中藥材大薊及混偽品的傅里葉變換紅外光譜鑒別研究

單圣男，解玫瑩，王蘭，魏夢(mèng)凌，劉想晴，程旺興*（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥20012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥資源保護(hù)與開發(fā)研究所，合肥 20012；.安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)系，安徽 蕪湖241002）

我國(guó)的中藥資源種類豐富多樣，且中藥材根源繁雜，為了確保中藥在臨床使用的有效性和安全性，對(duì)中藥進(jìn)行鑒別和質(zhì)量控制十分重要。大薊為菊科植物薊（Cirsium japonicumFisch.ex DC.）的干燥地上部分，味甘、苦，性涼，具有涼血止血、散瘀解毒消癰的功效[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)表明大薊具有凝血止血、降血壓、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、抗糖尿病、抑菌等藥理活性[2-5]。大薊的化學(xué)成分復(fù)雜多樣，主要有黃酮及黃酮苷類、長(zhǎng)鏈烯炔醇類、木脂素類、甾醇類和揮發(fā)油類等。研究表明，蒙花苷和柳穿魚葉苷等成分是大薊發(fā)揮凝血止血作用的主要活性物質(zhì)[6]。大薊在我國(guó)分布廣泛，以江蘇、浙江、四川分布最多[7]。大薊既是傳統(tǒng)中藥，又是現(xiàn)代臨床常用中藥；市場(chǎng)上存在著大薊的野生品、栽培品以及部分偽品，目前市場(chǎng)上主要的大薊混偽品有大薊同科同屬的小薊及同科不同屬的奶薊草等；薊屬植物在形態(tài)上具有很高的相似性，《中國(guó)藥典》對(duì)大薊的性狀描述也僅以營(yíng)養(yǎng)期為主，使得大薊的鑒定困難；正品、偽品兩者的功效不同，若混淆使用，會(huì)直接影響用藥安全。因此對(duì)大薊的真?zhèn)舞b別顯得尤為重要。

常見的真?zhèn)舞b別有性狀特征鑒別、顯微鑒別、理化鑒別、分子鑒別等方法[8]。性狀鑒別雖過程簡(jiǎn)單，成本低廉，但主觀和經(jīng)驗(yàn)主義色彩較濃，會(huì)導(dǎo)致通過量低或者結(jié)果無法量化，對(duì)鑒定結(jié)果會(huì)有影響。顯微鑒別從細(xì)微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，雖彌補(bǔ)了性狀鑒別的不足，但由于植物組織特征的相似性高[9]，憑借顯微解剖特征難以解決近緣種藥材的鑒定問題。理化鑒別既定性又定量，是評(píng)價(jià)藥材真?zhèn)涡缘奶囟?biāo)準(zhǔn)指標(biāo)，但由于目前中藥大多數(shù)有效成分不明確，且并非單一成分，因此難以規(guī)定一個(gè)合理的數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)，藥典中尚有許多藥材無定量指標(biāo)。與傳統(tǒng)方法相比，DNA 分子遺傳標(biāo)記技術(shù)能直接分析生物的基因型，且這種方式用量非常少，但目前絕大多數(shù)動(dòng)植物的DNA 序列尚未明確，加上提取的技術(shù)煩瑣和相關(guān)試驗(yàn)的周期長(zhǎng)，操作較為困難[10]。傅里葉變換紅外光譜法（FT-IR）與傳統(tǒng)鑒別方法相比具有快速、無損、易于處理、信噪比高、重復(fù)性好等特點(diǎn)[11]，廣泛應(yīng)用于鑒別食品、中草藥等混合體系[12]，中藥種類不同，其組成的化學(xué)物質(zhì)存在一定差異，運(yùn)用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)前處理，就能得到含有不同化學(xué)組成的混合物[13]，使得中藥材在化學(xué)物質(zhì)上的差別或不同表現(xiàn)在紅外光譜上，從而達(dá)到鑒別中藥材的目的。而將不同中藥材反映在紅外圖譜的差異特征轉(zhuǎn)化為可用計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)值分析的量化特征，再用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析，即可使紅外光譜的應(yīng)用向定量鑒別方向更進(jìn)一步[14]。采用FT-IR 法對(duì)大薊和易混偽品進(jìn)行鑒定的研究目前尚未見報(bào)道，本研究采用FT-IR 法對(duì)大薊及其混偽品進(jìn)行鑒別，初步建立大薊藥材的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。

1 儀器與試藥

Nicolet iN10 MX 傅里葉變換紅外光譜儀、DTGS 檢測(cè)器（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；SMART ITR 附件（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；BJ-150 型高速多功能粉碎機(jī)（合肥億心程試驗(yàn)設(shè)備有限公司）。無水乙醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

