3D打印技術構建含界層結構關節(jié)骨軟骨支架的現(xiàn)狀與展望

楊 柳，黃 楊 400038 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(第三軍醫(yī)大學)第一附屬醫(yī)院關節(jié)外科

關節(jié)內上、下骨端覆蓋一層光滑而富有彈性的關節(jié)軟骨(articular cartilage, AC)，鈣化軟骨層(calcified cartilage zone, CCZ)位于骨與軟骨之間，三者共同構成關節(jié)骨軟骨單元。關節(jié)軟骨內無血管和淋巴管，細胞密度很低，自我修復能力很弱，受到創(chuàng)傷或發(fā)生疾病后，往往進展成為整個骨軟骨單元的病損——關節(jié)骨軟骨缺損。在臨床上，各種傷病所致的關節(jié)骨軟骨缺損十分常見，其關節(jié)鏡手術檢出率可達19.2%；若未給予很好的干預治療，其骨軟骨缺損則可加速整個關節(jié)的退變，最終發(fā)展成為重度骨關節(jié)炎，嚴重影響患者身心健康和生活質量，同時給社會和家庭帶來巨大經(jīng)濟負擔。

目前臨床上針對關節(jié)骨軟骨缺損的治療方法，包括非手術治療及關節(jié)清理術、微骨折術、自體骨軟骨移植或馬賽克鑲嵌成形術、自體軟骨細胞移植術(autologous chondrocyte implantation，ACI)及基質誘導自體軟骨細胞移植術(matrix-associated autologous chondrocyte implantation，MACI)等手術治療，但是遠期療效均不能令人滿意。其中，微骨折術后的缺損修復組織為纖維軟骨，較透明軟骨的力學及潤滑性能均相差甚大；自體骨軟骨移植及ACI手術治療均類似于拆東墻補西墻，而且移植物或移植細胞的來源受限，同時缺損面積大于4 cm或者35歲以上患者的療效不理想。

組織工程技術策略旨在通過將種子細胞、生長因子與組織支架復合的方法再生修復損傷組織的結構與功能。關節(jié)軟骨組織成分相對單一，結構相對簡單，沒有復雜的脈管系統(tǒng)，其組織工程實現(xiàn)難度較低，被視作治療關節(jié)骨軟骨缺損最有應用前景的技術方案。自20世紀90年代以來，關節(jié)軟骨及骨組織工程研究已取得了較大進展，但同時存在著諸如組織過度纖維化、移植物下沉、異常骨形成、軟骨過度生長及支架分離等缺點。與天然關節(jié)骨軟骨組織相比，單層或雙層支架在軟骨和骨之間缺乏“界層結構”——鈣化軟骨層，導致關節(jié)軟骨與軟骨下骨(subchondral bone, SB)各自的微環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，以及應力傳導方式改變，最終造成其修復結果失敗。為了實現(xiàn)其完全仿生，研究人員嘗試了多種方案以構建含界層結構的關節(jié)骨軟骨多層支架。近年來，隨著新工業(yè)革命的增材制造技術的出現(xiàn)，3D打印技術迅猛發(fā)展，為解決這一難題提供了新的工具手段和技術方法，相關研究已取得了顯著進展。本文將從關節(jié)骨軟骨單元組分與結構功能、構建其界層結構的必要性、3D打印技術方案及單層與多層支架構建效能的對比等幾個方面，述評3D打印技術構架含界層結構關節(jié)骨軟骨多層支架的科學意義、技術方法及其未來前景。

1 關節(jié)骨軟骨單元組分與結構功能

人體關節(jié)骨軟骨單元組織由三部分構成，即關節(jié)軟骨(AC)、軟骨下骨(SB)及其之間的界層結構——鈣化軟骨層(CCZ)，其組織成分、纖維排列、細胞群落及機械性能互不相同。其中AC和SB的物理、化學及生物學特征已有很多研究報道，而CCZ的解剖部位特殊且較為隱蔽，同時對其研究的技術方法有限，致使其成為關節(jié)骨軟骨單元研究領域的難點。

