高效液相色譜法測定奧氮平雙羥萘酸鹽一水合物中二甲基亞砜和二甲基甲酰胺的殘留量

王錦，周三云，曹婉，高喜樂，王艷娟，李龍英（浙江圣兆藥物科技股份有限公司，杭州 310051）

精神分裂癥因其特殊性需長期治療，目前給藥依從性差是精神分裂癥長期治療的主要問題，禮來制藥公司將活性成分奧氮平和雙羥萘酸結(jié)合生成一種難溶性化合物（奧氮平雙羥萘酸鹽一水合物），該難溶性化合物在注入肌肉后形成藥物儲庫，持續(xù)緩慢地釋放奧氮平，以達到延長給藥周期的目的，解決了依從性差的問題，具有臨床優(yōu)勢[1]，目前已在歐洲（商品名：Zypadhera）和美國（商品名：Zyprexa Relprevv）上市[2]。

原料藥奧氮平雙羥萘酸鹽一水合物僅收錄于歐洲藥典[3]，《中國藥典》尚未收載。目前合成該原料藥的工藝溶劑主要有二甲基亞砜（DMSO）和二甲基甲酰胺（DMF），因二者的沸點較高，生產(chǎn)工藝中通過水洗較難去除完全，《中國藥典》2020年版四部通則中0861 殘留溶劑測定法[4]和ICH Q3C（R5）均將DMSO 和DMF 分別列為第三類溶劑和第二類溶劑，限度依次為0.5%、0.088%。本文根據(jù)公司實際使用需要，將原料藥奧氮平雙羥萘酸鹽一水合物中DMSO 限度收嚴至0.3%。目前有多篇文獻報道了DMF 或DMSO殘留量的檢測方法，均采用氣相色譜法[5-10]。奧氮平雙羥萘酸鹽一水合物熔點高達210℃且熔融分解，極易污染氣相色譜柱，氣相直接進樣不適用于該品種；而DMSO 和DMF 沸點較高，頂空進樣同樣不適用；DMSO 與DMF 沸點極性相近，氣相色譜較難實現(xiàn)兩者的完全分離，已報道文獻不能同時檢出這兩種組分。另有文獻報道了水和廢水中的DMF、DMAC、DMSO 的HPLC 分析方法[11]，但因水和廢水與奧氮平雙羥萘酸鹽一水合物性質(zhì)差異較大，該文獻方法中的樣品處理及色譜系統(tǒng)均不適用于奧氮平雙羥萘酸鹽一水合物中DMSO 和DMF 的檢測，目前尚未見奧氮平雙羥萘酸鹽一水合物中DMSO 和DMF 殘留量檢測方法的文獻報道。本文建立了一種測定奧氮平雙羥萘酸鹽一水合物中DMSO 和DMF 殘留量的高效液相色譜方法，完成了方法學驗證，該方法專屬性好，簡便靈敏，準確，具有較好的參考價值和現(xiàn)實意義。

1 材料

WATERS Arc 高效液相色譜儀（配有紫外檢測器，美國Waters 公司）；MSA225S-1CE-DA 電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）。

奧氮平雙羥萘酸鹽一水合物（浙江圣兆藥物科技股份有限公司，批號分別為P-3M、P-4M、P-5M）；正己胺、甲醇（色譜級，TEDIA）；DMSO[色譜級，GC 測定純度≥99.9%，阿拉丁試劑（上海）有限公司]；DMF（色譜級，HPLC 測定純度≥99.9%，TEDIA）；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse RX C8（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃；紫外檢測器；波長：210 nm；流速：0.75 mL·min－1；進樣量：10 μL；流動相：水（A）和甲醇（B），梯度洗脫（0 ～8 min，10%B，8 ～15 min，10%B →90%B，15 ～20 min，90%B，20 ～20.1 min，90%B →10%B，20.1 ～30 min，10%B）。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品儲備液 取DMSO 約1500 mg、DMF 約440 mg，精密稱定，置于100 mL 量瓶內(nèi)，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密移取上述溶液1 mL，置于50 mL 量瓶內(nèi)，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL 中含DMSO、DMF 約300 μg、88 μg 的對照品儲備液。

2.2.2 對照品溶液 精密移取對照品儲備液1 mL，置20 mL 量瓶中，用5%正己胺甲醇溶液（以下簡稱稀釋劑）稀釋至刻度，得到每1 mL 中含DMSO、DMF 約15 μg、4.4 μg 的對照品溶液。

2.2.3 樣品溶液 準確稱取適量樣品，加稀釋劑溶解并稀釋制成每1 mL 中含樣品約5 mg 的溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

依次取稀釋劑進樣1 次、對照品溶液連續(xù)進樣6 次，記錄色譜圖，結(jié)果稀釋劑在DMSO 和DMF保留時間處均無干擾峰，DMSO 峰面積和DMF 峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為1.5%和1.0%，DMSO 峰和DMF 峰的分離度均大于1.5，證明該方法系統(tǒng)適用性良好。

