MiRNA155-DNA 甲基化介導(dǎo)mitoKATP 調(diào)節(jié)線粒體自噬在芪參益氣滴丸改善心肌缺血再灌注損傷中的分子機制理論探討

何貴新，馮雨菲，秦偉彬，林 琳，胡夢弦，鄭國坤，玉黎燕，甲子永，韋 娟，文 琦，黃振樂，劉誓海

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530022；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530299）

心肌梗死是目前威脅人民生命的主要疾病之一，已然成為重大的公共衛(wèi)生問題。根據(jù)我國心血管病報告［1］，近年來心肌梗死的死亡率呈快速上升趨勢。再灌注策略可重新開通閉塞的血管，恢復(fù)缺血心肌的血氧供。然而，恢復(fù)過程可引起氧化應(yīng)激、心肌細胞凋亡、自噬和炎性細胞因子的釋放等多種病理過程，進一步加重心肌損害，即出現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury, MIRI）。積極有效地抑制心?；颊哐骰謴?fù)后的再灌注損傷，增加心肌細胞對MIRI 的抵抗力，對于進一步挽救受損心肌，改善患者預(yù)后，具有重大意義［2］。

研究表明，心肌缺血時線粒體功能受損是加重細胞壞死的重要因素。心肌缺血會降低肌膜下線粒體和原纖維間線粒體中的多種復(fù)合物活性，損害電子傳遞鏈（electron transport chain , ETC），影響電子傳輸功能。缺血對ETC 的損害可增加線粒體的活性氧（reactive oxygen species,ROS）的凈產(chǎn)量，過量的ROS 引發(fā)心肌進一步損傷，形成惡性循環(huán)［3，4］。而在缺血再灌注后，不僅ETC，包括中介代謝的多種途徑都承受著由ETC 引發(fā)的損害。這些受損線粒體是持續(xù)損傷和長時間再灌注過程中向心肌病過渡的有效刺激物。因此，及時清除受損線粒體對維持心肌組織穩(wěn)態(tài)、心肌細胞正常功能具有重大意義。研究證實,自噬是心臟穩(wěn)態(tài)和功能的一個主要調(diào)節(jié)器。自噬在基線條件下保留心臟結(jié)構(gòu)和功能，在應(yīng)激時被激活，限制了大多數(shù)條件下的損傷以保護心臟功能。它還通過限制錯誤折疊蛋白積累、線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激，減少慢性缺血性重構(gòu)并調(diào)節(jié)心臟對壓力過載的適應(yīng)［5］。因此，以調(diào)節(jié)線粒體自噬作為靶點的心肌保護方案是探索心血管疾病治療的新方向。

miRNAs 在病變組織中有差異表達，可以釋放到循環(huán)中以影響疾病的病程，因此，探求miRNAs 的診斷和治療作用，尋找疾病的調(diào)控機制及新的生物標志物已然成為研究的一個重要領(lǐng)域。已報道的miRNAs 作為基因表達的核心調(diào)控因子，其調(diào)控異?？捎绊懝谛牟〉鹊陌l(fā)病機制［6］。盡管已證實多個miRNA 在心血管疾病中發(fā)揮重要作用，miRNA 種類繁多，作用廣泛，目前了解及掌握的miRNA 調(diào)控基因及其參與疾病的作用機制只是龐大miRNA 家族的冰山一角，更多調(diào)控機制仍需進一步探究。既往miRNA 相關(guān)研究發(fā)現(xiàn), miRNA 啟動子DNA 甲基化水平的改變可直接導(dǎo)致其表達水平改變，參與其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,在疾病的發(fā)病機制、診斷識別及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［7-9］。近年來，已有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)miRNA-DNA 甲基化在心肌缺血的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用［10，11］。且動物實驗證明，部分中藥復(fù)方可以通過調(diào)控miRNA 或DNA 甲基化,進而顯著減少MIRI 后的心肌壞死面積，調(diào)節(jié)細胞自噬，抑制動脈粥樣硬化斑塊形成，但具體機制尚不清楚［12］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方芪參益氣滴丸能顯著改善MIRI 及調(diào)控細胞自噬功能，且細胞實驗證實芪參益氣滴丸可以激活mitoKATP 信號通路從而改善心肌缺血。另外，前期研究證實外泌體miR-155 在內(nèi)皮細胞自噬調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷、血管平滑肌細胞遷移等方面發(fā)揮著重要作用。然而，miR-155 啟動子區(qū)DNA 甲基化是否參與MIRI，目前尚未見報道。故筆者提出假說，芪參益氣滴丸通過調(diào)控miRNA155-DNA 甲基化調(diào)節(jié)線粒體自噬，進而緩解MIRI。相關(guān)理論探討研究如下：

