基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)的丹貝益肺方對肺纖維化干預(yù)作用研究

蔡蕭君，江柏華，陸振華，王 濤，張碧海，王旭玲

（黑龍江省中醫(yī)藥科學院，黑龍 江哈爾濱 150036）

目前肺纖維化的基礎(chǔ)病理生理學尚不清楚。據(jù)估計，每10 萬人中有2.9～42.7 人感染此?。?］。從確診開始患者的平均生存期為2～3 年，目前還沒有有效的治療方法［2］。因此，研究該病的發(fā)病機制對于控制疾病的發(fā)展和有效藥物研制具有至關(guān)重要的作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學是今年來新興的高通量技術(shù)，基于網(wǎng)絡(luò)平臺數(shù)據(jù)共享的飛速發(fā)展和計算機應(yīng)用的快速普及，使得本技術(shù)在研究復(fù)雜疾病和復(fù)雜藥物方面得到廣泛應(yīng)用。在疫情期間更是得到廣泛的使用，并得到一系列良好的應(yīng)用結(jié)果［3-10］。

幾千年來，中醫(yī)藥為慢性肺疾病提供了有效的治療方法，包括減輕臨床癥狀、改善肺功能和鍛煉能力。目前對中藥配方和中藥單體的研究已被證明是治療肺纖維化的有效方法。丹貝益肺方出自黑龍江省中醫(yī)藥科學院，由江柏華教授自擬經(jīng)驗而成。此方為丹參30 g、黃芪30 g、平貝20 g、黨參20 g、麥冬20 g、桔梗20 g，川芎15 g、桃仁15 g、五味子15 g、補骨脂15 g、地龍各15 g 組成。其對肺纖維化療效確切［11-26］。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學技術(shù)研究丹貝益肺方對肺纖維化大鼠的干預(yù)作用，為臨床肺纖維化發(fā)病機制和丹貝益肺方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 丹貝益肺方成分收集

檢索CNKI 及TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）關(guān)于丹貝益肺方的成分信息，以丹貝益肺方構(gòu)成為檢索條目進行檢索，并繪制數(shù)據(jù)集，收錄整理相關(guān)丹貝益肺方所含成分的信息。

1.2 活性成分篩選

根據(jù)藥動學和藥效學的常規(guī)理論認識，藥物分子發(fā)揮藥效的前提是可以被吸收進入血液，并在體內(nèi)累積達到一定濃度后隨血液循環(huán)到達靶器官進而發(fā)揮藥效。因此能否被吸收入血是藥物分子發(fā)揮藥效的前提。本研究采用國際通用的類藥五原則對中藥所含上千種成分進行靶向篩查，以口服利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18 的標準對藥物所含化學成分進行篩選。獲得符合標準的潛在藥效成分。

1.3 預(yù)測靶標及靶基因的確定

本部分采用數(shù)據(jù)庫檢索和分子對接驗證形式對丹貝益肺方所含符合標準的成分進行靶點預(yù)測。TTD 數(shù)據(jù)庫（https：//db.idrblab.org/ttd/）與CTD數(shù)據(jù)庫（http：//ctdbase.org/）收錄了NCBI 基因數(shù)據(jù)和與疾病相關(guān)的現(xiàn)存已知的靶點信息數(shù)據(jù)，同時上述數(shù)據(jù)庫與OMIM 人類在線孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）收錄的全面數(shù)據(jù)基因相關(guān)聯(lián)。本研究基于上述數(shù)據(jù)庫對篩選后的活性成分進行靶點預(yù)測分析。同時將靶蛋白引入UniProt（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫追溯上游對應(yīng)靶蛋白的唯一靶基因名稱，并匯總和整理。

1.4 構(gòu)建基于丹貝益肺方活性成分、靶標、疾病的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

將丹貝益肺方活性成分與關(guān)鍵疾病靶點、疾病的數(shù)據(jù)信息帶入Cytoscape3.2.1 軟件，構(gòu)建丹貝益肺方對肺纖維化干預(yù)作用的活性成分、關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)圖。同時，為針對性確定丹貝益肺方的主要活性成分和與肺纖維化相關(guān)的疾病靶標，將丹貝益肺方體內(nèi)作用靶蛋白帶入Omicshare（https：//www.omicshare.com/）在線分析平臺進行GO 富集分析，分別進行Gene Ontology 的分子功能分析，生物過程分析和細胞組成分析。聚焦于肺部疾病特別是肺纖維化相關(guān)的關(guān)鍵代謝或生物學過程。

