Notch信號通路與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性

柳倩，潘丁晨，杜樂，黃河，蔣國靜*

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)是指女性跟同一性伴侶，在妊娠28周以內(nèi)出現(xiàn)兩次或兩次以上的妊娠丟失，妊娠終止時胎兒體重不足1 000 g[1]。歐洲人類生殖和胚胎學(xué)學(xué)會認(rèn)為，臨床若發(fā)生兩次妊娠丟失即要考慮診斷為RSA，其會影響1%～2%夫婦的生殖健康[2]，已知的病因包括血栓形成傾向、內(nèi)分泌代謝紊亂、解剖結(jié)構(gòu)異常，以及免疫、遺傳、不良生活方式等[3]，除以上外仍無法找到病因的患者屬于不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)。一項研究調(diào)查了2011年1月至2017年8月就診于哥倫比亞婦女醫(yī)院的RSA患者，發(fā)現(xiàn)URSA患者約占40%～50%[4]。Notch信號通路屬于進(jìn)化保守的細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，參與生長發(fā)育和細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等[5]。Notch信號通路通過介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和壁細(xì)胞(又稱周細(xì)胞)形成，維持血管系統(tǒng)[6]，調(diào)節(jié)胚胎滋養(yǎng)層侵襲母體子宮組織[7]，促進(jìn)子宮內(nèi)膜蛻膜化[8]，在母胎界面滋養(yǎng)層侵襲與螺旋動脈重塑方面尤為顯著，與URSA等病理妊娠狀態(tài)密切相關(guān)。

1 Notch信號通路

Notch家族包括Notch(1～4)四種受體以及五種配體：Delta樣配體(DLL1、3、4)和鋸齒樣配體(Jagged1、2)[9]。其中，Notch1、2參與生長發(fā)育過程，而Notch3、4廣泛表達(dá)于血管系統(tǒng)的細(xì)胞亞群中，包括平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞[10]。Notch受體前體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中經(jīng)歷廣泛的翻譯和修飾[11]，成熟后成為細(xì)胞表面的跨膜受體。Notch1～Notch4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基本一致，但靶基因和效應(yīng)蛋白不盡相同，經(jīng)典基因靶點有分裂增強(qiáng)子(HES)和與HES相關(guān)的YRPW基序(HEY)[12]等。

經(jīng)典的Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程始于受體與鄰近細(xì)胞表面以反式表達(dá)的膜結(jié)合配體結(jié)合，配體被泛素化，通過類似胞吞、機(jī)械拉伸的作用促進(jìn)配受體結(jié)合，受體在整合素金屬蛋白酶10(ADAM10)和γ-分泌酶的作用下發(fā)生蛋白水解[13]，使其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域被釋放到胞質(zhì)溶膠中，進(jìn)入細(xì)胞核與核轉(zhuǎn)錄抑制子(recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa J region，RBPJ)和Mastermind-like的輔助激活劑(mastermind like transcriptional coactivator，MAML)蛋白家族相互作用形成Notch輔激活子復(fù)合物[14]。

非經(jīng)典的Notch信號中，受體也可以被非經(jīng)典的配體或在沒有配體的情況下激發(fā)，Notch受體無需切割產(chǎn)生胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，甚至有些非經(jīng)典途徑無需RBPJ的參與，可以與其他胞核、胞質(zhì)的效應(yīng)物相互作用[11]。目前非經(jīng)典的Notch信號通路在腫瘤學(xué)中的研究有較新進(jìn)展，不過在病理性妊娠或妊娠并發(fā)癥的相關(guān)機(jī)制研究中幾乎沒有涉及。

2 滋養(yǎng)層侵襲

2.1 胚胎植入與滋養(yǎng)層侵襲

胚泡的種植包括定位、黏附、穿透三個過程；人類胚胎的極端滋養(yǎng)層與子宮內(nèi)膜的黏附需要表達(dá)于胚泡或子宮內(nèi)膜表面相關(guān)細(xì)胞因子及黏附分子配受體的結(jié)合，促進(jìn)胚泡與子宮內(nèi)膜接觸，滋養(yǎng)層細(xì)胞穿透內(nèi)膜上皮，侵入子宮內(nèi)膜間質(zhì)，達(dá)到母體血管[15]，參與母體螺旋動脈重塑，屬于胎盤形成的一部分，促進(jìn)胎盤形成前母胎物質(zhì)交換。滋養(yǎng)層逐漸分化為細(xì)胞滋養(yǎng)層(cytotrophoblasts，CTB)和合體滋養(yǎng)層(syncytiotrophoblasts，STB)，與胚外中胚層共同構(gòu)成胚胎的絨毛膜結(jié)構(gòu)[16]。