藥材樣品來源如表1 所示，將39 批樣品放入烘箱中干燥，置于打粉機(jī)中進(jìn)行粉碎，80 目篩過篩，備用。藥材均由安徽中醫(yī)藥大學(xué)楊青山老師鑒定，所收集樣品分別為菊科植物大薊、小薊和奶薊草。

表1 樣品信息Tab 1 Sample information

2 方法

2.1 原始紅外光譜的獲取

取少量樣品粉末，置于SMART ITR 附件的金剛石表面，攤平，旋轉(zhuǎn)附件旋鈕將樣品固定并壓成透明薄片。掃描波數(shù)為4000 ～500 cm－1，每次試驗(yàn)對(duì)樣品粉末進(jìn)行16 次掃描累加，掃描分辨率為4 cm－1，掃描過程中實(shí)時(shí)扣除二氧化碳和水蒸氣的干擾，得到相應(yīng)的紅外光譜圖及試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.2 原始紅外光譜圖的預(yù)處理

樣品的原始紅外光譜圖夾雜著儀器噪音和一些無效信息，會(huì)導(dǎo)致分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度下降，所以應(yīng)對(duì)原始圖譜進(jìn)行預(yù)處理，來減少各種干擾的影響。利用儀器自帶的OMNIC 9.0 分析軟件，對(duì)采集的紅外光譜圖進(jìn)行光滑處理、自動(dòng)基線校正和縱坐標(biāo)歸一化處理得到標(biāo)準(zhǔn)圖譜。

2.3 精密度試驗(yàn)

樣品連續(xù)測(cè)定5 次，得到紅外光譜圖并計(jì)算特征峰波數(shù)值RSD，結(jié)果顯示各特征峰波數(shù)值RSD均小于1.4%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

樣品每隔30 min 進(jìn)行一次光譜采集，測(cè)定5次，得到紅外光譜圖并計(jì)算特征峰波數(shù)值RSD，結(jié)果顯示各特征峰波數(shù)值RSD均小于2.6%，表明該方法的穩(wěn)定性較好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

將樣品平行制備5 份，分別測(cè)定，得到紅外光譜圖并計(jì)算特征峰波數(shù)值RSD，結(jié)果顯示各特征峰波數(shù)值RSD均小于2.4%，表明方法重復(fù)性良好。

3 方法與結(jié)果

3.1 大薊與混偽品的原始紅外光譜圖

圖1 中A、B、C 為39 批樣品經(jīng)光滑處理、自動(dòng)基線校正和坐標(biāo)歸一化后的紅外圖譜，從圖中可以看出，同一中藥材紅外光譜圖的峰形相似。

圖1 大薊及混偽品的紅外光譜匯總圖Fig 1 Infrared spectrum summary of Cirsium japonicum and its adulterants

3.2 大薊與混偽品的紅外光譜圖

圖2 為奶薊草、小薊和大薊的紅外光譜圖，大薊及其混偽品的紅外光譜圖出現(xiàn)多個(gè)吸收峰，整體上基本相似，主要吸收峰在3340 ～3270、2890、1705、1025、860 cm－1左右，吸收峰在1800 ～500 cm－1內(nèi)較為密集。3350 ～3250 cm－1頻率低譜帶寬的吸收峰推測(cè)是由氨基（—NH2）和羥基（—OH）的締合伸縮振動(dòng)引起；2975 ～2887 cm－1的吸收峰推測(cè)為烷烴C-H 伸縮振動(dòng)；2135 cm－1附近為C ≡C 鍵，1725 ～1704 cm－1附近的吸收峰推測(cè)為苯環(huán)的碳骨架伸縮振動(dòng)及C ≡N、C ＝O 等伸縮振動(dòng)[15]；1600 ～1574 cm－1為酰胺Ⅱ帶特征吸收峰；1051 ～1024 cm－1為C-O 鍵伸縮振動(dòng)；884 ～859 cm－1處推測(cè)為＝CH 的面外彎曲振動(dòng)吸收峰，636、637 cm－1為糖環(huán)骨架振動(dòng)的指紋特征峰[16]?？梢钥闯銎渲袠悠返奈辗宓奈恢煤蛷?qiáng)度具有一定的差異性。

