ABTS強(qiáng)化HRP/H2O2體系降解吲哚的效能與機(jī)制

黃亦欣， 鄒景， 林金彬， 馬紅芳， 陳秀峰， 楊浩宇

(華僑大學(xué) 土木工程學(xué)院， 福建 廈門(mén) 361021)

吲哚是一種典型的氮雜環(huán)芳烴化合物，廣泛地存在于焦化、印染、醫(yī)藥、農(nóng)藥等工業(yè)廢水中[1-2].由于吲哚具有累積性及生物毒性，廢水中的吲哚一旦進(jìn)入環(huán)境中，就會(huì)在生物體內(nèi)積累，對(duì)生物體的細(xì)胞造成不可逆的損害，進(jìn)而產(chǎn)生致畸、致癌和致突變等不良作用[3-7].此外，由于吲哚的化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，很難被微生物高效降解去除.臭氧、高鐵酸鹽等化學(xué)氧化法和納米材料吸附法已被運(yùn)用于吲哚的去除中[4，7-9]，但存在藥劑材料投入成本高、操作復(fù)雜、易產(chǎn)生二次污染等問(wèn)題.

近年來(lái)，酶催化氧化法作為一種常見(jiàn)的高級(jí)氧化技術(shù)，已運(yùn)用于廢水中苯酚、雌激素等酚類(lèi)及苯胺類(lèi)有機(jī)污染物的降解，但對(duì)污染物降解的效率較低[10-19].由于能夠產(chǎn)生具有更高氧化活性的中間體來(lái)高效地降解污染物，加入有機(jī)小分子作為電子轉(zhuǎn)移體的酶介導(dǎo)體系逐漸成為研究熱點(diǎn).現(xiàn)有研究表明，1-羥基苯并三氮唑(HBT)、丁香醛(SA)等多種電子轉(zhuǎn)移體可有效地強(qiáng)化漆酶/O2體系降解污染物，并拓寬該體系可降解的污染物種類(lèi)[20-21].然而，漆酶價(jià)格昂貴，且漆酶/O2體系僅在pH值為酸性的條件下對(duì)污染物具有良好的去除效能.由于在pH值為中性的條件下對(duì)酚類(lèi)及苯胺類(lèi)有機(jī)污染物具有較高的降解效能，辣根過(guò)氧化物酶催化過(guò)氧化氫(HRP/H2O2)體系受到了水處理研究者的廣泛關(guān)注[1，10，15，17].據(jù)報(bào)道，氯丙嗪和HBT可作為電子轉(zhuǎn)移體強(qiáng)化HRP/H2O2體系降解污染物，但這些加入的電子轉(zhuǎn)移體會(huì)隨著污染物的降解而不斷分解[22-23].因此，有必要探尋其他高效、穩(wěn)定的電子轉(zhuǎn)移體來(lái)強(qiáng)化HRP/H2O2體系降解污染物.

作為一種常用的還原劑，2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)可通過(guò)單電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成具有較高氧化活性的ABTS自由基(ABTS·+).作為電子轉(zhuǎn)移體，ABTS已運(yùn)用于強(qiáng)化高鐵酸鹽[24]、高錳酸鹽[25-26]及漆酶/O2體系[16，27-28]的有機(jī)污染物降解中.同時(shí)，課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，HRP/H2O2體系可迅速氧化ABTS生成ABTS·+[29].因此，ABTS作為電子轉(zhuǎn)移體強(qiáng)化HRP/H2O2體系降解吲哚在理論上是可行的，但目前尚未有相關(guān)報(bào)道.基于此，本文以ABTS為電子轉(zhuǎn)移體，強(qiáng)化HRP/H2O2體系降解吲哚.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

