抗生素發(fā)酵工藝控制和染菌分析

鄭向偉 郭俊浩

（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，山東濟(jì)寧 272500）

0.引言

通常情況下在進(jìn)行抗生素生產(chǎn)時(shí)采用了微生物的純種培養(yǎng)方式，在培養(yǎng)期間只允許特定的微生物進(jìn)行生長(zhǎng)和發(fā)育。如果發(fā)酵期間除抗生素以外產(chǎn)生了其他的菌種或出現(xiàn)了其他的微生物，就會(huì)發(fā)生染菌反應(yīng)，會(huì)對(duì)抗生素的生長(zhǎng)質(zhì)量和整體的產(chǎn)量產(chǎn)生不良影響。在進(jìn)行抗生素發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，因?yàn)椴僮鳝h(huán)節(jié)比較復(fù)雜，及其容易出現(xiàn)染菌的情況[1]。要想對(duì)生產(chǎn)環(huán)節(jié)進(jìn)行有效的控制就要對(duì)導(dǎo)致染菌問(wèn)題發(fā)生的原因進(jìn)行全面的查找，并且制訂針對(duì)性的防控措施，才能進(jìn)一步提高生產(chǎn)的水平。

1.抗生素發(fā)酵工藝的控制技術(shù)

1.1 做好日常的檢查

（1）平板劃線(xiàn)及顯微鏡檢查。目前在對(duì)相關(guān)問(wèn)題進(jìn)行檢查時(shí)存在多種技術(shù)方法，只有及時(shí)發(fā)現(xiàn)污染源才能避免因?yàn)檫@項(xiàng)事故的不斷蔓延，導(dǎo)致?lián)p失問(wèn)題變得更加嚴(yán)重。因此在對(duì)污染問(wèn)題進(jìn)行判斷和檢查的過(guò)程中，需要選擇合適的技術(shù)和方法才能縮短這項(xiàng)工作的開(kāi)展時(shí)間。比較常用的方法主要存在平板劃線(xiàn)培養(yǎng)以及顯微鏡檢查技術(shù)、肉湯培養(yǎng)檢查技術(shù)。其中的平板劃線(xiàn)培養(yǎng)技術(shù)在應(yīng)用時(shí)是將已經(jīng)經(jīng)過(guò)滅菌處理的固體培養(yǎng)基，導(dǎo)入到滅菌的平板中，再放置培養(yǎng)箱中，保持37℃的試驗(yàn)溫度。在對(duì)其保溫24h之后，如果檢查不存在細(xì)菌等問(wèn)題，就可以正常使用。在對(duì)樣品進(jìn)行檢查期間，首先要在無(wú)菌的平板上進(jìn)行劃線(xiàn)操作，并且將其分別設(shè)置在27℃和37℃的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，確保樣品能夠適用低溫菌和嗜中菌的生長(zhǎng)環(huán)境。一般需要對(duì)樣品進(jìn)行8h的觀察，但這種檢測(cè)方式的準(zhǔn)確度比較低。生產(chǎn)人員要保證培養(yǎng)基的pH數(shù)值在7.0左右，還需要在其中設(shè)置1.0%的牛肉膏和0.5%的葡萄糖以及1.0%的瓊脂、0.5%的氯化鈉、1.0%的蛋白胨。如果采用顯微鏡的檢查方法進(jìn)行相關(guān)的操作，通常要對(duì)其進(jìn)行革蘭氏的染色，染色之后需要在高倍的顯微鏡下進(jìn)行有效的觀察，并且根據(jù)生產(chǎn)菌和雜菌的主要特征，對(duì)其進(jìn)行有效的分別，并且判斷是否出現(xiàn)污染的現(xiàn)象[2]。