CCZ是一種天然的界層結構，即在成熟滑膜關節(jié)內，位于AC和SB之間的一層鈣化軟骨組織。相關研究結果顯示，CCZ形態(tài)致密，以“齒梳”狀形態(tài)與SB相鉚合，厚度為(104.16±20.87)μm，主要干質量成分為Ⅱ型膠原(20.16±0.96)%、羥基磷灰石(65.09±2.31)%，壓縮彈性模量為(208.6±39.7)MPa，拉伸彈性模量為(178.3±35.9)MPa，較透明軟骨硬10倍，為骨硬度的1/60。這種特殊的形貌特征、組成成分賦予了CCZ獨一無二的力學特性，使得關節(jié)在運動時的力學沖擊在CCZ處得到顯著衰減。更重要的是，CCZ可將關節(jié)軟骨的剪切力轉化為壓應力傳遞至SB，從而大大降低了關節(jié)軟骨被壓碎和撕裂的可能性。

CCZ除具有獨特的力學功能外，還具有重要的屏障作用。關節(jié)軟骨與軟骨下骨之間的物質交換是否被CCZ完全阻隔，還是存在著部分的物質交換，一直以來均存在著爭議，而大多數(shù)學者認為CCZ的存在致使關節(jié)軟骨與軟骨下骨之間的物質交換非常困難。一項活體成熟/未成熟小鼠CCZ通透性的原位觀測研究結果顯示，無論是羅丹明B(476)還是熒光標記的葡聚糖(20×10)，成熟小鼠的CCZ對兩種熒光示蹤劑均具有阻隔效應(以潮線為界限)，而發(fā)育未成熟小鼠的CCZ則無這種阻隔效應。CCZ的這種屏障作用的變化，在關節(jié)軟骨的發(fā)育形成，以及維持正常軟骨的生理功能過程中均扮演著重要的角色，但其具體機制目前尚未闡明。此外，含天然CCZ骨軟骨支架修復小香豬膝關節(jié)骨軟骨缺損的實驗研究發(fā)現(xiàn)，對照不含天然CCZ骨軟骨支架組，含天然CCZ骨軟骨支架取得了再生修復的優(yōu)良效果。這一結果表明，重建CCZ結構在關節(jié)骨軟骨缺損再生修復中的必要性。

綜上，CCZ是關節(jié)軟骨與軟骨下骨之間的一種特殊過渡結構，以其獨有的方式，在化學成分、力學作用及生物學性能上連接了機體兩種完全不同的組織，其完整性對于維持關節(jié)骨軟骨的生理微環(huán)境和生理功能至關重要。因此，在設計制造關節(jié)骨軟骨復合組織支架時，需要考慮其包含CCZ的構建技術和方法。

2 3D打印構建技術

在天然機體組織中，關節(jié)軟骨多糖鏈之間的孔徑約為6 nm，膠原纖維網(wǎng)絡的孔徑為60～200 nm，并且豎直延續(xù)至CCZ。與AC不同，CCZ和SB的內部結構更加致密，而關節(jié)骨軟骨組織單元又是一個有序相連的整體，這種結構特征的差異性為仿生制造含CCZ關節(jié)骨軟骨復合組織工程支架帶來了很大的挑戰(zhàn)，特別是如何考慮其構建的原材料選擇及其構建的技術方案。目前，3D打印構建關節(jié)骨軟骨復合組織工程支架的最常用技術包括：材料擠出(material extrusion, ME)、熔融電寫(melt electro-writing, MEW)、靜電紡絲(electro-spinning, ES)、光固化(stereolithography, SLA)及數(shù)字光處理(digital light processing, DLP)。

2.1 材料擠出技術

材料擠出(ME)技術是通過噴嘴移動材料以將其沉積在X-Y軸平面上的打印床上，然后在Z軸平面上逐層堆加。因此，在標準ME打印中，所有沉積的材料需要(至少部分需要)構建在底面層級的支撐材料或支撐浴上。