圖2 大薊及混偽品的紅外光譜圖Fig 2 Infrared spectra of Cirsium japonicum and its adulterants

通過對(duì)藥材樣品的紅外光譜圖分析，其主要特征為：奶薊草樣品在4000 ～1800 cm－1內(nèi)只出現(xiàn)了3 個(gè)吸收峰，且在2890 cm－1和2823 cm－1處為2 個(gè)尖峰，在2500 ～1750 cm－1處相對(duì)平緩，無C ≡C 鍵，由此可以與大薊、小薊區(qū)分。小薊在2897 cm－1附近僅有1 個(gè)吸收峰，且在1250 cm－1附近出現(xiàn)多個(gè)明顯的小峰。大薊樣品的紅外光譜與偽品相比整體紅移30 個(gè)波數(shù)左右，可作為這3 種藥材的初步判斷依據(jù)。

3.3 大薊及混偽品的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜

大薊與混偽品的紅外光譜圖具有一定的差別，利用二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖可以提高譜圖的分辨率，采用二階導(dǎo)對(duì)大薊、小薊和奶薊草的紅外光譜圖進(jìn)行分析，可以使吸收峰的寬度變?yōu)樵紝挾鹊?/3，從而很好地將原始圖形中重疊的峰分離，采用Origin 進(jìn)行二階導(dǎo)，Savitsky-Golay 卷曲平滑法處理，得到特征峰明顯、噪音小的二階導(dǎo)圖譜，進(jìn)而對(duì)3 種藥材的圖譜做進(jìn)一步的觀察；在紅外圖譜中，由于在1800 cm－1之前會(huì)受—OH 的影響，而800 cm－1之后基線漂移過大[17]，因此選擇1800 ～800 cm－1進(jìn)行二階導(dǎo)處理。

大薊與偽品在1800 ～800 cm－1處的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖見圖3，三者峰形和峰強(qiáng)均有明顯差異，可用于鑒別。在1800 ～1300 cm－1和1200 ～800 cm－1處可以觀察到3 種中藥材在二階導(dǎo)圖譜上的區(qū)別：區(qū)域1 中，奶薊草的吸收峰明顯比大薊、小薊吸收峰強(qiáng)，且在區(qū)域2 中有3個(gè)明顯向上的鋸齒峰；小薊與奶薊草在區(qū)域3 處的峰形不同，小薊有2 個(gè)向上鋸齒峰，且在區(qū)域5 中的吸收峰更強(qiáng)；從區(qū)域4 和6 中可以看出在此范圍內(nèi)大薊的吸收峰相對(duì)其他圖譜紅移，且在1800 ～800 cm－1處的吸收峰相對(duì)平緩。

圖3 大薊及混偽品的二階導(dǎo)圖譜Fig 3 Second order guide map of Cirsium japonicum and its adulterants

3.4 大薊及混偽品的相似度分析

采用IBM SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)對(duì)不同產(chǎn)地的大薊進(jìn)行相似度分析，結(jié)果見表2；20 批大薊的相似度均在0.89 以上；大薊與小薊、奶薊草藥材進(jìn)行相似度分析，結(jié)果見表3，可以看出，大薊與奶薊草和小薊的相似度分別為0.421 和0.773，奶薊草與小薊的相似度為0.717；由此可知，不同產(chǎn)地大薊的相似度均高于大薊與奶薊草或小薊的相似度，可根據(jù)相似度對(duì)大薊與偽品進(jìn)行區(qū)分；其中大薊和奶薊草相似度較低，提示大薊和奶薊草的化學(xué)成分存在明顯差異。

表2 大薊相似度結(jié)果Tab 2 Similarity of Cirsium japonicum

表3 大薊及混偽品的相似度結(jié)果Tab 3 Similarity of Cirsium japonicum and its adulterants

3.5 大薊及混偽品的聚類分析模型的建立

使用SPSS 26.0 對(duì)樣品的紅外光譜圖進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4；從圖中可知，在歐氏距離為20 時(shí)，39 批樣品被分為兩類，大薊單獨(dú)聚為一類，小薊和奶薊草聚為一類；當(dāng)歐氏距離為10 時(shí)，可將大薊與混偽品分為3 類，奶薊草聚為一類，小薊聚為一類，大薊聚為一類；當(dāng)歐式距離為3 時(shí)，小薊樣品具有明顯的地域傾向，同一產(chǎn)地的藥材聚類時(shí)距離較近。