（2）肉湯培養(yǎng)檢查。在進(jìn)行肉湯培養(yǎng)檢查技術(shù)應(yīng)用時(shí)，要將需要檢查的樣品倒入培養(yǎng)基中，并且對(duì)其進(jìn)行檢查，要保證肉湯培養(yǎng)基中不存在菌體，還要控制到27℃和37℃的溫度下，分別進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24h之后對(duì)其進(jìn)行有效的觀察，并且開(kāi)展取樣操作。這種方法經(jīng)常作用于培養(yǎng)基和無(wú)菌空氣是否存在菌體反應(yīng)的檢查過(guò)程中，并且將生產(chǎn)菌作為主要的指示菌進(jìn)行相關(guān)的操作。在進(jìn)行操作的過(guò)程中，主要存在葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基，要將pH值控制在7.2左右，還要設(shè)置0.5%的葡萄糖和0.3%的牛肉膏以及0.8%的蛋白棟、0.4%的酚紅溶液、0.5%的葡萄糖。在進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)時(shí)，如果采用以上方法都未發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中存在污染源，也不能判定未被污染。除上述技術(shù)方法之外，還可以從發(fā)酵期間是否存在異?，F(xiàn)象，對(duì)污染問(wèn)題的發(fā)生進(jìn)行準(zhǔn)確的判斷，例如溶解氧出現(xiàn)了劇烈的變化，pH數(shù)值的波動(dòng)速度比較快，排氣中的二氧化碳含量比較高或者菌體酶的活力比較旺盛。大多數(shù)情況下在發(fā)酵培養(yǎng)基因中使用玉米漿或者酵母粉進(jìn)行相關(guān)的配置，這些物料中的菌體含量比較大，在顯微鏡設(shè)備下難以進(jìn)行有效的觀察和判斷。在具體實(shí)施時(shí)要遵循相應(yīng)的原則，如果培養(yǎng)基出現(xiàn)了污染現(xiàn)象，則菌體會(huì)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，但如果菌體的數(shù)量增加數(shù)量比較少，與培養(yǎng)基中所含菌的形態(tài)保持一致，則可以判斷未存在污染的事件[3]。

1.2 準(zhǔn)確判斷導(dǎo)致這項(xiàng)問(wèn)題發(fā)生的原因

在對(duì)污染時(shí)間和程度進(jìn)行判定時(shí)，必須保證判斷結(jié)果的精確性。無(wú)論是接種之前還是接種之后出現(xiàn)了污染，無(wú)論是補(bǔ)料之前還是補(bǔ)料之后出現(xiàn)的污染都要對(duì)污染源的品種和具體的發(fā)生時(shí)間進(jìn)行準(zhǔn)確的判斷，還要查找是哪批料出現(xiàn)了問(wèn)題，要明確具體的菌型，才能對(duì)其進(jìn)行有效的防控。一般情況下在進(jìn)行取樣操作時(shí)，要在實(shí)驗(yàn)的環(huán)境下進(jìn)行處理，避免出現(xiàn)誤差的問(wèn)題。生產(chǎn)人員可以適當(dāng)?shù)卦黾尤拥臄?shù)量和頻率，特別是在進(jìn)行批量判斷時(shí)，如果內(nèi)部的情況比較復(fù)雜，要增加取樣的頻率，為判斷工作的開(kāi)展提供有效的依據(jù)。要想明確這項(xiàng)問(wèn)題的具體發(fā)生原因，生產(chǎn)人員還要對(duì)污染問(wèn)題的發(fā)生原因進(jìn)行全面的總結(jié)，要從根源上對(duì)這項(xiàng)問(wèn)題進(jìn)行扼殺。這項(xiàng)問(wèn)題的發(fā)生，會(huì)受到多種因素的影響，但主要的原因是因?yàn)椴僮髟O(shè)備出現(xiàn)了泄漏或者在進(jìn)行滅菌操作時(shí)存在失誤以及現(xiàn)有的技術(shù)更新速度比較慢、無(wú)菌空氣環(huán)境中存在有效的菌種[4]。一般情況下在發(fā)生污染問(wèn)題之后需要利用顯微鏡設(shè)備，對(duì)培養(yǎng)基無(wú)菌斜面和肉湯進(jìn)行全面的觀察，并且對(duì)導(dǎo)致相關(guān)問(wèn)題發(fā)生的原因進(jìn)行有效的判斷，并根據(jù)原因制定相應(yīng)的解決措施，杜絕污染問(wèn)題的發(fā)生。