1 心肌缺血后的氧化應(yīng)激損傷

心肌缺血發(fā)生時，線粒體再活化和氧的再生可導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過刺激多種破壞性因素從而介導(dǎo)心肌損傷。ROS 作為誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵因素，當(dāng)產(chǎn)生過多，超過了機體清除過氧化物的能力時，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡就會被破壞，導(dǎo)致組織的氧化損傷。MIRI 通過黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)，激活的中性粒細胞和線粒體呼吸鏈的功能出現(xiàn)異常，產(chǎn)生過量無氧的自由基。大量ROS 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是心肌細胞死亡、收縮和舒張功能下降的重要啟動因子［13］。事實上，心肌缺血后，僅能觀察到少量的氧自由基產(chǎn)生，而氧自由基爆發(fā)式增長則發(fā)生在再灌注后數(shù)秒鐘至1 min 以后。ROS 可直接攻擊生物膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，破壞心肌細胞和內(nèi)皮細胞膜結(jié)構(gòu)完整性。此外，ROS可引發(fā)細胞溶質(zhì)Ca2+超載，導(dǎo)致線粒體Ca2+過度增加，進而誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）打開，并使線粒體膜電位去極化。mPTP 的開放導(dǎo)致三磷酸腺苷（triphosadenine，ATP）的損失、線粒體腫脹和細胞色素C 的釋放，從而導(dǎo)致細胞凋亡［14］。另外，氧化應(yīng)激可介導(dǎo)的心肌細胞DNA 損傷。駱佳銘等［15］研究發(fā)現(xiàn)，加入抗氧化劑的缺氧/復(fù)氧H9C2 細胞DNA損傷明顯降低，同時抑制心肌損傷及凋亡，起到改善MIRI 的作用，證實氧化應(yīng)激介導(dǎo)的DNA 損傷可能密切參與MIRI 的發(fā)病過程。另外，ROS 還可以促進心肌梗死后的炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控心肌細胞凋亡并參與心肌梗死后的心肌重塑［16］。因此，有效清除過量的ROS 可能為減輕MIRI 提供理論基礎(chǔ)和治療靶點。

2 線粒體自噬與缺血后的氧化應(yīng)激損傷

心肌是一種高度氧化的組織，線粒體在維持心臟的最佳性能方面發(fā)揮著核心作用。線粒體是一種雙膜細胞器，內(nèi)膜為離子透膜，外膜為因子透膜，這種復(fù)雜的膜結(jié)構(gòu)使ATP 通過線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生。而在成年哺乳動物心臟中，線粒體氧化磷酸化負責(zé)產(chǎn)生95%的ATP。肌酸磷酸鹽穿梭系統(tǒng)將高能磷酸基從線粒體產(chǎn)生的部位運送到肌原纖維，以再生收縮過程中消耗的ATP。因此，細胞正常生存需要依賴線粒體功能和結(jié)構(gòu)的完整性。

