生物鐘基因PER1調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞中BAX、BCL2和PCNA表達(dá)的晝夜節(jié)律

尹仕琳，張志偉，唐 洪，楊 凱 400016 重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科

口腔癌為常見的頭頸部惡性腫瘤，約90%為鱗狀細(xì)胞癌。雖然目前包括手術(shù)、放療和化療等各種治療手段取得了很大進步，但由于口腔鱗癌發(fā)病機制不清，近30年來患者的5年生存率仍未得到明顯提高。研究證明，人體生理活動表現(xiàn)出約以24 h為周期的節(jié)律性振蕩，稱為晝夜節(jié)律。晝夜節(jié)律是由細(xì)胞內(nèi)一系列生物鐘基因在轉(zhuǎn)錄-翻譯水平上構(gòu)成復(fù)雜的正負(fù)反饋環(huán)路而形成，揭示生物體內(nèi)細(xì)胞的生理活動和相關(guān)基因表達(dá)是呈24 h為周期的節(jié)律性振蕩，而不是每天保持在一個固定的水平。中值、振幅和峰值相位是反映24 h晝夜節(jié)律振蕩特征的3個維度。晝夜節(jié)律通過以上3個維度協(xié)調(diào)細(xì)胞內(nèi)眾多復(fù)雜的生理過程和基因表達(dá)在時間和空間上保持協(xié)同有序，對于維持細(xì)胞生理穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。晝夜節(jié)律異常改變或紊亂與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，深入研究晝夜節(jié)律可能為治療癌癥提供新的思路和方法。

細(xì)胞增殖和凋亡平衡的失調(diào)是癌癥發(fā)生的根本原因。PCNA是促細(xì)胞增殖基因，BAX和BCL2分別為促凋亡基因和抑凋亡基因，其異常改變導(dǎo)致細(xì)胞增殖和凋亡平衡失調(diào)，與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)在多種細(xì)胞中PCNA、BAX和BCL2的表達(dá)具有晝夜節(jié)律，但其調(diào)控機制不清楚。PER1是重要的核心生物鐘基因，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，PER1在口腔鱗癌中表達(dá)降低，與患者臨床分期和生存時間顯著相關(guān)，具有重要的抑癌作用，并且其表達(dá)具有晝夜節(jié)律性。在此基礎(chǔ)上，本研究通過建立沉默或過表達(dá)PER1的口腔鱗癌細(xì)胞，探索口腔鱗癌細(xì)胞內(nèi)PER1表達(dá)改變后其自身晝夜節(jié)律表達(dá)特征改變情況，以及對口腔鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞中PCNA、BAX和BCL2表達(dá)的晝夜節(jié)律的調(diào)控作用，希望為基于晝夜節(jié)律發(fā)展治療口腔鱗癌的新策略提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人口腔鱗癌細(xì)胞系TSCCA和SCC15購自上海中橋新舟生物科技有限公司，PER1過表達(dá)慢病毒和PER1-shRNA干擾慢病毒購自上海吉凱基因化學(xué)公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；RIPA裂解液購自中國碧云天公司，PER1抗體購自美國GeneTex公司，BAX和BCL2抗體購自美國Proteintech公司，PCNA和β-actin抗體購自美國CST公司；梯度PCR儀購自美國Bio-Rad公司，ECL-Advance蛋白質(zhì)印跡檢測系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，流式細(xì)胞儀購自美國FACSVantage公司。

1.2 PER1過表達(dá)和沉默載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

用過表達(dá)PER1的慢病毒感染SCC15細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)過表達(dá)PER1的SCC15細(xì)胞(OE-PER1-SCC15細(xì)胞)，用不含PER1基因序列的慢病毒感染SCC15細(xì)胞作為陰性對照(NC-SCC15細(xì)胞)。用PER1-shRNA慢病毒感染TSCCA細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)沉默PER1的TSCCA細(xì)胞(RNAi-PER1-TSCCA細(xì)胞)，以不含PER1片段的scramble質(zhì)粒慢病毒感染TSCCA細(xì)胞作為陰性對照(scramble-TSCCA細(xì)胞)。詳細(xì)方法見我們前期報道。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞晝夜節(jié)律同步化