也可以根據(jù)污染的時(shí)間對(duì)問(wèn)題進(jìn)行有效的判斷，早期可能是因?yàn)榉N子存在細(xì)菌，在對(duì)設(shè)備和培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌操作時(shí)，沒(méi)有對(duì)其進(jìn)行徹底的處理或者接種出現(xiàn)了失誤，無(wú)菌空氣中出現(xiàn)了菌體，導(dǎo)致發(fā)酵后期出現(xiàn)了污染問(wèn)題。中間補(bǔ)料存在污染和設(shè)備的泄漏以及生產(chǎn)人員的操作失誤也會(huì)引發(fā)相應(yīng)的問(wèn)題。種子帶菌是因?yàn)樵谶M(jìn)行了種子制作時(shí)，無(wú)菌樣品和使用之后的剩余樣品存在菌體。在對(duì)樣品進(jìn)行監(jiān)測(cè)時(shí)，沒(méi)有對(duì)所有的樣品進(jìn)行有效的處理，一些帶菌體的種子帶入操作環(huán)節(jié)會(huì)產(chǎn)生球菌，球菌會(huì)因?yàn)閾u瓶培養(yǎng)基未進(jìn)行滅菌處理而出現(xiàn)污染問(wèn)題。下在對(duì)原料進(jìn)行更換時(shí)，一次只夠換一種類(lèi)型的原料，其中就會(huì)引發(fā)大規(guī)模的污染現(xiàn)象。如果一直沿用傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝，無(wú)法對(duì)其全面的消除，使用搖瓶比較大的樣品進(jìn)行有效的處理，在未完全驗(yàn)證的情況下，需要引進(jìn)更加先進(jìn)的工藝進(jìn)行滅菌處理。但如果搖瓶裝量比較大，升溫速度慢，就會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)部出現(xiàn)污染問(wèn)題。在對(duì)種子的無(wú)菌樣品進(jìn)行監(jiān)測(cè)時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)樣品都處于正常的狀態(tài)，需要對(duì)其他生產(chǎn)環(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。一級(jí)種子罐中的污染問(wèn)題，是因?yàn)槲磳?duì)其進(jìn)行完全的檢驗(yàn)就帶入到發(fā)酵罐中，一般15h的時(shí)間內(nèi)發(fā)酵罐就會(huì)出現(xiàn)污染問(wèn)題。種子罐的無(wú)菌斜面可以通過(guò)鏡檢，對(duì)是否存在污染問(wèn)題進(jìn)行分析和判斷。在對(duì)培養(yǎng)基和設(shè)備進(jìn)行

滅菌操作時(shí)，如果未嚴(yán)格按照生產(chǎn)工藝的要求，對(duì)其進(jìn)行有效的處理，就可能引發(fā)芽孢等現(xiàn)象[5]。因?yàn)闊o(wú)菌樣品在使用的過(guò)程中極易出現(xiàn)污染問(wèn)題，在進(jìn)行設(shè)備應(yīng)用時(shí)，冷卻設(shè)備出現(xiàn)了泄漏的問(wèn)題，蛇形管和連消的裝置、噴淋冷卻器存在穿孔現(xiàn)象或者夾層存在老化或者故障問(wèn)題，也會(huì)引發(fā)污染現(xiàn)象，而污染現(xiàn)象的發(fā)生程度，與泄露的情況存在一定的聯(lián)系。

2.染菌問(wèn)題的發(fā)生原因

2.1 一級(jí)種子管接種存在缺陷

在進(jìn)行火焰接種時(shí)，會(huì)導(dǎo)致一級(jí)種子罐內(nèi)部出現(xiàn)污染問(wèn)題。在進(jìn)行接種處理時(shí)，生產(chǎn)人員沒(méi)有嚴(yán)格按照相應(yīng)的要求進(jìn)行環(huán)境的消毒，生產(chǎn)人員和消毒人員也沒(méi)有進(jìn)行密切的配合，保證各項(xiàng)操作的迅速完成，就會(huì)出現(xiàn)接種失敗的問(wèn)題[6]。

2.2 蒸汽質(zhì)量比較差

這項(xiàng)操作在實(shí)施的過(guò)程中會(huì)受到各種因素的影響，因?yàn)檎羝|(zhì)量的波動(dòng)幅度比較大，內(nèi)部可能會(huì)存在冷凝水問(wèn)題，且總蒸汽壓力比較低。一旦壓力出現(xiàn)了驟然上升或者下降的問(wèn)題都會(huì)對(duì)環(huán)境溫度產(chǎn)生一定的影響，引發(fā)濕飽和蒸汽。在這種情況下無(wú)法對(duì)其進(jìn)行有效的處理，會(huì)引發(fā)比較嚴(yán)重的污染問(wèn)題[7]。

2.3 空氣系統(tǒng)存在缺陷

過(guò)濾器設(shè)備在應(yīng)用的過(guò)程中出現(xiàn)性能降低等問(wèn)題，是因?yàn)槲廴締?wèn)題的發(fā)生導(dǎo)致空氣系統(tǒng)中存在有效的菌體。在進(jìn)行空氣過(guò)濾器設(shè)備安裝時(shí)，選用的設(shè)備質(zhì)量比較低或者高效濾芯的安裝質(zhì)量比較差，無(wú)菌環(huán)境中存在水分都會(huì)引發(fā)比較嚴(yán)重的污染問(wèn)題。無(wú)菌環(huán)境中的油分大多是出自復(fù)式空氣壓縮機(jī)設(shè)備。在對(duì)污染問(wèn)題進(jìn)行排查時(shí)要對(duì)無(wú)油潤(rùn)滑空壓機(jī)設(shè)備進(jìn)行有效的檢查[8]。

