基于UPLC-Q/TOF-MS法研究“建昌幫”炆何首烏主成分差異

王艷霓，鄒宏，駱利平，白璐，蔡教邕，李詩盈，呂齊，葉喜德*（.江西德安縣中醫(yī)院藥劑科，江西 九江 0400；.江西宜豐縣人民醫(yī)院藥劑科，江西 宜春 600；.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南昌 0006）

何首烏來源于蓼科植物何首烏Polygonum miltiflorumThunb.的干燥塊根[1]，又名赤首烏、交藤根、夜合等，生品苦泄性平，具清熱解毒、潤腸通便、截瘧之功，黑豆汁制何首烏味轉(zhuǎn)甘厚而性溫，具補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)等功效。臨床主要用其炮制品，常用于血虛萎黃、眩暈耳鳴、須發(fā)早白等證[2]。

何首烏炮制方法較多，主要有去黑皮、蒸、煮、黑豆制、酒制、醋制、姜汁制、甘草制、米泔水浸與麩炒等30 余種炮制方法[3]。目前常以黑豆制和“九蒸九曬”制品應(yīng)用于臨床[4]，但歷版《中國藥典》主要以黑豆汁制[5]。炆何首烏為江西“建昌幫”特色炮制品之一。“建昌幫”為我國南方古藥幫和中藥炮制的重要流派，列為我國十三大藥幫之一，常與“樟樹藥幫”合稱為“江西藥幫”[6]。但炆何首烏的應(yīng)用，仍局限于地方經(jīng)驗(yàn)。目前對何首烏的研究，主要以生品和黑豆汁制品為研究對象[7]。對于炆何首烏，除文獻(xiàn)報(bào)道其飲片工藝外[8]，未見其他研究內(nèi)容。同時(shí)，何首烏經(jīng)炆制后是否增效減毒等問題，仍有待闡明。另一方面，炮制對中藥成分變化的影響是優(yōu)選飲片質(zhì)量的重要依據(jù)，也是探討炮制機(jī)制的一個(gè)關(guān)鍵因素?；诖?，本研究借助現(xiàn)代分析技術(shù)和手段，運(yùn)用UPLC-Q/TOF-MS、Marker view 軟件等多種分析方法，比較何首烏不同炮制品之間的主成分差異，探討不同炮制方法對何首烏成分變化的影響，為優(yōu)選何首烏中藥飲片及研究炮制機(jī)制等提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 儀器

Triple TOFTM5600 型液相色譜高分辨串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司，配備 DuoSpray TM離子源，30A 型液相色譜系統(tǒng)），AE240 型1/10萬電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司），TGL-16B 型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），Raynger ST20 型紅外測溫儀（美國雷泰公司）。

1.2 試藥

何首烏（安徽匯仁堂中藥飲片有限公司，批號：20200573），經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)龔千鋒教授鑒定為蓼科植物何首烏Polygonum miltiflorumThunb.的干燥塊根。大黃素甲醚、二苯乙烯苷對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號分別為WKQ19030501、WKQ19012803， 純度均≥98%），大黃素對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-18110810，純度≥98%），水為自制雙蒸水，甲醇、乙腈、甲酸為質(zhì)譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

按2020年版《中國藥典》炮制方法，分別制備何首烏生品、制何首烏、黑豆制品。

甘草制品：參照江西“樟樹藥幫”炮制法[9]，稱取甘草50 g，加水適量煎煮熬汁，連續(xù)兩次，合并煎煮液；另取何首烏50 g，用甘草汁將何首烏拌勻，放入電蒸鍋內(nèi)蒸制1 h 后關(guān)火，取出，晾干，即得（何首烏原藥材和甘草汁比為10∶1）。

炆何首烏：參照江西“建昌幫”炮制法，稱取何首烏190 g、黑豆20 g，將部分何首烏片放入炆藥壇內(nèi)，與黑豆隔離分層平鋪，加清水至離壇頂7 cm 左右，密閉加熱炆制8 h，取出，去除雜質(zhì)，晾干，即得。

2.2 供試品溶液制備

稱取何首烏不同炮制品粉末（過三號篩）各50 mg，加甲醇5 mL，于50℃超聲提取30 min，取出，4000 r·min－1離心15 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.3 對照品溶液制備

稱取二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚對照品各約2 mg，加甲醇使溶解并分別定容于10 mL量瓶中，即得。吸取各對照品溶液適量，甲醇稀釋，4000 r·min－1離心15 min，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，待測。

2.4 色譜條件

Acquity UPLCBEHC18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相 0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫（0 ～18 min，5%～40%B；18 ～30 min，40% ～95%B；30 ～35 min，95%B；35 ～35.1 min，95%～5%B；35.1 ～38 min，5%B），流速 0.25 mL·min－1，柱溫 40℃，進(jìn)樣量 2 μL。