實驗前先行細(xì)胞晝夜節(jié)律同步化處理。將生長狀態(tài)良好的各組細(xì)胞(OE-PER1-SCC15、NC-SCC15、RNAi-PER1-TSCCA和Scramble-TSCCA)接種于含完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)60%左右時，將完全培養(yǎng)液替換成不含血清含有終濃度為1 μmol/L地塞米松培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2 h后替換為完全培養(yǎng)基，把這一時間點設(shè)置為授時時間0點(zeitgeber time 0，ZT 0)，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔4 h設(shè)置ZT 4、ZT 8、ZT 12、ZT 16、ZT 20、ZT 24這6個不同時間點，收集細(xì)胞，提取RNA和蛋白質(zhì)。其中ZT 0～ZT 12代表主觀白天，ZT 12～ZT 24代表主觀夜晚。

1.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

① RNA提?。焊鶕?jù)TaKaRa RNAiso Plus試劑盒的說明書提取總RNA。用顯微分光光度法測定總RNA的純度和濃度。② cDNA合成：用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 恒溫。③ RT-qPCR反應(yīng)：目的基因PER1、BAX、BCL2、PCNA和β-actin的引物用Oligo 7.0軟件設(shè)計，引物序列見表1。根據(jù)TB Green? Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)說明書進行RT-qPCR。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性1.5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，擴增40個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。以β-actin為參照，按2計算目的基因的mRNA相對表達(dá)量。

表1 RT-qPCR 引物序列

基因序列(5'→3')PER1正義鏈:GACACCACTGCCGATCC反義鏈:TTCAGCCCGAGGGTTCTBAX正義鏈:TGCGTCCACCAAGAAGC反義鏈: TCCAGTTCGTCCCCGATBCL2正義鏈:TTTGTGGAACTGTACGGCCC反義鏈:TCACTTGTGGCCCAGATAGGPCNA正義鏈:AAGCACCAAACCAGGAGA反義鏈:GCAAATTCACCAGAAGGCβ-actin正義鏈:CTTCTACAATGAGCTGCGT-GTG反義鏈:AGAGGCGTACAGGGATAG-CACAG

1.5 蛋白免疫印跡實驗(Western blot)

用裂解液裂解細(xì)胞，冰上裂解30 min，離心15 min (4 ℃,12 000 r/min) 后收集上清液，用BCA法測定蛋白濃度。蛋白(20～30 μg)經(jīng)8%～12%的SDS-PAGE凝膠電泳分離后，通過濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到0.45 μm PVDF膜上。PVDF膜在含有5%脫脂奶粉的封閉液中室溫封閉1.5 h。并與PER1、BAX、BCL2、PCNA和β-actin的一抗接觸，在4 ℃孵育過夜。然后將PVDF膜浸泡在HRP標(biāo)記的二抗稀釋液中，室溫孵育1 h。加入超敏化學(xué)發(fā)光液后曝光，采集圖像。以β-actin作為對照。使用Image 5.0軟件對蛋白質(zhì)條帶進行灰度分析。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)

細(xì)胞增殖檢測：細(xì)胞經(jīng)同步化處理后時間設(shè)置為ZT 0，分別在ZT 4、ZT 8、ZT 12、ZT 16、ZT 20和ZT 24時間點用0.25%胰酶消化，PBS洗滌2次，并重懸于100 μL PBS和900 μL預(yù)冷的75%乙醇中固定，4 ℃過夜。然后，PBS洗滌2次，并加入400 μL碘化丙啶染色液和100 μL RNase (100 μg/mL),于4 ℃避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布，并通過細(xì)胞周期擬合軟件ModFit分析。