1.5 肺纖維化相關(guān)靶蛋白互做分析及配體受體分子對接驗證分析

對獲取到的與肺纖維化相關(guān)的靶蛋白帶入String（https：//string-db.org/）網(wǎng)站，進行蛋白互作分析（protein-protein interaction），用以輔助闡明丹貝益肺方對靶蛋白基靶基因的調(diào)控機制。同時從PDB 蛋白數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）檢索獲取靶蛋白的3D 結(jié)構(gòu)文件，并與之配位的藥物小分子模擬藥物吸收后的體內(nèi)過程進行對接，通過Discovery Studio 2.5 可視化軟件對上述過程進行模擬，以標準化流程對分子對接過程的空間位點和結(jié)合能進行客觀評價，并以結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol 作為對接可能的最低標準。

2 結(jié)果

2.1 丹貝益肺方活性成分篩選結(jié)果

通過TCMSP 及CNKI 數(shù)據(jù)庫檢索確定丹貝益肺方所含化學成分，即丹參、平貝、桃仁、地龍、川芎、桔梗、黃芪、黨參、補骨脂、麥冬、五味子。篩選符合OB≥30%、DL≥0.18 的成分進行整理。排除相同成分共得到成分72 個。其中丹參19 個、平貝20 個、桃仁33 個、川芎12 個、桔梗15 個、黃芪24 個、黨參19 個、補骨脂6 個、麥冬10 個、五味子45 個。由于成分過多，現(xiàn)將基本信息置于表1 中。

表1 丹貝益肺方活性成分信息表Tab 1 Active components of Danbei Yifei formula

2.2 丹貝益肺方活性成分、靶標、疾病的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析結(jié)果

丹貝益肺方活性成分、靶標、疾病的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中涉及133 個節(jié)點和899 條邊。由Cytoscape 3.2.1 軟件構(gòu)建活性成分、靶標、疾病的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖（圖1），其中網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性為0.051，平均相鄰節(jié)點數(shù)目為4.319，路徑長度2.145，平均網(wǎng)絡(luò)中心度為0.124。這表明丹貝益肺方的藥效成分可能存在一個成分同時與多個體內(nèi)靶蛋白相互作用的現(xiàn)象，也可能存在同意靶蛋白同時與多個成分相互作用的現(xiàn)象。由此看出方劑配伍的復(fù)雜性和網(wǎng)絡(luò)分析的直觀性。涉及疾病也與肺纖維化相關(guān)，如支氣管痙攣（組胺引起）、過敏性氣道炎癥、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺病、哮喘、炎癥、肺纖維化等。

圖1 丹貝益肺方成分、靶標、疾病的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系Fig 1 Network relationship among components of Danbei Yifei formula，target and disease

2.3 富集及靶點相互作用關(guān)系分析結(jié)果

將上述預(yù)測的與肺纖維化相關(guān)的靶標帶入軟件ClueGO 2.3.5 中進行GO 富集分析，以通路的Pvalue 小于0.05 為標準篩選出核心條目共計26 個，分別描述基因的分子功能、細胞組分、參與的生物過程。其中生物過程22 條、內(nèi)容為分別為二十醛生物合成過程、多細胞生物代謝過程、膠原代謝過程、膠原生物合成過程、吞噬功能的正調(diào)節(jié)、cAMP 生物合成過程的負調(diào)控、環(huán)化酶活性的調(diào)節(jié)、對銨離子的響應(yīng)、磷脂酶C 激活G 蛋白偶聯(lián)受體信號途徑、環(huán)化酶活性的正向調(diào)節(jié)、嗎啡反應(yīng)響應(yīng)、對銨離子的響應(yīng)、平滑肌收縮、G 蛋白偶聯(lián)受體信號途徑，與環(huán)核苷酸第二信使偶聯(lián)、磷脂酶C 激活G 蛋白偶聯(lián)受體信號途徑、細胞對銨離子的反應(yīng)、唾液分泌、平滑肌收縮的調(diào)節(jié)、腺苷酸環(huán)化酶抑制G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體信號通路、磷脂酶C 激活G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體信號途徑、血管收縮。細胞組分1 條，內(nèi)容為軸突終端應(yīng)答。分子功能3 條，內(nèi)容分別為神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、G-蛋白偶聯(lián)胺受體活性、磷脂酰肌醇磷脂酶C 活性。上述過程分析見圖2。上述過程大概分為4 類，即G 蛋白偶聯(lián)受體信號途徑與環(huán)核苷酸第二信使偶聯(lián)、二十醛生物合成過程、多細胞生物代謝過程、磷脂酶C 激活G 蛋白偶聯(lián)受體信號途徑，見圖3。所有富集分析涉及代謝通路及信號通路見圖4。

