 十萬分之一分析天平（日本Shimadzu公司）；KQ3200 型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司，150 W，40 kHz）。

1.2 試藥

良驗益真咀嚼片[規(guī)格：每片重0.55 g（相當(dāng)于飲片0.51 g），批號：20210607、20210608、20210609、20210610、20210611、20210615、20210617、20210621、20210623、20210628、20210701、20210705，北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院制劑研發(fā)室制備]；黃芪、肉桂[九洲恒源（安國）藥業(yè)有限公司]；甲醇、乙腈（色譜級，Sigma Aldrich，USA）；甲酸（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；超純水（北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院制劑室）。

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號：wkq 21010405，純度≥98%）、芒柄花素對照品（批號：wkq20062208，純度≥98%）、芒柄花苷對照品（批號：wkq19070106，純度≥98%）、毛蕊異黃酮對照品（批號：wkq20100906，純度≥98%）（四川維克奇生物科技有限公司），肉桂酸對照品（批號：110786-200503，純度：98.8%）、桂皮醛對照品（批號：110710-202022，純度：99.5%）（中國食品藥品檢定研究院）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Phenomenex Luna 5u C18（2）100A（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.2%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫方案見表1；流速0.8 mL·min－1；檢測波長290 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫方案Tab 1 Gradient elution

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 取各對照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加入適量甲醇溶解，后用甲醇定容至刻度，作為各對照品儲備液。精密量取適量各對照品儲備液，加甲醇制成每1 mL 分別含有毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、肉桂酸、桂皮醛80、80、150、20、10、10 μg 的溶液，即得混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 將良驗益真咀嚼片研磨成細(xì)粉，取5 g，精密稱定置于具塞錐形瓶中，加入25 mL 甲醇，稱重，超聲20 min，放冷后甲醇補(bǔ)重，搖勻后靜置10 min，取上清液，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 單味藥供試品溶液的制備 按照良驗益真咀嚼片制法中的藥材提取工藝分別制備黃芪、肉桂單味藥的提取濃縮液，各精密吸取1 mL 置于10 mL 量瓶中，使用甲醇定容后搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液得到單味藥供試品溶液。

2.3 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 精密度考察 取良驗益真咀嚼片樣品（批號：20210615，S6），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次。以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為參照峰，計算得各共有峰的相對保留時間RSD＜0.71%，相對峰面積RSD＜2.7%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性考察 取良驗益真咀嚼片樣品（S6），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，于0、2、6、12、24、48 h 進(jìn)樣測定。以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為參照峰，計算得其他各共有峰的相對保留時間RSD＜0.59%，相對峰面積RSD＜2.4%，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性考察 取良驗益真咀嚼片樣品（S6），按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣測定。以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為參照峰，計算得其他各共有峰的相對保留時間RSD＜0.24%，相對峰面積RSD＜2.8%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4 良驗益真咀嚼片HPLC 指紋圖譜研究

2.4.1 指紋圖譜的構(gòu)建 取12 批良驗益真咀嚼片（S1 ～S12），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。將色譜圖導(dǎo)入中國藥典委員會開發(fā)的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012A 版）軟件進(jìn)行分析，選擇S6作為參照圖譜，以平均數(shù)法生成對照圖譜，時間窗寬度為0.1 min，經(jīng)多點校正、Mark 峰匹配、自動匹配后生成對照指紋圖譜[11-13]，見圖1。以峰面積較大、對稱性較好的2 號峰（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）作為參照峰，計算得其他各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表2、3。

表2 12 批良驗益真咀嚼片共有峰的相對保留時間Tab 2 Relative retention time of common peaks of 12 batches of Liangyan Yizhen chewable tablets

圖1 12 批次良驗益真咀嚼片指紋圖譜（S1 ～S12）及其對照指紋圖譜（R）Fig 1 Fingerprints of 12 batches of Liangyan Yizhen chewable tablets（S1 ～S12）and control（R）

2.4.2 共有峰的歸屬與指認(rèn) 分別取“2.2.3”項下單味藥供試品溶液和“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，確認(rèn)共有13 個共有峰，結(jié)果如圖2 所示。經(jīng)對照品保留時間定位及色譜峰分析，共指認(rèn)出6 個特征峰，2 號峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷、6 號峰為芒柄花苷、8 號峰為毛蕊異黃酮、9 號峰為肉桂酸、10號峰為桂皮醛、12 號峰為芒柄花素。其中，1 ～8號、11 ～13 號峰來源于黃芪，9、10 號峰來源于肉桂。

圖2 良驗益真咀嚼片共有峰歸屬Fig 2 Common peak attribution of Liangyan Yizhen chewable tablets

2.4.3 指紋圖譜相似度評價 將12 批良驗益真咀嚼片（S1 ～S12）指紋圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012A 版），生成對照指紋圖譜并計算相似度，見表4。結(jié)果顯示12 批良驗益真咀嚼片樣品相似度均大于0.9，說明良驗益真咀嚼片批次間一致性良好。

表4 12 批良驗益真咀嚼片指紋圖譜相似度結(jié)果Tab 4 Fingerprint similarity of 12 batches of Liangyan Yizhen chewable tablets

2.5 4 種成分含量測定

2.5.1 專屬性考察 取“2.2.1”項下毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、桂皮醛、芒柄花素對照品儲備液適量，使用甲醇配制成每1 mL 分別含有毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、桂皮醛、芒柄花素80、150、10、80 μg 的混合對照品溶液。取混合對照品溶液和供試品溶液，分別進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示供試品溶液的色譜圖中4 種待測組分色譜峰保留時間與混合對照品溶液一致，且分離度均大于1.5，結(jié)果見圖3。

