代謝組學(xué)在肺系疾病與證候研究中應(yīng)用現(xiàn)狀與展望

劉宣妤，陳夢(mèng)琦，李麗博，魏海峰，宋衛(wèi)娜，勞慧敏

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.德州市人民醫(yī)院，山東 德州 253000；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250011）

對(duì)中醫(yī)學(xué)辨病與辨證的科學(xué)化、客觀化與標(biāo)準(zhǔn)化的研究一直是推動(dòng)中醫(yī)現(xiàn)代化發(fā)展的關(guān)鍵點(diǎn)，先進(jìn)的組學(xué)方法與技術(shù)為中醫(yī)現(xiàn)代化研究提供了科學(xué)支持［1-2］。其中，代謝組學(xué)與中醫(yī)學(xué)辨證論治、整體觀念不謀而合，可以有效地展現(xiàn)在不同外界環(huán)境影響下，機(jī)體病理生理狀態(tài)中的代謝物動(dòng)態(tài)改變，同時(shí)對(duì)代謝產(chǎn)物特定組分共性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)客觀的特殊代謝產(chǎn)物，找到關(guān)鍵生物學(xué)標(biāo)志物，對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制、診療方案以及中醫(yī)不同證候的標(biāo)準(zhǔn)化研究提供思路和方向［3］。通過(guò)系統(tǒng)地歸納分析近年來(lái)代謝組學(xué)在肺系疾病及證候方面的研究進(jìn)展，提出問(wèn)題與思考，以展望代謝組學(xué)在中醫(yī)疾病及證候研究方面的應(yīng)用前景。

1 代謝組學(xué)的優(yōu)勢(shì)

代謝組學(xué)是具有高靈敏度、高分辨率和高通量的現(xiàn)代分析技術(shù)，與轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等同屬于現(xiàn)代組學(xué)研究的重要組成部分。與其他組學(xué)相比，代謝組學(xué)可以放大蛋白或基因所表達(dá)的細(xì)小變化，且更接近受試者表型，越來(lái)越成為組學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。

代謝組學(xué)應(yīng)用先進(jìn)的核磁共振（NMR）光譜、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）、超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）以及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）等技術(shù)，對(duì)機(jī)體體液（血液、唾液、腦脊液等）、細(xì)胞及組織中存在的低分子量代謝物進(jìn)行定量和定性分析。代謝組學(xué)是通過(guò)對(duì)機(jī)體內(nèi)源性小分子代謝物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化的精準(zhǔn)描述，實(shí)現(xiàn)對(duì)人體生理與病理情況的即時(shí)記錄，旨在通過(guò)發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)志物和代謝通路來(lái)闡明生物系統(tǒng)中涉及代謝物質(zhì)的生化過(guò)程，為疾病診斷、發(fā)病機(jī)制、治療與預(yù)后提供依據(jù)［4-6］。近年來(lái)，隨著代謝組學(xué)分析技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域的逐漸擴(kuò)大與深入，代謝組學(xué)技術(shù)在肺系疾病證候方面的研究也取得了長(zhǎng)足發(fā)展，為中醫(yī)辨病與辨證理念提供了強(qiáng)有力的系統(tǒng)生物學(xué)支持［7-9］。

2 代謝組學(xué)在肺系疾病臨床診斷中的應(yīng)用

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的支氣管肺炎、肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病、哮喘等均歸屬于中醫(yī)肺系疾病。據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，采用GC-MS、NMR、LC-MS等代謝組學(xué)技術(shù)，探尋與肺系疾病發(fā)病機(jī)制有關(guān)的生物標(biāo)志物，有利于疾病的早期正確診治與預(yù)后［10］。

2.1 代謝物質(zhì)可作為肺系疾病診斷的潛在生物標(biāo)志物

通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)機(jī)體體液進(jìn)行研究，探尋與發(fā)病機(jī)制有關(guān)的生物標(biāo)志物，有利于疾病的早期診 治［11］。

陳黎等［12］的一項(xiàng)研究通過(guò)比對(duì)哮喘患兒和健康兒童的尿液代謝，發(fā)現(xiàn)哮喘患兒組的α-L-吡喃甘露、D-葡萄糖、肌醇、β-D-呋喃木糖等顯著升高，蘇氨酸、磷酸鹽顯著降低，提示哮喘與氨基酸代謝、能量代謝、腸道菌群代謝有相關(guān)性。