細(xì)胞增殖指數(shù) =(S+G/M)/(G/G+S+G/M)× 100%

細(xì)胞凋亡檢測：細(xì)胞經(jīng)同步化處理后時間設(shè)置為ZT 0，分別在ZT 4、ZT 8、ZT 12、ZT 16、ZT 20和ZT 24時間點用0.25%胰酶消化，PBS洗滌2次，用PBS將細(xì)胞數(shù)調(diào)節(jié)至1×10/mL。將200 μL的Annexin V-APC染色液加入1 mL細(xì)胞懸液中，室溫避光孵育15 min。然后加入200 μL碘化丙啶染色液混合。采用流式細(xì)胞儀進行細(xì)胞計數(shù)。

細(xì)胞凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/被檢測細(xì)胞總數(shù)×100%

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行方差分析，檢驗晝夜6個時間點各基因的差異性表達(dá)。用Matlab 8.6(美國，MathWorks)軟件中的Cosinor程序包對數(shù)據(jù)進行余弦擬合分析，擬合方程為Y = M+Acos [w(t-Φ)]，其中M表示中值，A表示振幅、w表示角頻率、Φ表示峰值相位，t代表時間點。同時滿足單因素方差分析(

P

<0.05)和余弦分析(

P

<0.05)表明該基因的表達(dá)具有晝夜節(jié)律。用CircaCompare程序包比較不同余弦曲線間中值和振幅的差異，

P

<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)PER1對細(xì)胞增殖和凋亡及細(xì)胞內(nèi)BAX、BCL2和PCNA晝夜節(jié)律表達(dá)的調(diào)控

為探索PER1表達(dá)改變對細(xì)胞增殖和凋亡晝夜節(jié)律的調(diào)控作用，在過表達(dá)PER1的口腔鱗癌SCC15細(xì)胞(OE-PER1-SCC15)中檢測細(xì)胞增殖、凋亡及生物鐘基因PER1、促凋亡基因BAX、抑凋亡基因BCL2和增殖基因PCNA表達(dá)的晝夜節(jié)律情況。流式細(xì)胞、RT-qPCR和Western blot檢測結(jié)果表明，在OE-PER1-SCC15細(xì)胞和NC-SCC15細(xì)胞中細(xì)胞增殖指數(shù)和凋亡指數(shù)及PER1、BAX、BCL2和PCNA mRNA和蛋白表達(dá)均具有晝夜節(jié)律(單因素方差分析：

P

<0.05；余弦分析：

P

<0.05)，見圖1、2和表2、3。

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測NC-SCC15和OE-PER1-SCC15細(xì)胞在24 h內(nèi)不同時間點的增殖指數(shù)；B：NC-SCC15和OE-PER1-SCC15細(xì)胞增殖指數(shù)在24 h內(nèi)不同時間點實際檢測均值和晝夜節(jié)律的余弦擬合曲線；C：流式細(xì)胞術(shù)檢測NC-SCC15和OE-PER1-SCC15細(xì)胞在24 h內(nèi)不同時間點的凋亡指數(shù)；D: NC-SCC15和OE-PER1-SCC15細(xì)胞凋亡指數(shù)在24 h內(nèi)不同時間點實際檢測均值和晝夜節(jié)律變化的余弦擬合曲線 實線：余弦擬合曲線；虛線：晝夜不同時間點的實際均值連線；a: P<0.05， b: P<0.01，與ZT 4比較圖1 NC-SCC15和OE-PER1-SCC15細(xì)胞增殖指數(shù)和凋亡指數(shù)的晝夜節(jié)律變化和余弦擬合曲線

A: RT-qPCR檢測NC-SCC15和OE-PER1-SCC15細(xì)胞中PER1、BAX、BCL2和PCNA mRNA表達(dá)及其余弦擬合曲線； B、C：Western blot檢測NC-SCC15和OE-PER1-SCC15細(xì)胞中PER1、BAX、BCL2和PCNA蛋白表達(dá)及其余弦擬合曲線 實線：余弦擬合曲線；虛線：晝夜不同時間點的實際均值連線；a: P<0.05， b: P<0.01，與ZT 4比較圖2 PER1、BAX、BCL2和PCNA mRNA和蛋白在NC-SCC15和OE-PER1-SCC15細(xì)胞中表達(dá)的晝夜節(jié)律變化和余弦擬合曲線