自噬是一種溶酶體依賴的降解過程。線粒體自噬是典型的選擇性自噬，通過消除受損或功能障礙線粒體，以維持線粒體穩(wěn)態(tài)和細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。Lemasters［17］于2005 年首次提出“線粒體自噬”，強調(diào)在酵母菌中識別Uth1基因后，該過程的非隨機性證實線粒體自噬具有選擇性。隨著研究的深入，人們對線粒體自噬的過程及分子機制認識逐漸加強。目前，大致接受的線粒自噬途徑包括：泛素型、受體型和非典型的線粒體自噬途徑［18］?？傮w而言，線粒體自噬分為自噬誘導(dǎo)、自噬體形成、自噬融酶體形成以及降解四個階段。受損線粒體可引起其通透性發(fā)生改變及相關(guān)蛋白活化。線粒體膜上的蛋白質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的自噬小體相連接，逐漸包裹整個線粒體，后運送至溶酶體。被包裹的線粒體與溶酶體相融合，隨后線粒體溶酶體降解，細胞利用其中成分合成新的細胞器和蛋白質(zhì)。在心肌組織中，自噬隨著年齡的增長而減少，并且在衰老的心臟中積累了錯誤折疊的蛋白質(zhì)和功能失調(diào)的線粒體，因此，線粒體自噬是心肌細胞控制線粒體質(zhì)量的重要中介。Mito-Keima 小鼠的檢測表明，心臟的基礎(chǔ)線粒體自噬活性大于其他器官，如胸腺［19］，可能反映了高水平的氧化磷酸化、ROS 以及心肌細胞線粒體損傷。在應(yīng)激過程中，線粒體自噬被激活，允許清除受損的線粒體。同時，自噬與線粒體生物發(fā)生緊密耦連，因此被清除的線粒體不斷地被新的線粒體取代。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體自噬障礙可導(dǎo)致鈣穩(wěn)態(tài)的持續(xù)喪失、ROS 的過量產(chǎn)生、細胞能量和ATP 的產(chǎn)生受損，并最終導(dǎo)致細胞死亡［20］。在壓力過載引起的心力衰竭中，線粒體自噬的下調(diào)在介導(dǎo)線粒體功能障礙中是疾病發(fā)生的重要原因，因此，有效增加線粒體自噬可改善心臟功能障礙［21］。而在心肌缺血與缺氧過程中，心肌細胞中的線粒體的損傷產(chǎn)生大量的ROS 等促凋亡因子，線粒體自噬激活通過降解功能異常的線粒體以及降低ROS 水平進行質(zhì)量控制，同時促進ATP 生成，提供能量以維持細胞穩(wěn)態(tài)［22］。另外，線粒體自噬可減輕心肌細胞的炎癥反應(yīng)，在心肌損傷過程中起到抑制作用［23，24］。因此，有效的線粒體自噬對心肌缺血后的心肌保護發(fā)揮積極作用。

3 ATP 敏感性鉀通道與心肌缺血再灌注損傷

ATP 敏感性鉀通道是一種受細胞內(nèi)ATP 濃度調(diào)控的內(nèi)向整流鉀通道。KATP 通道是由4 個內(nèi)部整流鉀通道6（Kir6，Kir6.1 或Kir6.2）亞單位和4 個ABCC（atp 結(jié)合盒，亞家族C）家族成員磺酰脲受體（SUR，SUR1，SUR2A，或SUR2B）組成的異共體膜蛋白復(fù)合物［25］。KATP 通道可分為肌細胞膜型（sarcKATP）和線粒體型（mitoKATP）。KATP 通道大量存在于心肌組織中，并在心肌細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著至關(guān)重要的作用［26］。有研究表明，開放KATP 通道通過減少心肌細胞的損傷和凋亡進而對心肌起到保護作用［27］。KATP 通道的活動與細胞代謝密切相關(guān)，受到細胞內(nèi)ATP 濃度的調(diào)節(jié)：生理情況下，ATP 在細胞內(nèi)具有較高濃度，此時KATP 通道關(guān)閉；而當(dāng)心肌細胞受到缺血、再灌注損傷、細胞應(yīng)激和細胞凋亡等病理刺激時，細胞內(nèi)的ATP 會被消耗，濃度降低，從而誘發(fā)KATP 通道開放，鉀離子外流，穩(wěn)定細胞膜的靜息電位，同時縮短動作電位時間，減少鈣離子的內(nèi)流，減輕心肌細胞的鈣超載，降低心肌細胞的耗能，增加應(yīng)激耐受性，改善心肌損傷［28］。同時，也有研究表明，KATP通道在MIRI 的過程中具有抗心律失常的作用［29］。既往研究證實，mitoKATP 能夠阻止mPTP 的長期開放，從而保持線粒體的完整性，保證細胞能量狀態(tài)和促存活作用。同時，mitoKATP 通道在自噬調(diào)節(jié)過程參與的心臟保護中發(fā)揮重要作用［30，31］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，mitoKATP 信號通路對改善心肌缺血具有促進作用，而芪參益氣滴丸可有效激活mito-KATP 通道。