ME打印技術允許使用多種材料，包括熱聚合物、水凝膠及生物陶瓷，其中每種類別的打印材料或復合材料均需要微調打印參數(shù)，例如溫度、擠出壓力、打印速度、水凝膠交聯(lián)或凝膠化的速度。ME的優(yōu)勢在于可以創(chuàng)建相對多孔的高孔隙率支架，使種子細胞得以黏附增殖和容易向組織內生長。研究顯示，具有較小孔徑(<0.1 mm)的支架可以幫助新軟骨形成，而具有較大孔徑(>0.3 mm)者可以促進細胞成骨的生長。

基于熱聚合物的ME技術能夠打印出與SB最相近的多孔結構。在多相骨軟骨支架的SB部分，其孔徑通常為0.3～1.0 mm，孔隙率為70%～80%。使用基于熱聚合物材料調控支架的孔隙率范圍和孔徑大小，能夠促進骨生長，很適合用于制造骨軟骨支架的SB部分。

基于生物陶瓷的ME打印技術主要用于骨軟骨支架的CCZ和SB部分?？傮w而言，采用生物陶瓷打印的支架，可實現(xiàn)的孔隙率較低(20%～60%)，因而基于生物陶瓷材料制造高孔隙率支架十分困難。同時，其孔徑也很小(0.1～0.4 mm)，許多支架未能產(chǎn)生>0.3 mm的孔徑而難以促進SB部分的骨生長。雖然該技術被廣泛用于構建骨軟骨支架的CCZ和SB部分，但其低孔隙率和小孔徑，對組織生長并非有利。

3D打印水凝膠支架在關節(jié)骨軟骨復合組織工程中已有廣泛應用，特別是用于AC部分的打印，而其多相支架的連續(xù)打印目前應用較少。因此，用于具有完整連續(xù)性天然關節(jié)骨軟骨單元的仿生連續(xù)擠壓技術，可能是水凝膠3D打印的一個未來發(fā)展方向。KILIAN等以鏈式圖案水凝膠3D打印形成骨軟骨支架的AC部分，然后再以鑄造的方式獲得CCZ，從而獲得連續(xù)的含界層結構的骨軟骨支架。盡管水凝膠ME打印技術通常用于骨軟骨支架AC部分，但GAO等完全采用基于水凝膠ME的3D打印技術生產(chǎn)出雙相骨軟骨支架，并在SB部分的水凝膠中添加β-磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate, β-TCP)，增加了水凝膠的力學剛度和骨誘導性質，而在AC部分包含了轉化生長因子-β1(TGF-β1)以增強軟骨的形成與分化。

2.2 熔融電寫及靜電紡絲技術

熔融電寫(MEW)及靜電紡絲(ES)技術可使得長纖維絲通過噴嘴逐層沉積。其纖維直徑的尺寸范圍從微米到納米，實際上MEW通常會生產(chǎn)出微米纖維，而ES通常會生產(chǎn)出納米纖維。此外，ES是一種基于溶劑的打印技術，可將材料纖維隨機沉積在收集器床上；而MEW是一種無溶劑方法，可控制纖維的沉積位置和方式，從而控制最終的圖案。對于MEW和ES技術，其材料的選擇分別依據(jù)其電流體動力學原理的材料可加工性而確定。聚己內酯(polycaprolactone, PCL)是MEW使用最多的材料，還包括凝膠、殼聚糖、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)、透明質酸及膠原蛋白。盡管ES中使用的材料有所增加，但所使用的溶劑通常具有生物毒性，可能留有毒性殘留物，需要引起高度關注。

將MEW和ES應用于關節(jié)骨軟骨支架構建時，主要面臨的挑戰(zhàn)是在Z軸方向上打印出的結構總厚度有限。目前克服這種限制的方式是把材料打印至各種收集器和主體床上，以增加Z軸方向的結構高度。另一方面，鑒于生產(chǎn)的高度及微/納米纖維強度有限，MEW和ES通常會產(chǎn)生較軟的支架，很適合用于制造關節(jié)骨軟骨支架的AC部分。

CUI等應用ES創(chuàng)建了一個構造完整、厚度2～3 mm的單相骨軟骨支架，雖然這一厚度足以填補大鼠模型中的關節(jié)骨軟骨缺損，但難以用于人關節(jié)骨軟骨缺損。將該技術與其他制造方法(多層堆積)結合使用，打印到非扁平收集器床或堆疊支架上，可將高度增加至6～15 mm，以適用人體骨軟骨缺損修復。