辣根過(guò)氧化物酶(HRP，4 166.7 nkat·mg-1)、2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%)、吲哚(AR級(jí))及腐殖酸(上海市上海阿拉丁試劑有限公司)；過(guò)氧化氫(H2O2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30.0%)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4，AR級(jí))、磷酸二氫鈉(NaH2PO4，AR級(jí))、硼酸鈉(Na2B4O7，AR級(jí))、硼酸(H3BO3，AR級(jí))、氫氧化鈉(NaOH，AR級(jí))、高氯酸(HClO4，AR級(jí))、碳酸氫鈉(NaHCO3，AR級(jí))、氯化鈉(NaCl，AR級(jí))、硫酸鈉(Na2SO4，AR級(jí))、硝酸鈉(NaNO3，AR級(jí))及硫代硫酸鈉(Na2S2O3，AR級(jí))(上海市上海國(guó)藥集團(tuán))；色譜級(jí)乙腈和甲醇(液相色譜分析中使用，德國(guó)默克公司).

表1 實(shí)際水體的主要水質(zhì)指標(biāo)

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

吲哚降解實(shí)驗(yàn)在(25±2) ℃下恒溫水浴，并用磁力攪拌器攪拌.首先，將11 mL的超純水、5 mL的磷酸緩沖母液(50 mmol·L-1，pH值分別為5.0，7.0)或硼酸緩沖母液(50 mmol·L-1，pH值分別為9.0，11.0)、1.5 mL的ABTS母液(0.5 mmol·L-1)、0.5 mL的吲哚母液(0.3 mmol·L-1)及5 mL的H2O2母液(2.5 mmol·L-1)依次加入25 mL的玻璃錐形瓶中.然后，再加入2 mL的HRP母液(1 667 nkat·L-1)，啟動(dòng)反應(yīng).模擬廢水中的吲哚濃度為6 μmol·L-1.間隔一定的時(shí)間，從錐形瓶中取出500 μL反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至含有過(guò)量Na2S2O3的液相色譜小瓶，并通過(guò)高效液相色譜儀測(cè)定吲哚濃度.

1.3 分析方法

吲哚濃度通過(guò)Agilent 1220型高效液相色譜儀(HPLC，德國(guó)Agilent公司)進(jìn)行測(cè)定，HPLC色譜柱型號(hào)為Agilent TC-C18(2)(4.6 mm×150.0 mm(內(nèi)徑×長(zhǎng)度)，5.0 μm(粒徑))，流動(dòng)相由含體積分?jǐn)?shù)為0.1%乙酸的水相和色譜級(jí)乙腈構(gòu)成，二者體積比為20∶80，流速為1.0 mL·min-1，測(cè)定波長(zhǎng)為270 nm，進(jìn)樣量為50 μL.

采用TU-1901型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)分別在340，732 nm處測(cè)定吸光度，再根據(jù)朗伯-比爾定律換算為ABTS和ABTS·+的濃度.

吲哚的中間降解產(chǎn)物通過(guò)Agilent 1290-6545型高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(LC/Q-TOF/MS，德國(guó)Agilent公司)負(fù)離子模式進(jìn)行分析.液相色譜柱為C18柱(3.0 mm×50.0 mm(內(nèi)徑×長(zhǎng)度)，1.8 μm(粒徑))，流動(dòng)相由色譜級(jí)甲醇(A相)和超純水(B相)構(gòu)成，流速為0.2 mL·min-1.采用梯度洗脫模式，A相比例在10 min內(nèi)從10%提高到90%.吲哚降解過(guò)程中的生物毒性變化采用熒光發(fā)光菌法進(jìn)行監(jiān)測(cè)，詳細(xì)步驟參考文獻(xiàn)[30].

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 ABTS強(qiáng)化HRP/H2O2體系降解吲哚的效能

ABTS加入前后HRP/H2O2體系對(duì)吲哚的降解效能，如圖1所示.圖1中：HRP的酶活力為133.3 nkat·mL-1；ABTS濃度為30 μmol·L-1；H2O2濃度為500 μmol·L-1；吲哚濃度為6 μmol·L-1；反應(yīng)溫度為(25±2) ℃；實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)兩次，點(diǎn)和誤差棒分別表示重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；t為反應(yīng)時(shí)間；δ為吲哚濃度剩余率，δ=ct/c0，c0為吲哚的初始濃度，ct為當(dāng)前時(shí)刻的吲哚濃度.