2.5 質(zhì)譜條件

參照文獻(xiàn)[10]電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式下檢測：干燥霧化氣（N2）流速 10 L·min－1，霧化器壓力 275.8 kPa，噴嘴電壓 500 V，毛細(xì)管電壓 4 kV，干燥氣溫 325℃，保護(hù)氣溫350℃，保護(hù)氣流速10 L·min－1，掃描范圍m/z100 ～1500。

2.6 數(shù)據(jù)分析

采用Analyst TF 1.6 軟件，對采集到的數(shù)據(jù)通過Markerview 1.2.1 軟件進(jìn)行質(zhì)譜峰分析、提取峰對齊及歸一化等處理，利用主成分分析（PCA）查找何首烏不同炮制品與生品化合物譜圖之間的差異，總離子流圖見圖1。

圖1 何首烏不同炮制品在負(fù)離子模式下TIC 總離子流圖Fig 1 TIC total ion flow diagram of different processed products of Polygonum multiflorum under negative ion mode

2.7 UPLC-Q/TOF-MS 數(shù)據(jù)分析

經(jīng)數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)炆何首烏與其他炮制品具有顯著差異的主要成分為25 個(gè)，結(jié)合對照品及相關(guān)文獻(xiàn)各成分保留時(shí)間和質(zhì)譜信息，鑒定出何首烏不同炮制品中共25 種化學(xué)成分，見表1。依照這些成分離子峰面積數(shù)據(jù)，將成分離子峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入Marker view 軟件進(jìn)行PCA 處理，得分圖見圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組樣本點(diǎn)之間離散性較小，表明不同批次何首烏樣品自身差異較小，組內(nèi)均一性良好；同一樣品、不同何首烏炮制品之間被明顯分成了5 組，表明不同炮制品之間成分差異較大，并分布在不同象限，說明不同炮制方法對何首烏化學(xué)成分影響較大。

表1 何首烏不同炮制品中化學(xué)成分的 UPLC-Q-TOF/MS 鑒定Tab 1 Identification of chemical components in different processed products of Polygonum multiflorum by UPLC-Q-TOF/MS

圖2 各炮制品PCA 得分圖Fig 2 PCA score of each processed product

由圖2 可知，制何首烏、甘草制品、黑豆制品、炆制品和生品何首烏等均可區(qū)分開來，表明炮制前后何首烏化學(xué)譜發(fā)生了明顯變化，其中炆制品尤為突出。通過PCA 模式繪制載荷矩陣圖（見圖3），以查找影響炆何首烏前后的化學(xué)標(biāo)記物。載荷矩陣圖中的點(diǎn)表示各個(gè)m/z質(zhì)荷比、保留時(shí)間變量；其與中心點(diǎn)的距離遠(yuǎn)近，表示該變量為樣品組分型所做出的貢獻(xiàn)大小，偏離越遠(yuǎn)，其在不同樣品中含量變化越大。其中二苯乙烯苷、大黃素甲醚等距離中心點(diǎn)較遠(yuǎn)，此類化學(xué)成分具有成為炆制何首烏質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)的潛力。結(jié)合UPLC-Q-TOF/MS 數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)炆何首烏與其他炮制品具顯著差異的主要成分為25個(gè)，見表1。

圖3 各炮制品PCA 載荷圖Fig 3 PCA load diagram of each processed product

2.8 裂解規(guī)律分析

何首烏醇提液中化學(xué)成分，主要為二苯乙烯苷類、蒽醌類等，此外還存在黃酮、磷脂和苯丙素類等成分。

2.8.1 二苯乙烯苷（2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷） 運(yùn)用 Peakview 軟件在負(fù)離子模式下提取tR＝8.42 min 和[M-H]－405.1195 離子，得到該化合物裂解5個(gè)碎片離子243.0659 [M-C6H12O6]－、225.0555 [M-H2O]－、215.0712 [M-CO]－、173.0614[M-CH2CO]－、137.0620 [M-C7H6O]－。母離子[M-H]－405.1183，依照對照品保留時(shí)間8.42 min，其質(zhì)譜分辨率誤差為－2.9×106，推測該化合物分子式為C20H22O9，通過文獻(xiàn)對上述信息進(jìn)行比對分析[14]，與二苯乙烯苷化合物一致，鑒定為二苯乙烯苷，其裂解過程見圖4。

圖4 二苯乙烯苷裂解途徑Fig 4 Cleavage pathway of stilbene glycoside

2.8.2 大黃素 運(yùn)用 Peakview 軟件，在負(fù)離子模式下提取tR＝23.23 min 和[M-H]－269.0456離子，得該化合物5 個(gè)碎片離子：241.0497 [MCO]－、240.0424 [M-CHO]－、225.0551 [M-CO2]－、210.0318 [M-CH3]－、197.0606 [M-CO2]－，依照對照品保留時(shí)間23.23 min，其質(zhì)譜分辨率誤差為0.1×106，推測其分子式為C15H10O5。通過文獻(xiàn)比對[14]，與大黃素化合物一致，確定為大黃素，其裂解過程見圖5。