2.3 光固化和數(shù)字光處理技術

光固化(SLA)和數(shù)字光處理(DLP)技術是通過材料逐層沉積以實現(xiàn)3D打印成型。然而，這些技術均非基于噴嘴方式，而是液體材料位于樹脂浴中，其中構建板降低并且光源跟蹤編程圖案，僅交聯(lián)設計的部分，該過程可逐層讓材料沉積，直到物體成型完成。

SLA和DLP技術之間的區(qū)別是使用的光源不同。SLA使用激光，而DLP使用來自投影的光源。SLA/DLP常規(guī)打印的精度可達50 μm，其介于MEW/ES和ME之間。這些技術采用的基礎材料與前述的許多基礎材料相互兼容，但通常需要對材料進行廣泛的改性。目前用于關節(jié)骨軟骨支架的材料包括聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、明膠甲基丙烯酰氯(gelatin methacryloyl，GelMA)及磷酸三鈣(tricalcium phosphate，TCP)，可與光引發(fā)劑、光吸收劑、溶劑和/或分散劑的任何組分混合。在支架制備中，SLA和DLP打印技術不如ME那樣使用廣泛，可能是由于這些系統(tǒng)高昂的前期投入和維護成本所致。

截至目前，與其他技術相比，SLA和DLP打印的支架尚無孔隙率方面的優(yōu)勢(50%～65%)。該類技術可用于構建多層關節(jié)骨軟骨支架，如ZHU等使用DLP技術創(chuàng)建了基于PEG材料結合天然牛軟骨細胞外基質的多層骨軟骨支架。

3 多層骨軟骨支架構建

關節(jié)骨軟骨復合組織工程支架的設計可分為單相、雙相、三相或多相。理論上，單相或雙層支架均難以復刻每種組織的特定性質，而多相支架通過協(xié)同每種材料、生物與機械元件的不同組合，可以重現(xiàn)其3種組織中至少兩種組織的性質。構建含CCZ的關節(jié)骨軟骨仿生支架需要增加相的數(shù)量，從而增加了制造的難度，同時如何在體內保持其各層之間連接的穩(wěn)定性也具有很大的挑戰(zhàn)。

3.1 單層或者雙層骨軟骨支架

單相支架設計并采用均勻的材料或復合材料修復整個關節(jié)骨軟骨缺損。這就需要支架以單一孔隙率和機械性能滿足其中每一組織區(qū)域的結構與功能要求。然而，使用單相支架修復關節(jié)骨軟骨缺損中的不同組織結構與功能具有相當?shù)奶魬?zhàn)性。目前已有使用系列材料和生物制造技術進行單相支架創(chuàng)建的研究報道，包括基于氧化鋅-PCL復合材料的ES及基于生物陶瓷的ME。其中，材料溶液濃度或其表面特征均進行了優(yōu)化與改性，以增強細胞成軟骨或成骨分化潛能，而單相支架要同時實現(xiàn)這兩種功能十分困難。

雙相支架通常具有軟骨相和骨相，而它們之間的CCZ均被忽略。相對于單層支架而言，雙層支架更接近天然骨軟骨組織。兩層支架分別構造，給予研究者更多的發(fā)揮空間，可以分別控制優(yōu)化其材料、設計、孔隙率、力學功能和/或單元類型等，為仿生構建關節(jié)骨軟骨的組織結構與功能，并促進其多種新組織的形成提供了更大的可能性。例如KILIAN等為解決CCZ材料問題，進行了無細胞陶瓷“水泥”和基于細胞藻酸鹽水凝膠的各種雙相組合試驗。

3.2 三層或多層骨軟骨支架

開發(fā)三層或多層結構關節(jié)骨軟骨支架過程中，CCZ是一個需要著重考慮的層次結構，包括其材料構建方式及使用何種類型的細胞等。目前一般采用兩種材料構建方式，一種是完全獨立于軟骨相的材料構建方式，如分別采用聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]、TCP、Alginate(藻酸鹽)及GelMA等的構建；另一種則是沿用軟骨相的材料或者在軟骨相材料基礎上加入另一些提高剛性、支撐性的材料，如采用甲基丙烯酸透明質酸或丙烯酸異辛烷乙酯改性β環(huán)糊精，或在海藻酸鈉中添加介孔生物活性玻璃。