WU Huan等［13］研 究雄性C57BL/6小鼠 在 肺癌發(fā)病和發(fā)展過(guò)程中血漿的代謝變化，有15種失調(diào)的代謝產(chǎn)物如膽固醇硫酸鹽、替格雷卡尼汀、2-硬脂酰甘油過(guò)磷酸肌醇等被識(shí)別，并涉及甘油磷脂代謝、脂肪酸代謝等。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，代謝物二乙酰丙胺是非小細(xì)胞肺癌的極好預(yù)測(cè)因子［14］。

Rindlisbacher Barbara等［15］對(duì)肺纖維化（IPF）患者血清進(jìn)行取樣檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)血清中潛在溶血卵磷脂和3-羥基癸酰肉堿水平升高，顯示溶血卵磷脂-脫脂轉(zhuǎn)化酶途徑在肺纖維化中具有關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，脯氨酸和甲硫氨酸可能是肺纖維化的潛在生物標(biāo)志物，并顯示代謝組學(xué)的介入可填補(bǔ)目前肺纖維化在診斷和預(yù)測(cè)能力缺乏敏感性與特異性的空 缺［16-17］。

以上研究證實(shí)了這些內(nèi)源性生物標(biāo)志物作為潛在診斷指標(biāo)的可行性。

2.2 代謝物可用于臨床病原學(xué)診斷

目前病原檢測(cè)技術(shù)不斷改進(jìn)，但精準(zhǔn)識(shí)別方法具有有創(chuàng)性，而無(wú)創(chuàng)識(shí)別方法診斷作用有限或所需檢驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)早期、精準(zhǔn)病原診斷仍有困難，代謝組學(xué)技術(shù)為解決這一難題提供了新思路［18］。有研究采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，用肺炎鏈球菌與病毒性肺炎患兒的尿液進(jìn)行代謝組學(xué)分析，結(jié)果初步表明不同類(lèi)型的肺部感染以不同的方式影響其代謝組，肺炎球菌性肺炎中腎上腺類(lèi)固醇途徑的破壞更為嚴(yán)重，病毒性肺炎患兒尿液的甘氨酸-L-羥基脯氨酸濃度上調(diào)，這一發(fā)現(xiàn)有利于對(duì)肺炎病原體的早期鑒別［19］。另一項(xiàng)研究對(duì)肺炎支原體感染小鼠血清進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示維生素A、鳥(niǎo)氨酸、色氨酸等水平下降，次黃嘌呤和尿酸等水平上調(diào)，涉及17條代謝通路，包括視黃醇代謝、甾類(lèi)激素合成、精氨酸與脯氨酸代謝等。此項(xiàng)發(fā)現(xiàn)有助于構(gòu)成肺炎支原體肺炎代謝網(wǎng)絡(luò)及臨床早期快速、精準(zhǔn)的病原診斷［20］。

2.3 機(jī)體代謝物可用于疾病重癥、危重癥的識(shí)別

潛在生物標(biāo)志物水平的差異能為疾病臨床分級(jí)及診療提供幫助，以實(shí)現(xiàn)早期預(yù)警與早期干預(yù)，降低疾病重癥化。有學(xué)者對(duì)重癥哮喘患兒、非重癥哮喘患兒和健康兒三組進(jìn)行對(duì)比觀察，對(duì)呼出氣冷凝液采用質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，研究顯示維生素D、腺苷酸、血栓素B2、視黃酸指標(biāo)能夠有效區(qū)分三者，尤其在重癥哮喘組，維生素D水平明顯下調(diào)，且下調(diào)水平與重癥哮喘嚴(yán)重程度呈相關(guān)［21］。Viswan Akhila等［22］應(yīng)用核磁共振技術(shù)對(duì)兩組樣本（包括輕度和中度/重度急性呼吸窘迫綜合征組）的肺泡灌洗液進(jìn)行檢測(cè)，顯示6種代謝產(chǎn)物包括賴氨酸、精氨酸、牛磺酸、谷氨酸等被識(shí)別，可用于區(qū)分輕度和中度/重度急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），多條代謝途徑被識(shí)別。該項(xiàng)研究通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)更好地解釋ARDS的嚴(yán)重程度分類(lèi)。