表2 NC-SCC15和OE-PER1-SCC15細(xì)胞增殖和凋亡的晝夜節(jié)律特征

檢測項目細(xì)胞中值振幅峰值相位 (ZT)峰值谷值P值增殖指數(shù)NC-SCC1530.984.0614.5435.0426.920.016OE-PER1-SCC1528.593.2417.0131.8325.350.026凋亡指數(shù)NC-SCC156.351.7711.218.124.580.004OE-PER1-SCC157.012.428.479.434.590.003

與對照組相比，OE-PER1-SCC15細(xì)胞中PER1 mRNA表達(dá)的中值顯著升高(

P

<0.05)，而振幅無顯著改變(

P

>0.05)，峰值相位前移3.96 h，由主觀夜晚的晚期(ZT 22.27)提前到主觀夜晚的中期(ZT 18.31)。BAX mRNA表達(dá)的中值和振幅顯著升高(

P

<0.05)，峰值相位雖然提前3.24 h(從ZT 23.89前移到ZT 20.65)，但仍位于主觀夜晚的晚期。BCL2 mRNA表達(dá)的中值和振幅顯著降低(

P

<0.05)，峰值相位滯后1.38 h，由主觀夜晚中期(ZT 19.63)延后到主觀夜晚晚期(ZT 21.01)。PCNA mRNA表達(dá)的中值和振幅顯著降低(

P

<0.05)，峰值相位滯后2.61 h，由主觀夜晚中期(ZT 18.74)后移到主觀夜晚晚期(ZT 21.35)，見圖2A和表3。從蛋白表達(dá)比較，PER1蛋白表達(dá)的中值顯著升高(

P

<0.05)，而振幅無顯著差異(

P

>0.05)，峰值相位前移3.13 h，由主觀白天的中期(ZT 4.39)提前到主觀白天的早期(ZT 1.26)。BAX蛋白表達(dá)的中值顯著升高(

P

<0.05)，而振幅無顯著改變(

P

>0.05)，峰值相位前移9.50 h，由主觀夜晚的中期(ZT 19.19)提前到主觀白天的晚期(ZT 9.69)。BCL2蛋白表達(dá)的中值顯著降低(

P

<0.05)，而振幅無顯著差異(

P

>0.05)，峰值相位滯后10.20 h，由主觀白天的中期(ZT 7.75)后移到主觀夜晚的中期(ZT 17.95)。PCNA蛋白表達(dá)的中值顯著降低(

P

<0.05)，而振幅無顯著改變(

P

>0.05)，峰值相位滯后3.51 h，由主觀白天的晚期(ZT 9.74)后移到主觀夜晚的早期(ZT 13.25)，見圖2B、C和表3。

表3 NC-SCC15和OE-PER1-SCC15細(xì)胞中各基因mRNA和蛋白表達(dá)的晝夜節(jié)律特征

檢測項目基因名稱細(xì)胞中值振幅峰值相位 (ZT)峰值谷值P值mRNAPER1NC-SCC152.271.6422.273.910.630.032OE-PER1-SCC153.442.8218.316.260.620.019BAXNC-SCC150.690.4723.891.160.220.029OE-PER1-SCC152.862.0120.654.870.850.041BCL2NC-SCC153.002.2919.635.290.710.015OE-PER1-SCC152.071.2421.013.310.830.036PCNANC-SCC152.351.2318.743.581.120.027OE-PER1-SCC151.970.5821.352.551.390.022蛋白PER1NC-SCC150.740.144.390.880.600.032OE-PER1-SCC150.950.271.261.220.680.025BAXNC-SCC150.950.2119.191.160.740.044OE-PER1-SCC151.200.389.691.580.820.035BCL2NC-SCC150.910.477.751.380.440.019OE-PER1-SCC150.740.2917.951.030.450.025PCNANC-SCC150.980.209.741.180.780.017OE-PER1-SCC150.850.1913.251.040.660.022