多層結構關節(jié)骨軟骨支架的設計最為復雜，其支架中至少擁有4個不同的層次。雖然這種構建方法尚未被廣泛使用，但從三相增加到四相或更多相通常會將AC部分分解成不同的區(qū)域。如MANCINI等提出的一種由4層不同結構組成的骨軟骨支架，目的是更好地模仿AC不同區(qū)域的性質，即從上到下不同的(膠原)排列結構等；這種PCL支架以0°、90°交叉排列模式作為基礎，孔隙率逐漸減小直至質地致密，類似CCZ而充當其界面區(qū)；然后，PCL沿著含有間充質干細胞(mesenchymal stromal cells, MSCs)的水凝膠繼續(xù)保持70%的孔隙率延伸作為第3層，第4層除去PCL，僅留下水凝膠和MSCs，再次使用相同的水凝膠但使用關節(jié)軟骨祖細胞(articular cartilage progenitor cell, ACPC)代替MSCs。由此不難看出這種構造十分復雜，并需要更加精細的3D打印技術才能便捷地實現(xiàn)。

4 未來趨勢與展望

含界層結構的多相復層支架構建是關節(jié)骨軟骨復合組織工程未來發(fā)展的主流方向。近年來，隨著增材制造3D打印技術的不斷進步，含界層結構關節(jié)骨軟骨支架構建變得更加便捷與可行。展望未來，基于3D打印技術的關節(jié)骨軟骨支架設計制造，還有以下幾方面的機遇和挑戰(zhàn)。

4.1 界層結構的深入研究

骨軟骨復合組織工程技術策略治療關節(jié)骨軟骨缺損的研究已有了十多年的歷程，其支架構建制造從簡單的單層支架到多層支架，以更好地模擬天然關節(jié)骨軟骨單元的組織結構。然而，其三層支架的結構復雜，將3種不同結構鑄造成一個整體結構具有相當?shù)睦щy。在增材制造技術出現(xiàn)之前，已有多種不同方案構建含界層結構關節(jié)骨軟骨支架研究報道，如分層構建再進行層間交聯(lián)；或通過無縫過渡技術模仿天然CCZ界面，以創(chuàng)建結構連續(xù)的關節(jié)骨軟骨支架；如HARLEY等通過凍干礦化和非礦化的Ⅰ型膠原糖胺聚糖懸浮液，設計制備了含有CCZ界面的關節(jié)骨軟骨支架；ZHAI等用“兩次冷凍干燥”技術構建了高濃度殼聚糖/明膠溶液的致密隔離層。然而，研究者們均面臨著一個問題——天然關節(jié)骨軟骨組織單元的最佳仿生構建！

CCZ作為關節(jié)軟骨與軟骨下骨之間的界層結構，與毗鄰之間的連接精密復雜，成分過渡自然，發(fā)揮著力學傳遞、應力吸收與轉換及生理屏障等功能與作用。由于其組分構成、形態(tài)學特征及其生理學功能等最基本的科學問題目前尚未完全闡釋清楚，所以出現(xiàn)了采用各種不同材料進行“直接過渡”“間接連接”等骨軟骨支架構建方案，而無統(tǒng)一的支架構建金標準。因此，通過對關節(jié)骨軟骨組織單元及其界層結構的基本科學問題的深入解析，才能為含界層結構關節(jié)骨軟骨復合組織支架的3D打印制造指明道路和方向。

4.2 生物3D打印技術的提升

現(xiàn)有的諸多3D打印技術均可以用于關節(jié)骨軟骨支架的制備，然而每種技術均有其各自的優(yōu)勢和局限性，以及適配的打印材料。在材料選擇上，截至目前尚無證據(jù)表明某種材料一定比另一種材料要好。一般來說，水凝膠多被用于打印AC；生物陶瓷、透明質酸、TCP、金屬材料更適合打印SB；而生物相容性、可塑性、可修飾性更好的新材料研發(fā)，也是未來亟待解決的問題之一。

