美麗薄子木內(nèi)生真菌Rhytidhysteron sp.BZM-9化學(xué)成分研究

張莎，曠敏，彭偉偉，鄭雨婷，許立，曾廣源，鄒振興*（1.中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013；2.慢病診療小分子藥物發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)化湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410013）

植物內(nèi)生真菌是天然產(chǎn)物的重要資源，它們棲息在宿主植物的不同器官、組織內(nèi)，對(duì)宿主植物本身不會(huì)引起任何疾病[1]。從微生物，尤其是植物內(nèi)生真菌和海洋微生物中尋找和發(fā)現(xiàn)活性新穎的先導(dǎo)化合物已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[2-3]。近年來(lái)，內(nèi)生真菌產(chǎn)生的多種生物活性代謝物具有重要的社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在農(nóng)業(yè)（作為生物肥料/生物刺激劑）和環(huán)境（生物修復(fù)）中被廣泛應(yīng)用[2]。

美麗薄子木（Leptospermum brachyandrum）為桃金娘科（Myrtaceae）魚(yú)柳梅屬（Leptospermum）小喬木或灌木，原產(chǎn)于澳大利亞。由于其觀賞及藥用價(jià)值引入我國(guó)，目前在廣東、廣西等地廣泛種植。研究顯示，桃金娘科植株富含精油及間苯三酚類成分，具有較好的抗菌活性[4-8]。但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于該科植物美麗薄子木的化學(xué)成分及其內(nèi)生真菌的研究鮮少。課題組前期通過(guò)組織分離法從美麗薄子木植物中分離出一株內(nèi)生真菌，經(jīng)ITS測(cè)序鑒定為Rhytidhysteronsp.BZM-9。經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于該屬真菌的化學(xué)成分研究較少，僅報(bào)道幾個(gè)色原酮[9]及螺二萘成分[10-12]。因此，為了進(jìn)一步探明其化學(xué)多樣性，本文利用現(xiàn)代色譜及光譜技術(shù)從中分離鑒定出15 個(gè)化合物（見(jiàn)圖1），并對(duì)部分化合物進(jìn)行了抗菌和細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià)。

圖1 化合物1 ～15 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Structures of compounds 1 ～15

1 材料

Bruker AV-400/AV-500/AV-600 型核磁共振儀（德國(guó)Bruker 公司）；Agilent 1290 UPLC-6545 accurate mass Q-TOF 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent 1200 型分析高效液相色譜儀、Agilent 1100 型半制備型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 科技公司）；YMC-pack ODS-A 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；YMC-pack ODS-A 色譜柱（250 mm×10 mm，10 μm）；C18反相硅膠（40 ～75 μm，日本Kasugai）；硅膠（60 ～100 目，200 ～300 目，青島海洋化工有限公司）；Sephadex LH-20 凝膠（德國(guó)Healthcare Uppsala Swedeb）；所用試劑均為分析純。

HepG2 和SMMC-7721 肝癌細(xì)胞（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心）；實(shí)驗(yàn)菌株MRSA（Methicillin-resistantStaphylococcus aureus）及Escherichia coli來(lái)自廣東省微生物培養(yǎng)中心。

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)菌株分離自美麗薄子木枝葉，美麗薄子木枝葉于2016年9月采自中國(guó)科學(xué)院華南植物園，由華南植物園王發(fā)國(guó)副研究員鑒定。該真菌由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司經(jīng)ITS 序列分析鑒定為Rhytidhysteronsp.BZM-9，目前該樣品標(biāo)本保存于中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

2 菌株的發(fā)酵、萃取及其代謝產(chǎn)物的分離

用接種環(huán)挑取適量菌絲接種至裝有200 mL PDB 的三角瓶中，在恒溫培養(yǎng)搖床中培養(yǎng)5 d（28℃，130 r·min－1），制備得到種子液。將種子液接種至無(wú)菌大米培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)60 瓶，室溫下靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)30 d，得到固體發(fā)酵物。發(fā)酵完成后用乙酸乙酯將大米發(fā)酵物萃取3 次，將有機(jī)溶劑減壓蒸發(fā)獲得粗提物浸膏（50 g）。