2.2 Notch信號通路與滋養(yǎng)層侵襲

Notch信號通路在滋養(yǎng)層的作用既表現(xiàn)為促進(jìn)CTB不斷向絨毛外滋養(yǎng)層(extravillous trophoblasts,EVTs)分化，并影響小鼠胚胎滋養(yǎng)層干細(xì)胞樣祖細(xì)胞(trophoblast stem cell-like progenitor cells，TSPCs)自我更新的過程，促進(jìn)滋養(yǎng)層向子宮內(nèi)膜侵襲。目前的研究涉及Notch配受體及靶基因分子在胚胎組織的定位、與細(xì)胞因子的調(diào)控、互作以及具體通路機(jī)制。

Notch信號通路的相關(guān)配受體在人類胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞中廣泛表達(dá)，與細(xì)胞滋養(yǎng)層向EVTs的分化相關(guān)：Notch1、3和DLL1在CTB和STB中都有表達(dá)，Notch2、4和Jagged1、2僅定位于STB中[17]；體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)未分化的小鼠滋養(yǎng)層干細(xì)胞表達(dá)Notch家族的所有成員，免疫熒光標(biāo)記母胎界面的Notch配受體，發(fā)現(xiàn)人類胚胎CTB不表達(dá)Notch1，且隨著滋養(yǎng)層侵襲Notch2表達(dá)上調(diào)、Notch4表達(dá)下調(diào)；DLL1在鄰近滋養(yǎng)層的間質(zhì)和血管腔室中表達(dá)，DLL4在CTB侵襲延伸的細(xì)胞柱中逐漸增加，卻在其侵入子宮壁后迅速下調(diào)，Jagged1在滋養(yǎng)層分化侵襲的早期階段是缺失的，卻在母體螺旋動脈相關(guān)的CTB中顯著上調(diào)[7]。以上研究中，Notch配受體在不同組織中的表達(dá)差異，可能反應(yīng)了其功能差異，例如Notch2、4和DLL4的動態(tài)變化說明Notch2、4調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層侵襲的先后順序，DLL4可能與細(xì)胞滋養(yǎng)層向合體滋養(yǎng)層的分化遷移有關(guān)。

早期妊娠的建立涉及母胎界面廣泛的血管重構(gòu)、滋養(yǎng)層侵襲、及聚集于螺旋動脈周圍的蛻膜NK細(xì)胞間的相互作用，Notch信號通路在其中都有參與，如動脈血的高氧狀態(tài)與蛻膜NK細(xì)胞促進(jìn)滋養(yǎng)層侵襲血管[18]。EphrinB2是血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物之一，研究發(fā)現(xiàn)DLL4-Notch信號可以彌補(bǔ)EphrinB2表達(dá)缺失的HTR-8/SVneo細(xì)胞株的遷移和侵襲[19]。γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch受體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域切割和釋放，抑制其活性[20]，研究發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲受表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域7(EGFL7)的調(diào)節(jié)，EGFL7與Notch1在JEG3細(xì)胞(人絨毛膜癌細(xì)胞)中表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞遷移；γ-分泌酶抑制劑的存在下，過度表達(dá)EGFL7的滋養(yǎng)層細(xì)胞對基底膠的侵襲減弱[21]。小鼠胎盤滋養(yǎng)層侵襲過程中Notch2受體的條件性缺失損害了動脈侵襲，使母體血流量減少了30%～40%，胎盤灌注減少了23%[7]。

已經(jīng)有研究表明Notch1是促進(jìn)人胎盤絨毛外滋養(yǎng)層祖細(xì)胞增殖和存活的關(guān)鍵因素；另一方面，它又抑制TEAD4(TEA Domain Transcription Factor4)和p63基因表達(dá)對合體滋養(yǎng)層化的作用，這兩種調(diào)節(jié)作用控制CTB自我更新[22]。轉(zhuǎn)錄因子TEAD4選擇性在胚胎植入早期的小鼠胚胎TSPCs中表達(dá)，缺失的小鼠在妊娠9 d之前發(fā)生胚胎死亡。此外，通過收集URSA患者的胎盤，發(fā)現(xiàn)其絨毛形成的缺陷——僅存單一的滋養(yǎng)層斑塊或缺乏滋養(yǎng)層細(xì)胞，滋養(yǎng)層柱受損。所以推測與胎盤絨毛形成缺陷相關(guān)的URSA與TSPCs中轉(zhuǎn)錄因子TEAD4的表達(dá)缺失相關(guān)[23]。