(a) ABTS加入前 (b) ABTS加入后

由圖1可知：ABTS加入前，在pH值為5.0～11.0的范圍內(nèi)，HRP/H2O2體系降解吲哚的速度緩慢；當(dāng)pH值為7.0時(shí)，HRP/H2O2體系在15 min內(nèi)僅降解了約20%的吲哚；ABTS加入后，在pH值為5.0～11.0的范圍內(nèi)，可顯著提升HRP/H2O2體系中吲哚的降解效能.

課題組之前的研究[29]表明，HRP可快速地催化H2O2氧化ABTS，生成ABTS·+.同時(shí)，文獻(xiàn)[16]的研究表明，ABTS·+具有較強(qiáng)的氧化活性，可快速地氧化降解吲哚.因此，可推測(cè)HRP/H2O2體系中加入的ABTS被氧化生成ABTS·+，反應(yīng)式為

HRP+H2O2+ABTS→ABTS·+，

(1)

進(jìn)而促進(jìn)吲哚的降解，反應(yīng)式為

ABTS·++吲哚→ABTS+吲哚降解產(chǎn)物.

(2)

前期報(bào)道發(fā)現(xiàn)，ABTS·+的氧化活性隨著反應(yīng)溶液pH值的升高而提高[31]，這與HRP/H2O2/ABTS體系在pH值為9.0時(shí)對(duì)吲哚的降解效能遠(yuǎn)高于pH值為7.0時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合(圖1(b)).然而，該體系在pH值為11.0時(shí)對(duì)吲哚的降解效能遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于pH值為9.0時(shí)，這可能是因?yàn)樵趐H值為11.0時(shí)，有相當(dāng)比例的H2O2電離為具有較強(qiáng)還原能力的HO2-(H2O2的解離系數(shù)為11.62[32-33])，進(jìn)而與吲哚競(jìng)爭(zhēng)消耗大量ABTS·+，導(dǎo)致HRP/H2O2/ABTS體系對(duì)吲哚的降解效能降低.此外，文獻(xiàn)[34]的研究表明，離子形態(tài)的吲哚比分子形態(tài)的吲哚更易被氧化降解，故HRP/H2O2/ABTS體系在pH值為5.0時(shí)對(duì)吲哚的降解效能反而高于pH值為7.0時(shí)，這主要?dú)w因于離子形態(tài)的吲哚在pH值為5.0時(shí)的比例更高，以及HRP/H2O2體系在pH值為5.0時(shí)對(duì)吲哚的降解具有更好的協(xié)同作用.

2.2 ABTS的強(qiáng)化作用機(jī)制

2.2.1 ABTS·+的生成及其對(duì)吲哚降解的作用 節(jié)2.1的分析認(rèn)為，加入ABTS后，HRP/H2O2體系吲哚降解效能的顯著提高歸因于體系中ABTS·+的生成.文獻(xiàn)[29，35-36]的研究表明，ABTS被氧化后生成的ABTS·+在可見(jiàn)光光譜區(qū)有顯著吸收，且在415，650，732，820 nm等4個(gè)波長(zhǎng)處有特征吸收峰.因此，為了驗(yàn)證ABTS·+的生成，對(duì)HRP/H2O2/ABTS體系反應(yīng)溶液進(jìn)行可見(jiàn)光光譜掃描.