2.4 專屬性試驗

依次取稀釋劑、對照品溶液及樣品溶液分別進樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，溶劑及樣品溶液在DMSO 和DMF 保留時間處均無干擾，各組分分離良好，方法專屬性好，見圖1。

圖1 專屬性試驗色譜圖Fig 1 Chromatograms of specificity test

2.5 檢測限和定量限

精密量取對照品溶液用稀釋劑稀釋制成系列濃度溶液，取上述系列濃度溶液10 μL 注入色譜儀，當DMSO 和DMF 信噪比（S/N）為10 時，計算DMSO 和DMF 的定量限分別為15.284 ng 和8.842 ng。取定量限溶液，連續(xù)進樣6 針，DMSO和DMF 峰面積RSD分別為1.3%、0.70%。

當DMSO 和DMF 的信噪比（S/N）為3 時，計算DMSO 和DMF 的檢測限分別為4.58 ng 和2.65 ng。

2.6 線性關系考察

分別量取對照品儲備液適量，用稀釋劑稀釋制成DMSO 質(zhì)量濃度為1.517、3.035、7.587、15.174、22.760、30.347、37.934 mg·L－1，DMF 質(zhì)量濃度為0.882、2.206、4.412、6.618、8.824 mg·L－1的系列混合對照品溶液。分別進樣分析，記錄色譜圖。以峰面積Y為縱坐標，質(zhì)量濃度X（mg·L－1）為橫坐標，進行線性回歸。

得DMSO 線性方程：Y＝9.243×103X－652.5，相關系數(shù)為0.9996，表明DMSO 在1.517 ～37.934 mg·L－1內(nèi)，峰面積與質(zhì)量濃度線性關系良好。DMF 線性方程：Y＝4.964×104X－2.092×103，相關系數(shù)為0.9998；表明DMF 在0.882 ～8.824 mg·L－1內(nèi)，峰面積與質(zhì)量濃度線性關系良好。

2.7 回收試驗

分別量取對照品儲備液適量，用稀釋劑稀釋制成DMSO 質(zhì)量濃度為1.527、7.634、15.084、30.347 mg·L－1，DMF 質(zhì)量濃度為0.0824、2.206、4.412、5.295 mg·L－1的系列混合對照品溶液。精密稱取12 份已測定DMSO 和DMF 殘留量的樣品約50 mg，每組3 份，用上述系列混合對照品溶液定容至10 mL。進樣，記錄色譜圖，計算DMSO、DMF 回收率。結(jié)果不同質(zhì)量濃度DMSO 的平均回收率在95.2%～119.4%，RSD在0.28%～2.2%；不同質(zhì)量濃度DMF 的平均回收率在97.6% ～99.5%，RSD在0.31% ～1.4%。表明該方法下DMSO 和DMF 的回收率良好。

2.8 重復性試驗

取奧氮平雙羥萘酸鹽一水合物6 份，按照“2.2.3”項下方法配制后進樣測定，DMSO 和DMF含量分別為0.0754%和0.0038%，RSD分別為1.2%和8.2%，結(jié)果表明方法重復性好。

2.9 耐用性考察

考察了流速為0.65 mL·min－1和0.85 mL·min－1，柱溫為33℃和37℃，起始流動相中有機相比例為8%和12%下的系統(tǒng)適用性，結(jié)果在上述各條件下，連續(xù)進樣6 針對照品溶液的DMSO、DMF 峰面積RSD均小于5%，DMSO 和DMF 理論塔板數(shù)均大于2000，拖尾因子均小于2.0，各色譜峰間的分離度均大于1.5，結(jié)果表明方法耐用性良好。

2.10 溶液穩(wěn)定性

取對照品溶液，于室溫下放置，分別在0、24、55 h 進樣測定，記錄各組分的峰面積，計算DMSO 和DMF 峰面積RSD分別為1.0%、0.68%，表明對照品溶液在室溫下放置55 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.11 樣品的測定

取3 批奧氮平雙羥萘酸鹽一水合物，按“2.2.3”項下方法配制測試，結(jié)果見表1。

表1 樣品檢測結(jié)果Tab 1 Content of sample

3 結(jié)論

本文建立了同時測定難溶性藥物奧氮平雙羥萘酸鹽一水合物中DMSO 和DMF 殘留量的高效液相色譜法，該方法可實現(xiàn)DMSO 和DMF 的完全分離，且樣品處理簡單，所需樣品量少，對色譜系統(tǒng)、色譜柱無損害，操作方便，準確度和重復性好，可實現(xiàn)奧氮平雙羥萘酸鹽一水合物中DMSO 和DMF 殘留量的準確定量，為其他藥物中高沸點殘留溶劑的測定提供了思路和參考。