3.染菌問(wèn)題的防控措施

3.1 一級(jí)種子管接種缺陷防控措施

在進(jìn)行接種處理時(shí)，可以采用零磅接種或者壓差接種等技術(shù)，利用零磅接種技術(shù)進(jìn)行相關(guān)操作時(shí)，罐壓的瞬時(shí)速度為零時(shí)，外界的空氣可能會(huì)從接種處進(jìn)入到內(nèi)部引發(fā)污染問(wèn)題，因此要提高接種區(qū)域的潔凈度，可以將接種區(qū)域與其他區(qū)域進(jìn)行有效的隔離。生產(chǎn)人員要保證罐內(nèi)的衛(wèi)生，還要保證實(shí)驗(yàn)內(nèi)部始終處于密封的狀態(tài)，每次進(jìn)行接種處理之前要先開(kāi)展消毒操作[9]。

3.2 蒸汽質(zhì)量差防控措施

在生產(chǎn)時(shí)間允許的情況下，可以通過(guò)空消技術(shù)的應(yīng)用對(duì)蒸汽中的冷凝水進(jìn)行有效的排除。如果蒸汽環(huán)境處于干燥的狀態(tài)，可以進(jìn)行滅菌處理。在進(jìn)行滅菌操作時(shí)，要開(kāi)啟所有的的冷凝水閥門(mén)設(shè)備，排除內(nèi)部的冷凝水之后，要保證蒸汽中的含水量不斷減少，再進(jìn)罐處理。但這種技術(shù)屬于應(yīng)急方案，要想從根本上對(duì)問(wèn)題進(jìn)行消除，還需要對(duì)蒸汽鍋爐設(shè)備的性能進(jìn)行改良，要對(duì)容量和管路進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)和安裝，還要做好管道的保溫處理。在對(duì)管路進(jìn)行安裝時(shí)不能直接連接非消毒的設(shè)施，例如采暖設(shè)備等，避免管道之間的相互傳播。

3.3 空氣系統(tǒng)缺陷防控措施

在對(duì)這項(xiàng)問(wèn)題進(jìn)行預(yù)防時(shí)，首先要添加除油或者除水設(shè)備，要選擇性能更加優(yōu)越的設(shè)備類(lèi)型，還要做好定期的排水處理，尤其是周邊濕度比較大時(shí)，要提升排水的速率?？梢赃x擇無(wú)油潤(rùn)滑的空壓機(jī)設(shè)備，從根源上對(duì)這項(xiàng)問(wèn)題進(jìn)行有效的防控。如果無(wú)法對(duì)設(shè)備性能進(jìn)行有效的改造，可以在空氣過(guò)濾器設(shè)備上增加玻璃棉或者活性炭，減少油霧的阻力。在對(duì)過(guò)濾器熱備的濾芯進(jìn)行選擇時(shí)，要盡可能選擇比較可靠的生產(chǎn)商進(jìn)行產(chǎn)品的購(gòu)買(mǎi)，還要選擇更加先進(jìn)的檢測(cè)儀器和技術(shù)方法，對(duì)濾芯是否存在失效的問(wèn)題進(jìn)行準(zhǔn)確的判斷。在對(duì)高效過(guò)濾器設(shè)備進(jìn)行安裝時(shí)，要對(duì)滅菌管路進(jìn)行減壓或者粗略的處理，還要在進(jìn)出口管路上進(jìn)行監(jiān)測(cè)設(shè)備的安裝。要對(duì)各項(xiàng)構(gòu)件的尺寸是否合適進(jìn)行全面的檢查，還要對(duì)發(fā)酵環(huán)節(jié)的生產(chǎn)程序進(jìn)行優(yōu)化處理。

4.結(jié)語(yǔ)

我國(guó)當(dāng)前在進(jìn)行抗生素發(fā)酵技術(shù)研發(fā)和試驗(yàn)的過(guò)程中，已經(jīng)根據(jù)染菌問(wèn)題的發(fā)生制定了針對(duì)性的防控技術(shù)，生產(chǎn)人員也對(duì)這項(xiàng)工作進(jìn)行了高度的重視。但實(shí)際上在對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)進(jìn)行防控時(shí)，要從每一個(gè)環(huán)節(jié)開(kāi)始進(jìn)行預(yù)防。生產(chǎn)人員不僅要做好常規(guī)的檢查工作，還需要在原有工藝技術(shù)的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行持續(xù)的優(yōu)化和完善，要提高綜合的生產(chǎn)水平才能對(duì)生產(chǎn)期間存在的各項(xiàng)缺陷問(wèn)題進(jìn)行有效的控制。在我國(guó)發(fā)酵工藝不斷發(fā)展的現(xiàn)階段，一些新型的技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到發(fā)酵生產(chǎn)中，為整個(gè)行業(yè)的健康發(fā)展奠定了良好的基礎(chǔ)。