圖5 大黃素裂解途徑Fig 5 Cleavage pathway of emodin

2.8.3 大黃素甲醚 運(yùn)用Peakview 軟件，在負(fù)離子模式下提取tR＝17.11 min 和[M-H]－283.0612離子，得該化合物3 個(gè)碎片離子：268.0370 [MCH3]－、240.0424 [M-CH3CO]－、212.0479 [MCO]－，與對照品保留時(shí)間17.11 min 相比，其質(zhì)譜分辨率誤差為0.1×106，推測分子式為C16H12O5。通過文獻(xiàn)比對[11]，與大黃素化甲醚合物一致，確定為大黃素甲醚，其裂解過程見圖6。

圖6 大黃素甲醚裂解途徑Fig 6 Cleavage pathway of emodin methyl ether

2.9 在負(fù)離子模式下的何首烏離子峰面積炮制前后變化指數(shù)

何首烏經(jīng)不同炮制方法制后的成分發(fā)生變化，在負(fù)離子模式下，依照色譜峰、保留時(shí)間、準(zhǔn)分子離子、二級碎片及其裂變規(guī)律等信息，以峰面積為變化指數(shù)，來評價(jià)其對應(yīng)的化合物含量變化情況[24]。變化指數(shù)（change index，CI）＝炮制品離子峰面積/對應(yīng)保留時(shí)間的生品離子峰面積，依照所得值是否大于、小于或等于1，來評價(jià)該離子峰對應(yīng)成分含量在炮制后的變化情況（當(dāng)CI＞1 時(shí)，表示炮制后含量增加；CI＜1 表示炮制后降低；CI＝1 表示炮制前后無變化）。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，何首烏炆制后未發(fā)現(xiàn)有新的成分，但不同炮制方法對何首烏中化合物含量差異較大。炆制后有15 個(gè)成分峰面積明顯升高（CI≥1.5），3 個(gè)成分峰面積明顯降低（CI＜0.5），其中2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚、大黃素均明顯升高。結(jié)果見表2。

表2 何首烏不同炮制品在負(fù)離子模式下的離子峰面積炮制前后變化指數(shù)Tab 2 Ion peak area of different processed products of Polygonum multiflorum in negative ion mode before and after the processing

3 討論與小結(jié)

何首烏主含蒽醌類、二苯乙烯類、磷脂類、酚類和黃酮類等[25]，其中二苯乙烯苷、大黃素甲醚、大黃素甲醚等是其主要有效成分。何首烏生品以大黃素居多，經(jīng)黑豆汁制后，其味轉(zhuǎn)甘厚而性溫，瀉下作用減弱[26]。同時(shí)，卵磷脂類成分溶出增多，增強(qiáng)了補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)等作用。由于何首烏炮制方法較多，而炆法又為江西“建昌幫”特色制法，目前對何首烏的研究，仍以蒸法、甘草制法和黑豆制法為主，炆何首烏除文獻(xiàn)報(bào)道工藝和對其主要成分產(chǎn)生影響外[27]，并未深入研究，也未見炆制品與其他炮制品之間成分差異性研究的文獻(xiàn)報(bào)道，炆何首烏炮制機(jī)制仍缺乏現(xiàn)代數(shù)據(jù)支撐。

本研究依照PCA 軟件分析，結(jié)合保留時(shí)間、質(zhì)譜信息和文獻(xiàn)資料，分離并鑒定出何首烏不同炮制品中 25 種主要化學(xué)成分。利用PCA 模式識別繪制得分圖，即可把何首烏不同炮制品明顯區(qū)分開來。其中炆制品分離度尤為明顯，表明炆法對何首烏化學(xué)成分的影響較大。同時(shí)，根據(jù)各樣品在負(fù)離子模式下的離子峰面積變化指數(shù)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)何首烏經(jīng)炆制后，雖然未見新成分產(chǎn)生，但在同一條件下，發(fā)現(xiàn)15 個(gè)成分峰面積升高（CI＞1），7 個(gè)成分峰面積降低（CI＜1），3 個(gè)成分峰面積變化指數(shù)近似1；其中主要有效成分如2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚、大黃素等峰面積明顯升高。為此，本研究選擇二苯乙烯苷、大黃素甲醚、大黃素甲醚等為質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)，比較不同炮制方法對何首烏主成分變化差異，目的是探討不同炮制方法對何首烏成分變化的影響。結(jié)果表明，3 種成分含量變化情況分別為二苯乙烯苷含量：炆制品＞制品＞黑豆制品＞生品＞甘草制品；大黃素含量：制品＞甘草制品＞炆制品＞生品＞黑豆制品；大黃素甲醚含量：甘草制品＞炆制品＞制品＞黑豆制品＞生品。可見，何首烏經(jīng)炆制后，其主要有效成分二苯乙烯苷均高于黑豆制品，由于該成分具保護(hù)神經(jīng)、提高記憶力、抗衰老、降血脂等多種作用[28]。

因此，何首烏經(jīng)炆制后，對其主要有效成分產(chǎn)生影響，但這種影響是否是藥效增強(qiáng)的關(guān)鍵變化因素仍有待深入研究。