圖2 丹貝益肺方成分、靶標、疾病的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系Fig 2 Bar chart of GO analysis of Danbei Yifei formula

圖3 丹貝益肺方干預(yù)肺纖維化的GO 分析結(jié)果Fig 3 GO analysis results of Danbei Yifei formula in the intervention of pulmonary fibrosis

圖4 丹貝益肺方干預(yù)肺纖維化的GO 分析結(jié)果Fig 4 GO enrichment analysis of Danbei Yifei formula in the intervention of pulmonary fibrosis

采用STRING（https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫對丹貝益肺方干預(yù)肺纖維化進行靶蛋白互做分析。如圖5 所示，通過對蛋白互做網(wǎng)絡(luò)可視化分析可知，肺纖維化已經(jīng)證實的核心靶點是花生四烯酸5-脂氧合酶，其在丹貝益肺方的多味中藥的作用靶蛋白群中均有體現(xiàn)，如五味子所含原兒茶酸、丹參所含氨基琥珀酸、黨參所含辣椒素（辣椒素）和2，3-二羥丁二酸、黃芪所含蘆丁、山奈酚、香豆素和槲皮素都同時對肺纖維化的核心靶點花生四烯酸5-脂氧合酶有直接作用關(guān)系。除此之外，與肺纖維化相關(guān)的其他疾病如支氣管痙攣（組胺引起）、過敏性氣道炎癥、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺病、哮喘、炎癥、肺纖維化等在丹貝益肺方中都有成分靶標的相互作用體現(xiàn)。由此推斷丹貝益肺方配伍精當和協(xié)同起效的作用機制。

圖5 丹貝益肺方干預(yù)肺纖維化的體內(nèi)靶蛋白互做關(guān)系圖Fig 5 In vivo target protein interaction diagram of Danbei Yifei formula in the intervention of pulmonary fibrosis

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)果顯示丹貝益肺方所含活性成分涉及72 個，其中直接與肺纖維化疾病靶標相關(guān)的成分為五味子所含原兒茶酸、丹參所含氨基琥珀酸、黨參所含辣椒素（辣椒素）和2，3-二羥丁二酸、黃芪所含蘆丁、山奈酚、香豆素和槲皮素。目前針對肺纖維化的臨床診療手段主要以西藥為主，具有見效快、效果顯著等特點，但同時也對患者帶來易復(fù)發(fā)、副作用明顯等弊端。因此，亟待發(fā)現(xiàn)新的對肺纖維化有效的治療藥物。丹貝益肺方是中醫(yī)臨床應(yīng)用廣泛的有效經(jīng)典方劑，本次采用網(wǎng)絡(luò)藥理學技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)其含有的眾多成分都對肺纖維化有一定的作用療效。其具體的作用機制如下文闡述。

花生四烯酸5-脂氧合酶激活蛋白又稱5-脂氧合酶激活蛋白，是一種膜結(jié)合蛋白，5-脂氧基酶表達產(chǎn)生花生四烯酸，并以此調(diào)節(jié)合成的白三烯的量［27，28］，是炎癥和結(jié)締組織重塑的重要介質(zhì)。最近的研究表明，花生四烯酸5 脂氧合酶激活蛋白基因的一些單苷酸多態(tài)性與哮喘和動脈粥樣硬化等炎癥疾病的風險增加有關(guān)［29-32］。中醫(yī)理論認為肺與皮毛相表里，因此，肺病與皮膚系統(tǒng)疾病多存在內(nèi)在聯(lián)系。為此，有研究專項研究花生四烯酸5 脂氧合酶激活蛋白多態(tài)性與硬皮病之間的關(guān)系。實驗假設(shè)花生四烯酸5 脂氧合酶激活蛋白的單核苷酸多態(tài)性可能與硬皮病和/或其主要器官并發(fā)癥的風險相關(guān)。為了解決這一假設(shè)，在歐洲硬皮病試驗和研究組的硬皮病患者隊列中研究了七個單核苷酸多態(tài)性，它們被證明與其他炎癥疾病的高風險相關(guān)［33］。

腫瘤壞死因子是一種促炎性細胞因子，在肺纖維化的病理生理學中被認為是一種關(guān)鍵的介質(zhì)［34］。基于其作為疾病改良劑在肺纖維化治療中的療效，有研究曾以此為靶點，采用英夫利昔單抗阻斷腫瘤壞死因子治療1 例血清陽性RA 和肺纖維化患者［35］。