與NC-SCC15細(xì)胞組相比，OE-PER1-SCC15細(xì)胞增殖指數(shù)的中值顯著降低(

P

<0.01)，而振幅無顯著改變(

P

>0.05)，峰值相位延后2.47 h，由主觀夜晚的早期(ZT 14.54)后移到主觀夜晚的中期(ZT 17.01)，見圖1A、B和表2；細(xì)胞凋亡指數(shù)的中值和振幅顯著升高(

P

<0.05)，峰值相位雖然提前2.74 h(從ZT 11.21前移到ZT 8.47)，但仍位于主觀白天的晚期(圖1C、D和表2)。

上述結(jié)果表明：PER1過表達(dá)后其自身晝夜節(jié)律表達(dá)特征發(fā)生改變，同時調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞的增殖和凋亡及細(xì)胞內(nèi)BAX、BCL2、PCNA mRNA和蛋白晝夜節(jié)律表達(dá)特征改變。

2.2 敲減PER1對細(xì)胞增殖和凋亡及細(xì)胞內(nèi)BAX、BCL2和PCNA晝夜節(jié)律表達(dá)的調(diào)控作用

在敲減PER1的口腔鱗癌TSCCA細(xì)胞(RNAi-PER1-TSCCA)中檢測細(xì)胞增殖和凋亡及PER1、BAX、BCL2和PCNA表達(dá)的晝夜節(jié)律情況。流式細(xì)胞檢測結(jié)果表明，在RNAi-PER1-TSCCA細(xì)胞和對照組Scramble-TSCCA細(xì)胞中細(xì)胞增殖指數(shù)和凋亡指數(shù)均具有晝夜節(jié)律(單因素方差分析：

P

<0.05；余弦分析：

P

<0.05)，見圖3、表4。RT-qPCR檢測結(jié)果表明，PER1、BAX、BCL2和PCNA mRNA表達(dá)均具有晝夜節(jié)律(單因素方差分析:

P

<0.05; 余弦分析:

P

<0.05)，見圖4A、表5。Western blot檢測結(jié)果表明，PER1、BCL2和PCNA 蛋白表達(dá)均具有晝夜節(jié)律, BAX蛋白在Scramble-TSCCA細(xì)胞具有晝夜節(jié)律(單因素方差分析：

P

<0.05； 余弦分析：

P

<0.05)，但在RNAi-PER1-TSCCA細(xì)胞中發(fā)生晝夜節(jié)律紊亂(

P

>0.05，圖4B、C 和表5)。

A: 流式細(xì)胞術(shù)檢測Scramble-TSCCA和RNAi-PER1-TSCCA細(xì)胞在24 h內(nèi)不同時間點的增殖指數(shù)；B：Scramble-TSCCA和RNAi-PER1-TSCCA細(xì)胞增殖指數(shù)在24 h內(nèi)不同時間點實際檢測均值和晝夜節(jié)律的余弦擬合曲線；C：流式細(xì)胞術(shù)檢測Scramble-TSCCA和RNAi-PER1-TSCCA細(xì)胞在24 h內(nèi)不同時間點的凋亡指數(shù)；D: Scramble-TSCCA和RNAi-PER1-TSCCA細(xì)胞凋亡指數(shù)在24 h內(nèi)不同時間點實際檢測均值和晝夜節(jié)律的余弦擬合曲線 實線：余弦擬合曲線；虛線：晝夜不同時間點的實際均值連線；a: P<0.05，b: P<0.01，與ZT 4比較圖3 Scramble-TSCCA和RNAi-PER1-TSCCA細(xì)胞增殖指數(shù)和凋亡指數(shù)的晝夜節(jié)律變化和余弦擬合曲線