2.4 代謝物改變與疾病死亡風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)

通過(guò)對(duì)疾病過(guò)程中生物標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)觀測(cè)，密切關(guān)注疾病嚴(yán)重程度變化，有助于改善患者預(yù)后情況，降低病死率。何權(quán)等［23］對(duì)健康成人與重癥社區(qū)獲得性肺炎患者包括存活組和死亡組的血漿代謝物進(jìn)行分析，顯示5-羥色胺水平在各組存在差異，其中在重癥肺炎組中，死亡組5-羥色胺水平顯著低于存活組，而重癥肺炎組的5-羥色胺水平又明顯低于健康組，提示5-羥色胺水平越低，重癥肺炎預(yù)后越不佳。這一研究結(jié)果提示，代謝組學(xué)技術(shù)可為肺系疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后情況進(jìn)行早期預(yù)警。

代謝組學(xué)還可以將代謝產(chǎn)物與死亡風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)，以期找到具有疾病預(yù)測(cè)性和預(yù)后性的生物標(biāo)志物［24］。有研究基于液相色譜和氣相色譜/質(zhì)譜方法研究重度慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者（包括平均2年后死亡的非幸存者及存活患者）和健康對(duì)照組之間的代謝譜差異，顯示重癥COPD患者氨基酸支鏈減少，棕櫚酰和硬脂酰鞘磷脂增加，這一現(xiàn)象可能與能量代謝、氧運(yùn)輸、線粒體功能障礙以及凝血級(jí)聯(lián)有關(guān)［25］。與重癥COPD的幸存組相比較，非幸存組代謝物中乳酸、果糖、木糖酸鹽及三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物支鏈氨基酸消耗的增加更為顯著，與線粒體功能障礙相關(guān)。

2.5 體內(nèi)代謝物的差異有利于疾病分型

有學(xué)者利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLCMS）及GC-MS技術(shù)分析了兩種組織學(xué)亞型的原發(fā)性肺癌患者與健康人群的肺組織樣本。與正常肺組織相比，兩種原發(fā)性肺癌組中的核苷酸代謝存在變化，尤其在鱗狀細(xì)胞癌組織中變化更為顯著。還發(fā)現(xiàn)黃嘌呤核苷50-單磷酸的表達(dá)僅在鱗狀細(xì)胞癌樣本中發(fā)生顯著變化，且20-氧甲基鳥(niǎo)苷和5-甲基尿苷對(duì)鱗狀細(xì)胞癌具有最高預(yù)測(cè)能力，而5，6-二氫尿嘧啶和肌苷對(duì)腺癌具有最高的預(yù)測(cè)能力［26］。這揭示了在腺癌和鱗狀細(xì)胞癌病例中存在明顯的代謝物變化，意味著兩種組織學(xué)亞型以不同的方式調(diào)節(jié)核苷酸代謝。此項(xiàng)研究表明代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)肺系疾病臨床分型具有一定意義。

3 代謝組學(xué)與肺系疾病證候相關(guān)性研究

代謝組學(xué)研究不僅為肺系不同疾病的診斷提供了科學(xué)依據(jù)，對(duì)肺系疾病不同證候的鑒別與診療等也具有應(yīng)有價(jià)值。從中醫(yī)學(xué)角度出發(fā)，辨證論治是中醫(yī)學(xué)的診治特色，“證候”是對(duì)人體受內(nèi)外界復(fù)雜因素影響所致機(jī)體動(dòng)態(tài)變化的特征總結(jié)，精準(zhǔn)辨證是探究人體平衡破壞情況的關(guān)鍵所在。中醫(yī)通過(guò)四診采集患者機(jī)體的各種信息，做出最精準(zhǔn)的個(gè)體化診療方案。如果把宏觀視為證候，微觀視為其內(nèi)在本質(zhì)，那么可以通過(guò)現(xiàn)代的代謝組學(xué)技術(shù)來(lái)表現(xiàn)這種內(nèi)在本質(zhì)，這為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化發(fā)展提供了新的思路［27-28］。以下總結(jié)概述了肺系疾病常見(jiàn)證候的相關(guān)代謝組學(xué)研究成果。