乙酸乙酯浸膏經(jīng)硅膠柱層析，采用PE-EAMeOH（100∶0∶0 ～0∶0∶100）梯度洗脫，得到10 個(gè)組分（Fr.A ～Fr.J）。Fr.F 再經(jīng)硅膠柱層析，以CH2Cl2-MeOH（100∶0 ～0∶100）梯度洗脫，得到8 個(gè)組分（Fr.F-1 ～Fr.F-8）。Fr.F-3 經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析及Pre-HPLC 得到化合物1（20.3 mg）、2（15.8 mg）、7（3.5 mg）、8（5.8 mg）和9（10.3 mg）。Fr.F-4 經(jīng)Sephadex LH-20 柱層析，甲醇洗脫，得到4 個(gè)組分（Fr.F-4-1 ～Fr.F-4-4）。Fr.F-4-2 依次經(jīng)硅膠柱層析、Pre-HPLC 得到化合物3（7.3 mg）、4（2 mg）、5（6.6 mg）和6（1.6 mg）。Fr.F-5 經(jīng)ODS 柱層析，采用MeOHH2O（20∶80 ～100∶0）梯度洗脫，得到8 個(gè)組分（Fr.F-1 ～Fr.F-8）。Fr.F-2 經(jīng)Pre-HPLC 得到化合物14（2.1 mg）。Fr.F-3 依次經(jīng)硅膠柱層析、Pre-HPLC 得化合物10（5.4 mg）。

Fr.E 經(jīng)ODS 柱層析，采用MeOH-H2O（20∶80～100∶0）梯度洗脫，得到8 個(gè)組分（Fr.E-1 ～Fr.E-8）。Fr.E-5 經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，再通過(guò)Pre-HPLC得到化合物11（2.3 mg）和13（3.5 mg）；Fr.E-6 依次經(jīng)硅膠柱層析、Pre-HPLC 得到化合物12（8.5 mg）；Fr.E-7 經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析得到化合物15。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無(wú)定型粉末，易溶于甲醇和二甲基亞砜（DMSO），HR-ESI-MSm/z：259.0608 [M＋H]＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.24（1H，d，J＝2.4 Hz，H-6），6.69（1H，d，J＝3.0 Hz，H-5'），6.60（1H，d，J＝3.0 Hz，H-3'），6.35（1H，d，J＝2.4 Hz，H-4），2.75（3H，s，6'-CH3）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：140.0（C-1），98.9（C-2），166.2（C-3），102.2（C-4），166.9（C-5），105.8（C-6），167.6（C-7），111.0（C-1'），154.5（C-2'），102.7（C-3'），159.9（C-4'），118.6（C-5'），139.8（C-6'），25.9（6'-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[13]基本一致，化合物1 鑒定為alternariol。

化合物2：褐色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：275.0555 [M ＋H]＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.23（1H，d，J＝1.8 Hz，H-9），6.68（1H，s，H-2），6.35（1H，d，J＝1.8 Hz，H-7），2.66（3H，s，H-10）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：126.9（C-1），116.3（C-2），146.3（C-3），130.9（C-4），141.3（C-4a），164.8（C-5a），97.5（C-6），100.6（C-7），165.0（C-8），104.2（C-9），139.1（C-9a），109.8（C-9b），23.9（C-10），165.4（C-11）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[14]基本一致，化合物2 鑒定為porric acid E。

化合物3：黃色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：223.0987 [M ＋H]＋。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：6.39（1H，s，H-4），1.97（3H，s，H-11），1.89（1H，m，H-8a），1.80（1H，m，H-8b），1.48（3H，s，H-10），0.64（3H，t，J＝7.2 Hz，H-9）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：169.3（C-1），86.6（C-3），99.5（C-4），163.2（C-5），111.4（C-6），155.2（C-7），153.5（C-3a），103.5（C-7a），32.5（C-8），8.6（C-9），26.2（C-10），8.1（C-11）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[15]基本一致，化合物3 鑒定為3-ethyl-5，7-dihydroxy-3，6-dimethylphthalide。

化合物4：白色針狀晶體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：209.0814 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ：5.20（2H，s，H-3），3.85（3H，s，H-10），2.09（3H，s，H-9），2.06（3H，s，H-8）。13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ：169.2（C-1），68.5（C-3），113.7（C-4），162.4（C-5），118.4（C-6），155.8（C-7），147.3（C-3a），107.4（C-7a），11.8（C-8），9.6（C-9），62.4（C-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[16]基本一致，化合物4 鑒定為5-羥基-7-甲氧基-4，6-二甲基-2-苯并呋喃酮。

化合物5：黃色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：223.0626 [M ＋H]＋。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.18（1H，s，H-10），5.35（2H，s，H-3），3.92（3H，s，H-9），2.01（3H，s，H-8）。13H-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：172.5（C-1），70.1（C-3），114.8（C-4），168.5（C-5），121.0（C-6），160.9（C-7），152.5（C-3a），104.9（C-7a），9.2（C-8），61.8（C-9），190.6（C-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[17]基本一致，化合物5 鑒定為6-formyl-7-hydroxy-5-methoxy-4-methylphalide。

化合物6：黃色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：223.0626 [M ＋H]＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.91（1H，s，H-7），5.22（2H，s，H-3），3.87（3H，s，H-9），2.16（3H，s，H-8）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：172.8（C-1），68.3（C-3），150.0（C-4），120.2（C-5），161.1（C-6），96.8（C-7），123.5（C-3a），126.9（C-7a），7.9（C-8），55.0（C-9）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[18]基本一致，化合物6 鑒定為4-hydroxy-6-methoxy-5-methylphthalide。