圖4 大薊及混偽品的聚類分析圖Fig 4 Cluster analysis of Cirsium japonicum and its adulterants

3.6 大薊及混偽品的主成分分析

采用PCA 法對(duì)大薊及易混偽品的FT-IR 圖進(jìn)行主成分分析，選取紅外光譜在1800 ～800 cm－1內(nèi)的數(shù)據(jù)，利用Origin 軟件處理，得出主成分分析結(jié)果，根據(jù)特征值≥1 的原則[18]，確定2 個(gè)主成分，結(jié)果見表4。主成分1（PC1）的貢獻(xiàn)率為94.25%，主成分2（PC2）的貢獻(xiàn)率為4.28%，前2 個(gè)主成分PC1 和PC2 可以解釋原變量98.53%的信息。即選取前2 個(gè)主成分PC1 和PC2 繪制得分圖，見圖5，橫坐標(biāo)代表主成分1（PC1）的得分值，縱坐標(biāo)代表主成分2（PC2）的得分值，非常直觀地觀察到各類樣本在主成分空間的分布情況。

圖5 大薊及混偽品的主成分分析圖Fig 5 Principal component analysis of Cirsium japonicum and its adulterants

表4 大薊及混偽品的主成分分析表Tab 4 Principal component analysis of Cirsium japonicum and its adulterants

由圖5 可知，大薊和奶薊草明顯集中地聚為單獨(dú)的兩組，組間互不交叉，大薊主成分1 和2得分散點(diǎn)全部集中在第四象限，奶薊草主成分1和2 得分散點(diǎn)全部集中在第三象限，小薊主成分1 和2 得分散點(diǎn)分布在第二象限，表明大薊和奶薊草在主成分空間圖中載荷量有顯著差異。小薊分布較為分散，可能是不同產(chǎn)地的小薊質(zhì)量存在差異，該結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。

3.7 簇類獨(dú)立軟模式法（SIMCA）分類模型的建立與鑒別分析

通過PCA 分析大薊與混偽品有明顯的聚類趨勢(shì)，因此建立大薊、小薊與奶薊草的分類識(shí)別模型，在PCA 分析的基礎(chǔ)上，39 批樣品中隨機(jī)選擇15 個(gè)大薊、11 個(gè)小薊和3 個(gè)奶薊草組成訓(xùn)練集，其余5 個(gè)大薊，3 個(gè)小薊和2 個(gè)奶薊草作為驗(yàn)證集，建立SIMCA 分類模型；模型效果用識(shí)別率和拒絕率表示，識(shí)別率是指某類樣品有多少落在該模型的區(qū)域內(nèi)，而拒絕率是指某類樣品模型對(duì)于不屬于該類的位置樣品的拒絕程度[19]。從表5 中可以看出，在訓(xùn)練集中大薊和奶薊草SIMCA 分類模型對(duì)樣本的識(shí)別正確率為100%，小薊模型對(duì)樣本的識(shí)別率為90.91%，大薊的拒絕率為92.86%，有1 個(gè)小薊樣品落在了大薊模型范圍內(nèi)，使該模型出現(xiàn)了誤判；在驗(yàn)證集中大薊與奶薊草模型、小薊模型的識(shí)別率、拒絕率均為100%。SIMCA 分類模型聚類分析圖見圖6，大薊與混偽品具有較高的獨(dú)立性，基本實(shí)現(xiàn)完全分割。一般來說，SIMCA 分類模型的正確識(shí)別率在60%以上，說明該模型可行[20]。因此，本研究建立的大薊及混偽品的SIMCA 分類識(shí)別模型可行。

圖6 大薊及混偽品訓(xùn)練集（A）和驗(yàn)證集（B）的SIMCA 模式聚類圖Fig 6 SIMCA pattern clustering diagram of Cirsium japonicum and its adulterants training（A）andverification（B）set samples

表5 SIMCA 模式的訓(xùn)練集與驗(yàn)證集結(jié)果Tab 5 Training set and verification set of SIMCA mode

4 討論

本研究選取大薊及混偽品小薊、奶薊草作為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行鑒別研究，建立了一種方便、快捷、無損害的鑒別方法。在對(duì)紅外光譜圖的分析中發(fā)現(xiàn)，由于樣品屬于近緣物種，化學(xué)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成都比較相似，因此原譜圖之間的差異不是很明顯；對(duì)紅外圖譜選取1800 ～800 cm－1進(jìn)行二階導(dǎo)處理和相似度分析，能將大薊、小薊和奶薊草區(qū)分。本研究采用了FT-IR 技術(shù)結(jié)合聚類分析和SIMCA 分類模式對(duì)39 批大薊及其混偽品進(jìn)行分析研究，較好地實(shí)現(xiàn)了大薊與小薊、奶薊草之間的分類鑒定。該方法避免了復(fù)雜的樣品前處理過程，具有方便、快捷、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，有一定的可靠性和實(shí)用性，為大薊及其混偽品的鑒別與質(zhì)量研究提供了科學(xué)理論依據(jù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。