3.1 風(fēng)寒郁肺證

任靖等［29］基于GC-MS技術(shù)對(duì)健康兒童組與病毒性肺炎風(fēng)寒郁肺證組血清進(jìn)行代謝組學(xué)分析。研究表明，風(fēng)寒郁肺組與對(duì)照組血清中代謝產(chǎn)物存在顯著性差異，以氨基酸類(lèi)為主，尤其是天冬氨酸和支鏈氨基酸水平在病毒性肺炎風(fēng)寒郁肺組明顯上升，并涉及5條相關(guān)的靶標(biāo)代謝通路異常。

3.2 痰熱壅盛證

楊秀云等［30］的一項(xiàng)研究顯示，COPD急性加重期痰熱壅肺證患者血清中膽堿、異亮氨酸、1-甲基組氨酸等差異代謝物下調(diào)，而3-羥基丁酸、丙酮酸和谷氨酰胺等差異代謝物上調(diào)，提示COPD痰熱壅肺證患者存在顯著的能量和蛋白質(zhì)代謝紊亂。孫瑗［31］基于UPLC-MS技術(shù)對(duì)急性加重期COPD痰熱壅肺證患者血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與急性加重期COPD患者相關(guān)的代謝通路有9條（花生四烯酸代謝、糖基磷脂酰肌醇錨定生物合成等）被識(shí)別，急性加重期COPD痰熱壅肺證患者所涉及的7條代謝通路異常，包括甘油磷脂代謝、鞘脂類(lèi)代謝等，這可能與脂肪、氨基酸代謝紊亂相關(guān)。

同時(shí)研究者們還發(fā)現(xiàn)，代謝組學(xué)研究結(jié)果可以有效闡釋中醫(yī)“同病異治”理論?！巴‘愔巍笔侵嗅t(yī)診治法則的特色，是對(duì)中醫(yī)辨證論治理論的體現(xiàn)。探尋同一肺系疾病不同證候間代謝物質(zhì)的差異，為臨床疾病不同證型鑒別及選方用藥提供了有力的代謝組學(xué)支持。有研究者通過(guò)GC-MS/MS技術(shù)對(duì)小兒支氣管哮喘（發(fā)作期）痰熱阻肺證與非痰熱阻肺證患者的尿液進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)痰熱阻肺證患者9種代謝產(chǎn)物水平下調(diào)（包括草酸、嘧啶、L-蘇氨酸等），4條代謝通路發(fā)生改變（包括戊糖磷酸途徑、肌醇磷酸代謝等）［32］。

邊遜等［33］對(duì)毛細(xì)支氣管炎痰熱閉肺證與風(fēng)熱閉肺證患者的代謝組學(xué)特征進(jìn)行分析，結(jié)果表明不同中醫(yī)證型間代謝物存在顯著性差異，識(shí)別到痰熱閉肺證較風(fēng)熱閉肺證有13種差異生物標(biāo)志物，包括1-蘇氨酸、犬尿酸、L-蘇糖醇、果糖等，同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)兩種證型間具有差異性的代謝通路改變。以上研究顯示，代謝組學(xué)在證候鑒別方面具有較大的應(yīng)用價(jià)值，有利于臨床精準(zhǔn)辨證論治。

3.3 寒飲伏肺證

姚夢(mèng)雪等［34］對(duì)寒飲伏肺證哮喘大鼠血清、尿液成分進(jìn)行GC-MS技術(shù)檢測(cè)。結(jié)果顯示，與健康組相比，模型組有37種差異性代謝物被識(shí)別，其中十七烷、D-（-）-塔羅糖、軟脂酸、丁二酸、己二酸等9個(gè)差異代謝物水平上升；D-松醇、硬脂酸、乳酸、核糖酸、磷酸（3∶1）、甘油、L-蘇糖酸等28個(gè)差異代謝物質(zhì)水平下降。研究還篩選了7條相關(guān)代謝通路，包括肌醇磷酸代謝、乙醛酸與二羧酸代謝、檸檬酸代謝等。這有助于對(duì)哮喘寒飲伏肺證發(fā)病機(jī)制及其診療的研究。

宋紅等［35］的一項(xiàng)研究基于1HNMR技術(shù)檢測(cè)小青龍湯證（寒飲伏肺證）實(shí)驗(yàn)大鼠的肺組織觀測(cè)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)與健康組相比，模型組（寒飲伏肺證）中甲硫氨酸、蘇氨酸等水平下調(diào)，組氨酸、纈氨酸、?；撬岬人缴险{(diào)。