化合物7：白色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：271.0582 [M ＋Na]＋。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：6.71（1H，d，J＝2.4 Hz，H-6），6.65（1H，d，J＝2.4 Hz，H-8），5.96（1H，s，H-3），4.03（2H，s，H-1'），3.55（3H，s，-OCH3），2.28（3H，s，H-9）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：164.7（C-2），118.9（C-3），178.2（C-4），137.4（C-5），110.8（C-6），161.1（C-7），102.1（C-8），114.2（C-4a），159.5（C-8a），19.9（C-9），40.1（C-1'），171.6（C-2'），51.7（-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[19]基本一致，化合物7 鑒定為2-甲基-5-甲氧羰甲基-7-羥基色原酮。

化合物8：白色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：235.0968 [M ＋H]＋。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：6.66（1H，d，J＝2.4 Hz，H-8），6.62（1H，d，J＝2.4 Hz，H-6），5.97（1H，s，H-3），4.03（1H，m，H-2'），2.65（3H，s，H-9），2.58（2H，m，H-1'），1.15（3H，d，J＝6.4 Hz，H-3'）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：165.3（C-2），112.0（C-3），178.8（C-4），141.8（C-5），116.9（C-6），161.4（C-7），101.1（C-8），114.9（C-4a），159.6（C-8a），43.3（C-1'），64.5（C-2'），23.9（C-3'），22.9（5-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[20]基本一致，化合物8 鑒定為2-（2'-hydroxypropyl）-5-methyl-7-hydroxychromone。

化合物9：白色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：213.0507 [M ＋H]＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.64（1H，d，J＝2.4 Hz，H-6），6.63（1H，d，J＝2.4 Hz，H-8），6.00（1H，s，H-3），2.71（3H，s，H-10），2.32（3H，s，H-9）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：166.7（C-2），115.6（C-3），182.1（C-4），163.2（C-5），118.1（C-6），143.7（C-7），101.7（C-8），111.4（C-4a），161.5（C-8a），19.9（C-9），23.2（C-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[21]基本一致，化合物9 鑒定為altechromones A。

化合物10：淺黃色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：193.0864 [M ＋H]＋。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：7.44（1H，dd，J＝7.8，1.8 Hz，H-8），7.41（1H，t，J＝7.8 Hz，H-7），7.28（1H，dd，J＝7.8，1.8 Hz，H-6），5.10（1H，t，J＝3.6 Hz，H-4），3.85（3H，s，-OCH3），2.96（1H，m，H-2a），2.41（1H，m，H-2b），2.11（2H，m，H-3）。13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：198.3（C-1），32.7（C-2），30.6（C-3），58.9（C-4），157.3（C-5），116.5（C-6），129.4（C-7），118.0（C-8），133.5（C-9），132.6（C-10），56.4（-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[22]基本一致，化合物10 鑒定為4-O-methylscleron。

化合物11：淺黃色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：237.1121 [M ＋H]＋。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：6.18（1H，s，H-5），5.21（1H，m，H-2'），3.75（3H，s，H-8），1.95（3H，s，H-9），1.77（3H，s，H-4'），1.67（3H，d，J＝6.4 Hz，H-3'）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：103.7（C-1），160.7（C-2），109.4（C-3），160.5（C-4），109.3（C-5），146.8（C-6），171.3（C-7），52.4（C-8），8.6（C-9），138.7（C-1'），120.6（C-2'），14.1（C-3'），18.7（C-4'）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[23]基本一致，化合物11 鑒定為pilobolusate。

化合物12：深褐色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：179.1071 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ：9.03（2H，br s，1/3-OH），6.32（2H，s，H-4，H-6），5.72（1H，q，J＝6.5 Hz，H-2'），1.90（3H，s，H-3'），1.86（3H，s，H-4'），1.70（3H，d，J＝6.5 Hz，H-7）。13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ：156.3（C-1），109.1（C-2），156.3（C-3），103.8（C-4），141.5（C-5），103.8（C-6），8.9（C-7），135.5（C-1'），120.6（C-2'），14.5（C-3'），15.7（C-4'）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[24]基本一致，化合物12 鑒定為aspergillusphenols A。

化合物13：淡黃色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：183.0656 [M ＋H]＋。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：6.15（1H，d，J＝2.4 Hz，H-4），6.14（1H，d，J＝2.4 Hz，H-2），3.79（3H，s，-OCH3），2.27（3H，s，H-8）。13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：161.6（C-1），100.9（C-2），167.4（C-3），110.8（C-4），141.2（C-5），106.1（C-6），170.7（C-7），22.5（C-8），52.2（-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[25]基本一致，化合物13 鑒定為苔色酸甲酯。