圖3 良驗益真咀嚼片的HPLC 色譜圖Fig 3 HPLC chromatogram of Liangyan Yizhen chewable tablets

表3 12 批良驗益真咀嚼片共有峰的相對峰面積Tab 3 Relative peak areas of common peaks of 12 batches of Liangyan Yizhen chewable tablets

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項下毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、桂皮醛、芒柄花素對照品儲備液適量，用甲醇配制成一系列濃度的混合對照品溶液。精密吸取上述濃度的混合對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀測定，以對照品的質(zhì)量濃度（μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，求得回歸方程，結(jié)果見表5。

表5 4 種成分線性關(guān)系Tab 5 Linearity of 4 constituents

2.5.3 精密度試驗 取“2.5.1”中濃度的混合對照品溶液，進(jìn)樣測定6 次，記錄各成分的峰面積，計算得到毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、桂皮醛、芒柄花素峰面積的RSD分別為1.9%、2.1%、2.2%、1.7%，結(jié)果表明該儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 取良驗益真咀嚼片（S6），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，于0、2、6、12、24、48 h 進(jìn)行測定，計算得到毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、桂皮醛、芒柄花素峰面積的RSD分別為0.72%、1.9%、1.7%、2.0%，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗 取同一批良驗益真咀嚼片（S6），按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣測定，計算得到毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、桂皮醛、芒柄花素的平均含量分別為0.3525、0.4038、0.0327、0.1945 mg·g－1，RSD分別為0.54%、0.84%、0.97%、1.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收試驗 取已知成分含量的良驗益真咀嚼片（S6），研成細(xì)粉，取2.5 g，共6 份，精密稱定，分別精密加入毛蕊異黃酮葡萄糖苷溶液（0.3916 mg·mL－1）2.2 mL、芒柄花苷溶液（0.294 mg·mL－1）3.4 mL、桂皮醛溶液（0.4199 mg·mL－1）0.2 mL、 芒柄花素溶液（0.4028 mg·mL－1）1.2 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，計算得到毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、桂皮醛、芒柄花素的平均加樣回收率分別為103.71%、102.33%、101.49%、101.51%，RSD分別為1.8%、1.8%、2.8%、2.9%，表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.5.7 樣品含量測定 取各批次良驗益真咀嚼片，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，計算樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、桂皮醛、芒柄花素4 種成分的含量，結(jié)果見表6。

表6 12 批樣品中4 種成分含量測定結(jié)果(mg·g－1，n ＝2)Tab 6 Content determination of 4 constituents in 12 batches of sample (mg·g－1，n ＝2)

3 討論

3.1 定量指標(biāo)的選擇

本研究使用對照品指認(rèn)出毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、肉桂酸、桂皮醛6 個成分。其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮來自黃芪，毛蕊異黃酮葡萄糖苷是藥典中黃芪的指標(biāo)性成分；肉桂酸、桂皮醛來自肉桂，桂皮醛是藥典中肉桂的指標(biāo)性成分[14]。毛蕊異黃酮與肉桂酸的色譜峰相鄰，由于二者色譜峰的分離度不佳，不能滿足定量要求，因此未對其定量。綜上所述，選擇了毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、桂皮醛作為該制劑的定量指標(biāo)，涵蓋了黃芪和肉桂兩味藥材的指標(biāo)性成分。

3.2 色譜條件的考察

在確定檢測波長的試驗中，對毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、肉桂酸、桂皮醛、芒柄花素對照品的甲醇溶液進(jìn)行了全波長掃描，發(fā)現(xiàn)它們的最大吸收波長分別為260、302、220、270、290、248 nm[15-16]，通過多波長掃描試驗，最終選定波長為290 nm，在此波長下，良驗益真咀嚼片中的6 個主要成分均有較好的紫外吸收，同時雜質(zhì)對色譜峰的干擾較小。其他色譜條件優(yōu)化試驗中，主要考察的是流動相種類（乙腈、甲醇）、添加劑的種類（0.1%磷酸、0.3%磷酸、0.1%甲酸、0.2%甲酸）、流速、梯度洗脫比例等方面[15-16]。通過預(yù)試驗，發(fā)現(xiàn)流動相的種類、流速、梯度洗脫比例對色譜峰的分離情況影響較大，添加劑的種類與濃度對色譜峰的峰形有一定影響，最終選定流動相為0.2%甲酸水溶液-乙腈進(jìn)行梯度洗脫，各主要成分均能較好的分離，色譜行為較好。最終確定的色譜條件實現(xiàn)了指紋圖譜的建立和多成分含量的同時測定。

3.3 供試品溶液制備溶劑的考察

本研究中供試品溶液的制備采用超聲提取法，對溶劑種類（甲醇、水）、溶劑（純甲醇、75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇、純水）進(jìn)行了考察[17]，根據(jù)試驗結(jié)果，最終確定純甲醇為最佳提取溶劑，此條件下各成分含量均較高，且色譜分離效果很好，溶劑效應(yīng)較小。

4 結(jié)論

首次建立了良驗益真咀嚼片的HPLC 指紋圖譜及4 種成分的含量測定方法，此方法準(zhǔn)確、可靠，可為良驗益真咀嚼片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和評價提供參考。