表4 Scramble-TSCCA和RNAi-PER1-TSCCA細(xì)胞增殖和凋亡的晝夜節(jié)律特征

檢測項目細(xì)胞中值振幅峰值相位 (ZT)峰值谷值P值增殖指數(shù)Scramble-TSCCA31.624.5913.1036.2127.030.014RNAi-PER1-TSC-CA34.386.867.9641.2427.520.005凋亡指數(shù)Scramble-TSCCA5.791.6016.417.394.190.004RNAi-PER1-TSC-CA5.031.5620.146.593.470.012

A: RT-qPCR檢測Scramble-TSCCA和RNAi-PER1-TSCCA細(xì)胞中PER1、BAX、BCL2和PCNA mRNA表達(dá)及其余弦擬合曲線；B, C：Western blot檢測Scramble-TSCCA和RNAi-PER1-TSCCA細(xì)胞中PER1、BAX、BCL2和PCNA蛋白表達(dá)及其余弦擬合曲線 實線：余弦擬合曲線；虛線：晝夜不同時間點的實際均值的連線；a: P<0.05, b: P<0.01，與ZT 4比較圖4 PER1、BAX、BCL2和PCNA在Scramble-TSCCA和RNAi-PER1-TSCCA細(xì)胞中表達(dá)的晝夜節(jié)律變化和余弦擬合曲線

表5 Scramble-TSCCA和RNAi-PER1-TSCCA細(xì)胞中各基因mRNA和蛋白表達(dá)的晝夜節(jié)律特征

檢測項目基因名稱細(xì)胞中值振幅峰值相位 (ZT)峰值谷值P值mRNAPER1Scramble-TSCCA1.250.2915.951.540.960.047RNAi-PER1-TSCCA0.660.2118.360.870.450.008BAXScramble-TSCCA2.051.1617.833.210.890.016RNAi-PER1-TSCCA1.310.4919.781.800.820.000BCL2Scramble-TSCCA1.070.2019.391.270.870.034RNAi-PER1-TSCCA1.900.6215.242.521.280.042PCNAScramble-TSCCA2.211.1320.373.341.080.030RNAi-PER1-TSCCA3.692.0813.335.771.610.017蛋白PER1Scramble-TSCCA1.060.1818.921.240.880.037RNAi-PER1-TSCCA0.880.2120.171.090.670.024BAXScramble-TSCCA1.070.239.461.300.840.024RNAi-PER1-TSCCA-----0.330BCL2Scramble-TSCCA0.950.2020.271.150.750.034RNAi-PER1-TSCCA1.100.3419.321.440.760.009PCNAScramble-TSCCA0.730.1821.180.910.550.006RNAi-PER1-TSCCA1.020.418.151.430.610.016

-：無晝夜節(jié)律

與對照組相比，RNAi-PER1-TSCCA細(xì)胞增殖指數(shù)的中值和振幅顯著升高(

P

<0.05)，峰值相位前移5.14 h，由主觀夜晚的早期(ZT 13.10)提前到主觀白天的中期(ZT 7.96)，見圖3A、B和表4；細(xì)胞凋亡指數(shù)的中值顯著降低(

P

<0.01)，而振幅無顯著差異(

P

>0.05)，峰值相位滯后3.73 h，由主觀夜晚的中期(ZT 16.41)后移到主觀夜晚的晚期(ZT 20.14)，見圖3C、D和表4。與對照組相比，RNAi-PER1-TSCCA細(xì)胞PER1 mRNA表達(dá)的中值顯著降低(

P

<0.001)，而振幅無顯著差異(

P

>0.05)，峰值相位滯后2.41 h，由主觀夜晚的早期(ZT 15.95)后移到主觀夜晚的中期(ZT 18.36)。BAX mRNA表達(dá)的中值和振幅顯著降低(

P

<0.01)，峰值相位雖然滯后1.95 h(從ZT 17.83后移到ZT 19.78)，但仍位于主觀夜晚的中期。BCL2 mRNA表達(dá)的中值和振幅顯著升高(