4 miRNA-DNA 甲基化參與心肌缺血再灌注損傷

miRNA 是一類內(nèi)源性非編碼小核糖核酸，包含18～24 個核苷酸。miRNA 可在轉(zhuǎn)錄后通過與靶mRNA 的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）結(jié)合，引起靶mRNA 的降解或沉默，從而誘導(dǎo)調(diào)節(jié)生理過程或信號通路。據(jù)估計，miRNAs 控制了30%～50%的蛋白編碼基因的活性。不同于在控制基因表達中具有開啟和關(guān)閉功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，miRNAs 可以根據(jù)環(huán)境條件的變化來微調(diào)蛋白質(zhì)表達水平。作為微管理器，miRNA 參與細胞存活、應(yīng)激反應(yīng)、增殖和凋亡［32］。例如，miR-145 直接靶向血管生成素-2，1，通過提高miR-145 水平可抑制Angpt2 表達來保護心肌細胞免受I/R 損傷［33］。miR-17-3p 促進心肌細胞肥大、增殖和存活。負向運動誘導(dǎo)的心臟生而長，包括心肌細胞肥大和心肌細胞增殖標志物的表達［34］，證實miRNA 對心肌細胞的直接及間接調(diào)控作用。

既往研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 因其自身具有高度保守性，在機體中充當(dāng)表觀遺傳調(diào)控作用，同時也受到其它表觀遺傳的調(diào)控作用，而在其受表觀遺傳調(diào)控機制中，miRNA 通過miRNA 靶結(jié)合DNMT1，3a，3b，TET2 或Drosha 促進DNA 甲基化修飾，從而間接引起靶基因啟動子甲基化水平及其基因表達水平變化［35，36］。miRNA 啟動子上的高甲基化可能表明miRNA 功能和生物發(fā)生減少。在hcy 誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化中，泡沫細胞中miR-124 的表達降低，而miR-124 啟動子DNA 甲基化水平升高，且呈劑量依賴性，故推測啟動子DNA 甲基化狀態(tài)可能是粥樣硬化的重要機制［37］。有研究表明，miRNA 的生物發(fā)生依賴于DNA 甲基化。當(dāng)miRNA 編碼序列的兩側(cè)區(qū)域高度甲基化時，miRNA 的表達水平更高，具有更大的序列保守性，比未甲基化位點編碼的miRNA 更有可能驅(qū)動癌癥相關(guān)表型［38］。

miR-155 是一種多功能的microRNA，最初被認為具有免疫調(diào)節(jié)功能，因為它在先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用［39］。隨著研究的深入，miR-155 的功能逐漸被揭示。miR-155 富集的外泌體抑制成纖維細胞增殖，促進成纖維細胞炎癥［40］。miR-155 缺失顯著降低了急性心肌梗死（AMI）后心臟破裂的發(fā)生率，改善了心功能。miR-155 也出現(xiàn)在巨噬細胞來源的外泌體中，它可以通過巨噬細胞來源的外泌體轉(zhuǎn)入心臟成纖維細胞。miR-155 模擬體或包含miR-155 的外泌體通過下調(diào)Son of Sevenless-1的表達來抑制心臟成纖維細胞增殖，并通過降低細胞因子信號抑制因子1 的表達來促進炎癥反應(yīng)［41］。目前，已有眾多研究發(fā)現(xiàn)miR-155 在內(nèi)皮細胞自噬調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、血管平滑肌細胞遷移等方面同樣發(fā)揮著重要作用，進而影響著缺血性心肌病和動脈粥樣硬化的發(fā)病機制過程［42］。筆者團隊前期研究已經(jīng)證實miR-155 具有心肌保護作用，然而，miR-155 的DNA 甲基化對于心肌缺血的影響并未見明顯報道。故筆者大膽猜想miRNA155-DNA 甲基化在MIRI 的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