3 蛻膜化及母胎界面血管重建

狹義的蛻膜化是指子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖分化為蛻膜基質(zhì)細(xì)胞，糖原、脂滴和分泌顆粒在胞質(zhì)中積累，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體擴(kuò)張[15-16]，形成分泌型子宮內(nèi)膜。廣義的蛻膜化還包括血管重塑、子宮腺上皮細(xì)胞分泌增多、免疫細(xì)胞募集和分化[24]，其中，母胎界面的血管重建主要包括子宮螺旋動脈重塑和蛻膜毛細(xì)血管形成，Notch信號通路在其中發(fā)揮重要作用。

內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞不僅構(gòu)成血管，也體現(xiàn)血管功能。VEGF、Notch信號通路共同協(xié)調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成“芽”“莖”的功能；周細(xì)胞又稱為Rouget細(xì)胞(該細(xì)胞由Charles Rouget發(fā)現(xiàn)并命名)、壁細(xì)胞，位于血管基底膜內(nèi)，胞核突出，胞質(zhì)細(xì)長突起，沿血管走向包圍其表面并延伸至鄰近血管，維持微血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)血管發(fā)育和成熟[25]。Notch信號通路通過周細(xì)胞募集和分化調(diào)節(jié)血管功能[26]；周細(xì)胞中Notch信號的丟失降低了血小板衍生生長因子受體的水平，增加了周細(xì)胞凋亡[27]，并且，周細(xì)胞被認(rèn)為是血管平滑肌細(xì)胞的前體[26]。目前的研究已明確Notch信號通路調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的命運(yùn)：新的血管形成時，尖端表型內(nèi)皮細(xì)胞形成新的血管分支，而拖尾的莖細(xì)胞分化增殖形成管狀結(jié)構(gòu)，是因為Notch受體與不同的配體結(jié)合后產(chǎn)生不同的效應(yīng)——高表達(dá)DLL膜蛋白的內(nèi)皮細(xì)胞形成血管芽，高表達(dá)Jagged膜蛋白的內(nèi)皮細(xì)胞形成血管莖[28]，其中，DLL4在調(diào)控與妊娠相關(guān)的蛻膜血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[29]。新的研究發(fā)現(xiàn)，Notch受體表達(dá)水平的高低可能更具意義，且與內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)和趨化因子受體4(CXCR4)相關(guān)，而DLL4缺失的內(nèi)皮頂端細(xì)胞的功能并不受影響[30]。此外，血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)的Notch受體與配體Jagged1結(jié)合，促進(jìn)了其本身的進(jìn)一步增殖和分化[31-32]。

3.1 Notch信號通路與子宮螺旋動脈重塑

螺旋動脈重塑是EVTs與子宮螺旋動脈相互作用的結(jié)果。絨毛結(jié)構(gòu)是母胎血管系統(tǒng)的一部分，也是胎盤形成過程中的一部分。EVTs侵入母體蛻膜，破壞了子宮螺旋動脈的收縮性，表現(xiàn)為動脈壁內(nèi)血管平滑肌細(xì)胞逐漸被纖維組織和EVTs取代[15]，研究表明其與蛻膜NK細(xì)胞和EVTs分泌的血管生成素1、2(Angiopoietin,Ang)直接作用于血管平滑肌細(xì)胞有關(guān)[33]。

滋養(yǎng)細(xì)胞直接調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換，其衍生的血小板衍生因子BB(PDGF-BB)是調(diào)節(jié)因子之一，大鼠子宮腺α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達(dá)量可以反映平滑肌細(xì)胞被破壞的程度[34]。孕酮和絨毛膜促性腺激素激活Notch1通路，Notch1通過啟動基質(zhì)細(xì)胞向蛻膜細(xì)胞的分化來促進(jìn)α-SMA的表達(dá)并抑制基質(zhì)細(xì)胞的凋亡——通過向卵母細(xì)胞供體子宮內(nèi)輸注人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)，使腺體和蛻膜基質(zhì)Notch1蛋白表達(dá)水平顯著增加，編碼α-SMA的ACTA2基因?qū)m內(nèi)hCG的反應(yīng)顯著增加，而ACTA2是Notch4的靶基因之一，體現(xiàn)了Notch信號通路在其中的作用網(wǎng)絡(luò)[35]。