P

<0.05)，峰值相位前移4.15 h，由主觀夜晚的中期(ZT 19.39)提前到主觀夜晚的早期(ZT 15.24)。PCNA mRNA表達(dá)的中值和振幅顯著升高(

P

<0.05)，峰值相位前移7.04 h，由主觀夜晚的晚期(ZT 20.37)提前到主觀夜晚的早期(ZT 13.33)，見圖4A、表5。從蛋白水平比較，PER1蛋白表達(dá)的中值顯著降低(

P

<0.01)，而振幅無顯著改變(

P

>0.05)，峰值相位滯后1.25 h，由主觀夜晚的中期(ZT 18.92)后移到主觀夜晚的晚期(ZT 20.17)。BAX蛋白在RNAi-PER1-TSCCA細(xì)胞中發(fā)生節(jié)律紊亂。BCL2蛋白表達(dá)的中值顯著升高(

P

<0.05)，而振幅無顯著差異(

P

>0.05)，峰值相位前移0.95 h，由主觀夜晚的晚期(ZT 20.27)提前到主觀夜晚的中期(ZT 19.32)。PCNA蛋白表達(dá)的中值和振幅顯著升高(

P

<0.05)，峰值相位前移13.03 h，由主觀夜晚的晚期(ZT 21.18)提前到主觀白天的晚期(ZT 8.15)，見圖4B、C和表5。

上述結(jié)果表明：PER1敲減后其自身晝夜節(jié)律表達(dá)特征發(fā)生改變，同時調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞增殖和凋亡及細(xì)胞內(nèi)BAX、BCL2和PCNA mRNA和蛋白晝夜節(jié)律表達(dá)特征改變。

3 討論

人體細(xì)胞中幾乎都存在生物鐘基因，這些生物鐘基因通過形成正負(fù)反饋環(huán)路而產(chǎn)生晝夜節(jié)律振蕩。機體正常生理穩(wěn)態(tài)的維持依靠各種細(xì)胞生理活動或基因表達(dá)在時間和空間上保持動態(tài)平衡。晝夜節(jié)律是調(diào)控體內(nèi)眾多復(fù)雜的生理過程或基因表達(dá)能在時間和空間上保持協(xié)同有序的重要管理方式，晝夜節(jié)律異常改變與腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PER1是核心生物鐘基因之一，本研究結(jié)果顯示，口腔鱗癌細(xì)胞中PER1表達(dá)改變能導(dǎo)致其自身的晝夜節(jié)律改變，并對細(xì)胞增殖和凋亡以及細(xì)胞內(nèi)BAX、BCL2、PCNA mRNA和蛋白表達(dá)的晝夜節(jié)律具有重要的調(diào)控作用。中值、振幅和峰值相位是反映24 h晝夜節(jié)律振蕩特征的3個維度。中值代表24 h節(jié)律性振蕩的平均值；振幅代表節(jié)律振蕩高于或低于中值的程度，是反映基因的穩(wěn)健性和同步化能力的重要指標(biāo)；峰值相位代表節(jié)律振蕩達(dá)到頂峰的時間點，反映該基因呈節(jié)律性的最大“開啟”時間。因此，對晝夜節(jié)律的研究不僅會補充對癌癥發(fā)生機制的深入理解，也可能為基于晝夜節(jié)律發(fā)展治療癌癥的新策略提供依據(jù)。