5 芪參益氣滴丸改善心肌缺血再灌注損傷

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)理論中無“心肌缺血”的描述，但結(jié)合患者臨床表現(xiàn)，心肌缺血當(dāng)屬“胸痹心痛”、“真心痛”、“頭痛”、“眩暈”、“中風(fēng)”等病范疇。芪參益氣滴丸是由黃芪、丹參、三七、降香組成的中藥復(fù)方制劑，具有益氣通脈、活血止痛的作用。目前，芪參益氣滴丸被廣泛用于輔助治療心肌梗死和心力衰竭。動物實驗表明芪參益氣滴丸具有心肌保護作用，其可調(diào)節(jié)7nAChR 抗炎通路、SIRT3/β -catenin/PPARγ 信號通路以減輕AMI 損傷引發(fā)的炎癥反應(yīng)、細胞凋亡及心室重構(gòu)進而改善心臟功能［43，44］。代倩倩等［45］從循證醫(yī)學(xué)的思路證實芪參益氣滴丸可有效改善臨床PCI 術(shù)后的不良心血管事件，提高臨床療效，改善生活質(zhì)量和預(yù)后，且安全可靠。筆者團隊的前期研究亦證實，芪參益氣滴丸改善心肌梗死后心肌微循環(huán)障礙，抵抗MIRI 方面效果顯著［46-48］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，芪參益氣滴丸具有多通路、多靶點、多途徑的作用特性，其主要活性成分包括黃芪甲苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素、人參皂苷Rg1、丹參酮ⅡA 等，涉及鈣信號通路、cAMP 信號通路、CGMP-PKG 等多條通路，在能量代謝、氧化應(yīng)激、炎癥與凋亡、纖維化、線粒體功能調(diào)節(jié)等發(fā)揮作用，多方面保護心肌細胞，改善心臟重塑［49］。黃芪甲苷對AMI 具有心臟保護作用，其通過調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/Akt 信號通路來促進血管生成［50］。此外，黃芪甲苷可減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，減緩心肌損傷［51］。丹參酮ⅡA 可通過調(diào)控AngⅡ-（AT-1R）-Cx43 信號通路，改善冠心病血瘀證大鼠再灌注損傷的癥狀［52］。丹參酮ⅡA 磺酸鈉可減輕I/R 誘導(dǎo)的心肌損傷，通過減少炎癥和凋亡改善心功能，同時增強自噬［53］。人參皂苷1 可通過改善MIRI 后心肌梗死面積、心肌血流量和心功能下降、心肌結(jié)構(gòu)的改變，對心肌損傷起到抑制作用。同時，人參皂苷1 通過與RhoA 結(jié)合抑制心肌凋亡、調(diào)節(jié)能量代謝［54］。筆者在前期實驗研究中發(fā)現(xiàn)，芪參益氣滴丸可減少MIRI 的梗死面積，減輕心肌損傷，改善心臟功能。而miR-155 在內(nèi)皮細胞自噬調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、血管平滑肌細胞遷移等方面發(fā)揮著重要作用。因此，筆者推測益氣滴丸或可通過miRNA155-DNA 甲基化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，影響線粒體自噬，最終達到改善MIRI 的目的。

6 小結(jié)

筆者在前期研究的基礎(chǔ)上提出假說：芪參益氣滴丸可調(diào)控miR155-DNA 甲基化介導(dǎo)miKATP 通道，調(diào)節(jié)線粒體自噬，進而抑制心肌缺血再灌注損傷，改善AMI 后心功能的作用。本理論的提出或可為臨床有效抑制MIRI，為提高心肌梗死中醫(yī)藥治療效果奠定堅實的理論基礎(chǔ)。

作者貢獻度說明：

何貴新：確定文章題目方向，構(gòu)建文章框架，書寫文章摘要、開頭。負責(zé)文章書寫后的審閱及修改。馮雨菲：負責(zé)文章1～2 點的書寫，查閱文獻，后期協(xié)助一作審閱及修改文章。秦偉彬、林琳：負責(zé)文章3～5 點的書寫，查閱文獻，后期負責(zé)參考文獻的格式審閱。甲子永、黃振樂、劉誓海：負責(zé)整理查閱參考文獻，協(xié)助一作檢查文章。