3.4 氣陰兩虛證

周賢梅等［36］采用GC-MS技術(shù)對(duì)肺癌氣陰兩虛證患者呼出氣冷凝液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明氣陰兩虛組肺癌患者呼出氣冷凝液中3，5-二叔丁基苯酚、二十三烷酸、甲氧基甲酯存在差異。除此之外，1-（苯基磺?；┻量┍话l(fā)現(xiàn)是氣陰兩虛證特有代謝物質(zhì)。

劉海葉等［37］采用HPLC-MS技術(shù)方法對(duì)COPD穩(wěn)定期氣陰兩虛證患者的血漿成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示代謝物質(zhì)具有明顯差異，存在多條代謝通路異常，包括氨基酰-tRNA生物合成、谷胱甘肽代謝、氮代謝等。這可能為COPD氣陰兩虛證的診斷提供幫助。

3.5 腎虛證

宋紅等［38］基于NMR技術(shù)聯(lián)合PCA、OPLS-DA等對(duì)腎氣虛哮喘模型大鼠與正常組大鼠血清進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果顯示腎氣虛哮喘組比正常對(duì)照組血中脂類(lèi)含量高，并且亮氨酸、異亮氨酸、3-羥基丁酸等氨基酸水平上升，這說(shuō)明膽堿、氨基酸、脂類(lèi)含量與哮喘腎氣虛證有關(guān)。

嚴(yán)興海等［39］將腎虛組、肺虛組哮喘緩解期患者血漿作為標(biāo)本，通過(guò)NMR技術(shù)進(jìn)行代謝組學(xué)分析。研究發(fā)現(xiàn)與肺虛組比較，腎虛組患者血漿中肌酐、肌酸、乳酸等水平明顯降低，丙酮、乙酰乙酸等水平顯著升高。結(jié)果表明腎虛緩解期哮喘患者在能量消耗、機(jī)體失衡狀態(tài)和免疫功能紊亂方面更為嚴(yán)重，這一研究結(jié)果從代謝組學(xué)角度豐富了“久病及腎”的理論內(nèi)涵。

4 肺系疾病代謝組學(xué)研究中存在的問(wèn)題及展望

現(xiàn)代的代謝組學(xué)技術(shù)與中醫(yī)基礎(chǔ)理論相契合，運(yùn)用先進(jìn)的設(shè)備進(jìn)行分析、檢測(cè)，尋找有效的生物標(biāo)志物，為肺系疾病證候研究提供有力代謝組學(xué)支持，推動(dòng)中醫(yī)藥科學(xué)化、現(xiàn)代化、定量化的發(fā)展。隨著研究的不斷深入，代謝組學(xué)在肺系疾病方面的研究還存在一些問(wèn)題。

一方面，代謝組學(xué)尋找相關(guān)生物標(biāo)志物不是最終目的，借助代謝組學(xué)差異代謝物來(lái)探索其作用機(jī)制及對(duì)不同表型結(jié)果的影響是今后努力的方向。為此，代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用及構(gòu)建肺系疾病的代謝網(wǎng)絡(luò)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)肺系疾病及證候動(dòng)態(tài)變化的了解，尤為重要。

另一方面，全面廣泛的非靶向代謝組學(xué)在差異代謝物的精確度上表現(xiàn)不足，可初步表達(dá)機(jī)體對(duì)刺激的反應(yīng)變化。而靶向代謝組學(xué)研究可以明確代謝產(chǎn)物的特異性，通過(guò)“特寫(xiě)模式”，對(duì)差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行更加深入的分析，獲得可靠性更高的數(shù)據(jù)信息，這逐漸成為系統(tǒng)生物學(xué)的重要研究方式。

最后，肺系疾病代謝組學(xué)中證候?qū)W研究缺乏廣度和深度，需要加強(qiáng)對(duì)證候本質(zhì)內(nèi)涵的深入探索，擴(kuò)大樣本量及獨(dú)立樣本，逐漸豐富臨床證候量表，跟進(jìn)證候后續(xù)研究，以增強(qiáng)證候研究的客觀性。相信在不久的將來(lái)，代謝組學(xué)技術(shù)在肺系疾病及證候方面的研究將取得長(zhǎng)足發(fā)展。