無限增殖和抵抗凋亡是惡性腫瘤兩大基本特征。PCNA是一種增殖細(xì)胞核抗原。WEIGL等發(fā)現(xiàn)，雄性BALB/c小鼠肝臟和食管中PCNA mRNA表達(dá)存在晝夜節(jié)律。BCL2和BAX是凋亡的重要調(diào)控因子，BAX為促凋亡基因，BCL2為抑凋亡基因。GRANDA等研究表明，BCL2和BAX蛋白在骨髓組織中的表達(dá)具有晝夜節(jié)律，且其晝夜節(jié)律呈相反模式。我們前期研究證明，在3株人口腔鱗癌細(xì)胞系TSCCA、SCC15和CAL27中，PER1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著低于正?？谇簧掀ぜ?xì)胞。為了探索口腔鱗癌細(xì)胞中PER1對PCNA、BCL2和BAX表達(dá)晝夜節(jié)律的調(diào)控作用，本研究在這3株口腔鱗癌細(xì)胞系中選擇PER1表達(dá)最低的SCC15細(xì)胞建構(gòu)穩(wěn)定過表達(dá)PER1的SCC15細(xì)胞(OE-PER1-SCC15)，選擇PER1表達(dá)最高的TSCCA細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定沉默PER1的TSCCA細(xì)胞(RNAi-PER1-TSCCA)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在OE-PER1-SCC15中，PER1、BAX、BCL2和PCNA mRNA和蛋白的表達(dá)具有晝夜節(jié)律性；PER1和BAX mRNA和蛋白表達(dá)的中值顯著升高，BCL2和PCNA mRNA和蛋白表達(dá)的中值顯著降低；BAX mRNA表達(dá)的振幅顯著升高，BCL2和PCNA mRNA表達(dá)的振幅顯著降低；PER1和BAX mRNA和蛋白表達(dá)的峰值相位前移，BCL2和PCNA mRNA和蛋白表達(dá)的峰值相位后移。在RNAi-PER1-TSCCA中，BAX蛋白的表達(dá)發(fā)生晝夜節(jié)律紊亂，但PER1、BCL2和PCNA mRNA和蛋白以及BAX mRNA的表達(dá)具有晝夜節(jié)律,其晝夜節(jié)律特征與OE-PER1-SCC15中相反。表明口腔鱗癌細(xì)胞中BAX、BCL2和PCNA mRNA和蛋白的表達(dá)在中值、振幅和峰值相位3個維度上的平衡失調(diào)與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，PER1對BAX、BCL2和PCNA表達(dá)的晝夜節(jié)律具有重要調(diào)控作用。如果能進一步對SCC15和TSCCA兩種口腔鱗癌細(xì)胞分別既沉默又過表達(dá)，其結(jié)果會更加全面。

晝夜節(jié)律研究也為癌癥的時間精準(zhǔn)治療提供了依據(jù)。因為基因表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA和翻譯產(chǎn)生蛋白等不同層面的動態(tài)過程，晝夜節(jié)律的最大優(yōu)勢就是不僅能獲得基因表達(dá)在不同層面的中值和振幅水平，同時也能獲得基因表達(dá)在不同層面的最大高峰或低谷時間，即峰值相位。本研究從mRNA和蛋白兩個層面獲得PER1、PCNA、BAX和BCL2表達(dá)的晝夜節(jié)律改變規(guī)律，結(jié)果表明PER1、PCNA、BAX和BCL2 mRNA表達(dá)的峰值相位與各基因蛋白表達(dá)的峰值相位之間存在數(shù)小時的時間差。這一結(jié)果提示，針對PER1、PCNA、BAX和BCL2的mRNA靶向制劑或蛋白靶向制劑獲得最佳療效的給藥時間是不相同的。這種時間精準(zhǔn)治療在癌癥治療中具有很好的臨床應(yīng)用前景。

總之，本研究結(jié)果顯示，在口腔鱗癌細(xì)胞中，生物鐘基因PER1表達(dá)改變能導(dǎo)致其自身的晝夜節(jié)律改變，并從中值、振幅和峰值相位3個維度調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡及細(xì)胞內(nèi)BAX、BCL2和PCNA mRNA和蛋白表達(dá)的晝夜節(jié)律特征改變。本研究結(jié)果不僅加深對口腔鱗癌發(fā)生機制更全面和更精細(xì)的認(rèn)識，同時也提示基于晝夜節(jié)律的研究可能為治療口腔鱗癌提供新的策略。