在多種3D打印技術方案中，ME具有廣泛可用性、材料多功能性及低成本的優(yōu)勢特點，因而最為常用。MEW和ES也被經(jīng)常選用，但主要用于軟骨相，且可實現(xiàn)的支架厚度有限，而這種所謂的“缺陷”，使其適用于制造薄而致密的界層結構，但其技術潛能尚需進一步開發(fā)。由于CCZ與毗鄰結構精細的連接方式賦予了整個關節(jié)骨軟骨單元良好的力學性能，為實現(xiàn)其最大限度的仿生，這種連接方式的仿制也應作為一個重點考慮的方向。所以，更高精度生物3D打印技術應是未來需要重點攻克的難題。

4.3 利于組織生長的支架構建

3D打印技術可構建出關節(jié)骨軟骨細胞外基質仿生支架，為種子細胞黏附增殖分化提供必要的場所空間，最終在體內持續(xù)發(fā)揮生物學功能。要使支架內的細胞能夠良好生長，首要的是控制支架的設計參數(shù)，例如孔徑、孔隙率、表面拓撲結構等。支架植入細胞的時機主要有兩種方案，一種是將細胞直接添加到打印原料中，另一種則是只打印支架，而不添加細胞，目前尚未對這兩種方案的優(yōu)劣做出定論，而且不同研究中添加的細胞數(shù)量和種類不盡相同，甚至同一個研究不同支架層添加的細胞也不一定相同。

作為組織工程的種子細胞，需要適宜的生長環(huán)境和土壤肥料(生長因子)。生長環(huán)境方面，包括如何控制氧含量，選擇培養(yǎng)基類型，需要進行怎樣的物理刺激，如力學刺激、磁場等，尚無統(tǒng)一的金標準；生長因子方面，促進軟骨形成與骨形成的生長因子種類繁多，如何調節(jié)支架各層之間生長因子的添加時機、種類與比例，使得種子細胞向著各自所需的方向分化，目前同樣面臨著巨大挑戰(zhàn)。

4.4 走向臨床轉化應用

實現(xiàn)最新研發(fā)技術的臨床轉化應用，安全有效地解決患者的傷病痛苦，是一項技術和一項基礎研究的最終目標。然而，每一項研發(fā)技術從實驗室走向臨床的道路十分漫長，制度規(guī)范要求嚴格，經(jīng)費與人力成本高昂。令人遺憾的是，目前尚無采用3D打印技術的骨軟骨支架修復關節(jié)骨軟骨缺損的臨床試驗應用，少數(shù)組織工程骨軟骨支架的臨床試驗應用則是通過非3D打印技術制造的。與其他組織工程方案相比，3D打印技術的個性化定制能力最為吸引人。通常關節(jié)骨軟骨缺損均為不規(guī)則形狀，其他支架制造技術構建圓柱形、長方體形支架相對容易，而很難構建不規(guī)則形狀的支架。這種“千篇一律”的支架很難與患者缺損部位相匹配，無論臨時修繕支架以適配缺損，還是擴大患者病損范圍以適配支架，均非最優(yōu)選擇。而3D打印技術則能夠在患者病損MRI、CT掃描數(shù)據(jù)基礎上，預先構建與缺損部位幾何形貌相匹配的支架，甚至為一個患者不同缺損部位定制不同的個性化支架。此外，基于這些數(shù)據(jù)，還能應用3D打印技術制作出虛擬模型，在體外行模擬手術，從而提高手術治療效果，減少患者的痛苦。

總之，隨著3D打印技術的發(fā)展進步，關節(jié)骨軟骨界層結構研究的深入進行，以及廣大研究人員與醫(yī)務人員的通力合作，一定能夠克服前述各種困難與問題。通過3D打印技術構建含界層結構關節(jié)骨軟骨仿生支架的不斷拓展應用，必將提升各類傷病所致關節(jié)骨軟骨缺損的再生治療水平，并最終造福廣大骨關節(jié)傷病患者。