化合物14：黃色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：146.0401 [M ＋H]＋。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.14（1H，br s，-NH-），9.93（1H，s，H-10），8.29（1H，s，H-2），8.09（1H，d，J＝7.8 Hz，H-4），7.52（1H，d，J＝7.8 Hz，H-7），7.25（2H，m，H-5/6）。13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：139.0（C-2），118.6（C-3），123.9（C-4），122.6（C-5），120.8（C-6），112.9（C-7），137.5（C-8），124.6（C-9），185.5（C-10）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[26]基本一致，化合物14 鑒定為1H-indole-3-carboxaldehyde。

化合物15：黃色固體，易溶于氯仿，HRESI-MSm/z：393.3153 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：6.61（1H，d，J＝9.5 Hz，H-7），6.02（1H，d，J＝9.5 Hz，H-6），5.74（1H，s，H-4），5.24（2H，m，H-22/23），1.06（3H，d，J＝6.5 Hz，H-21），1.00（3H，s，H-19），0.96（3H，s，H-18），0.93（3H，d，J＝7.0 Hz，H-28），0.84（6H，d，J＝6.5 Hz，H-26/27）。13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：34.1（C-1/C-2），199.5（C-3），123.0（C-4），124.5（C-5），124.4（C-6），134.0（C-7），164.4（C-8），44.3（C-9），36.8（C-10），19.0（C-11），35.6（C-12），44.0（C-13），156.1（C-14），25.4（C-15），27.7（C-16），55.7（C-17），19.0（C-18），16.7（C-19），39.3（C-20），21.1（C-21），135.0（C-22），132.5（C-23），42.9（C-24），33.1（C-25），20.0（C-26），19.7（C-27），17.7（C-28）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[27]基本一致，化合物15 鑒定為ergosta-4，6，8（14），22-tetraen-3-one。

4 生物活性測(cè)定

4.1 抗腫瘤活性測(cè)定

以阿霉素（上海愛(ài)研化工科技有限公司，批號(hào)：AYCB1087）為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)試了化合物3～6和11 ～13 對(duì)兩種肝癌細(xì)胞（HepG2 和SMMC-7721）的增殖抑制活性。首先將HepG2和SMMC-7721 細(xì)胞株在含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩種肝癌細(xì)胞，以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96 孔板，貼壁培養(yǎng)24 h 后。每孔分別加入2 μL 待測(cè)化合物，陰性對(duì)照組和空白組分別加入等體積DMSO 和培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h 后，再加入20 μL MTT 溶液，繼續(xù)孵育4 h。棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，結(jié)晶充分溶解后，用酶標(biāo)儀在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值，并計(jì)算IC50值。

結(jié)果顯示，只有化合物12 對(duì)SMMC7721細(xì)胞顯示出較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性（IC50＝0.338 μmol·L－1），其活性相當(dāng)于陽(yáng)性對(duì)照阿霉素（IC50＝0.3 μmol·L－1），其余化合物在測(cè)試的最大濃度下（≥80 μmol·L－1）均未顯示出增殖抑制活性。

4.2 抗菌活性測(cè)定

以萬(wàn)古霉素（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：V871983）為陽(yáng)性對(duì)照，參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（CLSI20150）標(biāo)準(zhǔn)，采用96 孔板二倍稀釋法測(cè)試化合物3 ～6 和11 ～14對(duì)MRSA 及Escherichia coli的最低抑菌濃度（MIC）值。結(jié)果顯示，僅化合物12 對(duì)MRSA 顯示出較好的抑制活性（MIC＝6.25 μg·mL－1），其余化合物在測(cè)試的最大質(zhì)量濃度下（≥ 50 μg·mL－1）對(duì)MRSA 及Escherichia coli均未顯示出抑制活性。

5 結(jié)果與討論

植物內(nèi)生真菌具有普遍性和多樣性，自然界幾乎所有的植物組織中均含有內(nèi)生真菌，其參與植物生長(zhǎng)過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，不僅能代謝產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的代謝產(chǎn)物，自身還能生成許多活性代謝物，是活性先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源。

本研究從美麗薄子木植物內(nèi)生真菌Rhytidhysteronsp.BZM-9 乙酸乙酯提取物中共分離鑒定出15 個(gè)化合物，包括6 個(gè)酚酸類、4 個(gè)苯酞類、3 個(gè)色原酮、1 個(gè)吲哚生物堿及1 個(gè)甾體，以上所有化合物均為首次從該屬真菌中分離得到。活性測(cè)試結(jié)果顯示化合物12 可能為抗菌或抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)提供先導(dǎo)化合物。以上研究結(jié)果不僅豐富了Rhytidhysteron屬真菌化學(xué)成分多樣性，也為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)美麗薄子木內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物提供一定的研究基礎(chǔ)。