母胎界面的白細(xì)胞也參與子宮內(nèi)膜蛻膜化中的螺旋動脈重塑：在妊娠期間，子宮自然殺傷細(xì)胞在蛻膜積累，又稱為蛻膜自然殺傷細(xì)胞，在滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和子宮螺旋動脈重塑期間大量聚集[36]。蛻膜NK細(xì)胞與Notch信號通路雖然分別屬于細(xì)胞水平和分子水平，但其作用在血管重塑方面有所交叉，而二者之間的關(guān)系尚未明確。目前有研究發(fā)現(xiàn)雙花扁豆凝集素(DBA)染色陽性的蛻膜NK細(xì)胞表達(dá)DLL1，蛻膜NK細(xì)胞促進(jìn)蛻膜非平面血管的生成[37]；DLL1和DLL4與人類蛻膜NK細(xì)胞的相應(yīng)受體結(jié)合后，Notch信號通路被激活，促進(jìn)蛻膜NK細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ和血管生成因子，與母胎界面的血管修飾相關(guān)[38]。此外，Notch與VEGF信號通路在血管生成中的相互作用被廣泛研究[39-40]，Notch信號通路與血管內(nèi)皮生長因子及其受體和血管生成素在母胎界面相互作用，促進(jìn)蛻膜血管系統(tǒng)發(fā)育。多氯聯(lián)苯混合物Aroclor 1254(A-1254)是一種有毒物質(zhì)，可以通過Notch4/DLL4/HEY2通路，誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞三維管形成的破壞，使小鼠胎盤和人滋養(yǎng)層或內(nèi)皮細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)表達(dá)被抑制[41]。此外，Notch信號通路在3種人原代內(nèi)皮細(xì)胞系(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人動脈內(nèi)皮細(xì)胞和人微血管內(nèi)皮細(xì)胞)中皆誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子受體3(VEGFR3)轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞中VEGFR3的反式激活需要Notch/RBPJ結(jié)合位點[42]。

3.2 Notch信號通路與蛻膜毛細(xì)血管新生

除了子宮螺旋動脈的重塑，蛻膜新生毛細(xì)血管網(wǎng)也對胚胎植入后的生長發(fā)育至關(guān)重要，Notch信號通路中關(guān)鍵分子、蛋白或酶的缺失引起植入部位的毛細(xì)血管系統(tǒng)發(fā)育紊亂。ADAM10是一種Notch通路的調(diào)節(jié)因子，內(nèi)皮細(xì)胞定向缺乏ADAM10的雌性A10 δ EC小鼠，具有高度特化的血管結(jié)構(gòu)缺陷，生育能力嚴(yán)重低下，蛻膜化過程中血管擴(kuò)張和重塑受損，妊娠4.5 d的A10 δ EC小鼠子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞的核糖核酸測序顯示Notch靶基因(HEY1，HES1)的下調(diào)[43]。運(yùn)用植入后、胎盤形成前母體內(nèi)皮細(xì)胞缺失Jagged1的小鼠，探討母體螺旋動脈和蛻膜毛細(xì)血管在胎盤形成前如何支持胚胎發(fā)育，發(fā)現(xiàn)Notch信號通路的效應(yīng)物HEY2和錨蛋白重復(fù)蛋白(NRARP)的表達(dá)增加，從而增加了蛻膜重塑血管生成區(qū)域的內(nèi)皮細(xì)胞中Notch信號活性，VEGFR2表達(dá)減少，該病理變化僅限于植入部位的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞[44]。

4 結(jié)語與展望

Notch信號通路參與胚胎種植與蛻膜化機(jī)制，其相關(guān)配受體、轉(zhuǎn)錄因子、靶基因在母胎界面廣泛表達(dá)和分布，并受雌孕激素及絨毛膜促性腺激素的調(diào)節(jié)和互作，其通路相關(guān)蛋白和負(fù)調(diào)節(jié)因子的研究為Notch信號通路在胚胎種植和蛻膜化的作用提供了間接證明。URSA是排除染色體異常、內(nèi)分泌失調(diào)、解剖結(jié)構(gòu)異常及抗磷脂抗體綜合征等原因后的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，母胎界面Notch信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)失常導(dǎo)致滋養(yǎng)層侵襲或血管重塑異常均不利于胚胎的順利植入和發(fā)育，是URSA發(fā)病機(jī)制的可能性之一。URSA患者妊娠期間螺旋動脈的重塑程度與對照組相比明顯減輕，且與蛻膜NK細(xì)胞數(shù)量增加呈大致的同步變化[45]，螺旋動脈壁厚度也明顯增高，與蛻膜NK細(xì)胞的密度有關(guān)[46]，說明聚集在蛻膜組織螺旋動脈周圍的NK細(xì)胞對螺旋動脈重塑有著關(guān)鍵的作用——Notch信號通路不但參與到滋養(yǎng)層侵襲和螺旋動脈的過程中，甚至有可能通過調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的功能而發(fā)揮作用，有望據(jù)此進(jìn)一步展開研究。