各體系的可見(jiàn)光光譜圖，如圖2所示.圖2中：HRP的酶活力為133.3 nkat·mL-1；ABTS濃度為0～30 μmol·L-1(分別取0，5，10，20，30 μmol·L-1，下同)；H2O2濃度為500 μmol·L-1；吲哚濃度為6 μmol·L-1；初始pH值為7.0±0.1， 反應(yīng)溫度為(25±2) ℃；D為吸光度；λ為波長(zhǎng).由圖2可知：HRP/H2O2體系反應(yīng)溶液在可見(jiàn)光光譜區(qū)沒(méi)有明顯的吸收；ABTS的可見(jiàn)光譜也僅在340 nm波長(zhǎng)處有特征吸收峰，在ABTS·+的4個(gè)特征波長(zhǎng)均沒(méi)有明顯的吸收(與文獻(xiàn)[37]的研究結(jié)果一致)；加入ABTS后，出現(xiàn)了ABTS·+的4個(gè)特征吸收峰，表明確實(shí)有ABTS·+生成；隨ABTS濃度的提高，檢測(cè)到的4個(gè)ABTS·+特征吸收峰峰高也成比例提高，進(jìn)一步證實(shí)了體系中ABTS·+的存在.

圖2 各體系的可見(jiàn)光光譜圖

需要注意的是，當(dāng)存在過(guò)量H2O2時(shí)，ABTS·+可能會(huì)被進(jìn)一步氧化生成在518 nm處有特征吸收峰的ABTS2+[38]，但可見(jiàn)光光譜圖在518 nm處沒(méi)有特征吸收峰，進(jìn)而排除HRP/H2O2/ABTS體系中ABTS2+的生成.

ABTS·+是由HRP催化H2O2氧化ABTS產(chǎn)生的，其生成量受ABTS濃度影響較為顯著.為了探究ABTS·+在HRP/H2O2/ABTS體系中對(duì)吲哚降解的作用，進(jìn)一步考察不同ABTS濃度下吲哚的降解效能及其與ABTS·+生成量之間的關(guān)系.ABTS濃度對(duì)HRP/H2O2/ABTS體系的影響，如圖3所示.圖3中：HRP的酶活力為133.3 nkat· mL-1；ABTS濃度為0～30 μmol·L-1；H2O2濃度為500 μmol·L-1；吲哚濃度為6 μmol·L-1；初始pH值為7.0±0.1；反應(yīng)溫度為(25±2) ℃；kobs為表觀速率常數(shù)；c(ABTS)，c(ABTS·+)分別為ABTS，ABTS·+的濃度.

(a) 吲哚降解 (b) ABTS·+生成 (c) 反應(yīng)速率

由圖3(a)，(b)可知：吲哚的降解效能隨著ABTS濃度的增加而不斷提高；加入30 μmol·L-1的ABTS后，HRP/H2O2/ABTS體系對(duì)吲哚降解的表觀速率常數(shù)高達(dá)0.564 5 min-1，相比HRP/H2O2體系(0.015 6 min-1)提高了36.2倍；隨著ABTS濃度的增加，ABTS·+的生成濃度也成比例提高.在不同ABTS濃度下，對(duì)HRP/H2O2/ABTS體系中吲哚降解的表觀速率常數(shù)與ABTS·+生成濃度(t=15 s時(shí))進(jìn)行線性擬合，發(fā)現(xiàn)兩者之間具有良好的線性相關(guān)性(R2>0.99).由此可知，HRP/H2O2/ABTS體系中生成的ABTS·+對(duì)吲哚降解起主要作用.

2.2.2 ABTS的電子轉(zhuǎn)移體作用 據(jù)報(bào)道，氯丙嗪和HBT等有機(jī)小分子可作為電子轉(zhuǎn)移體強(qiáng)化水中有機(jī)污染物的降解.然而，氯丙嗪和HBT在強(qiáng)化有機(jī)污染物降解的過(guò)程中，其本身也會(huì)隨污染物的降解而不斷消耗，并不是完美的電子轉(zhuǎn)移體[22-23].同時(shí)，ABTS作為電子轉(zhuǎn)移體在強(qiáng)化高鐵酸鹽、高錳酸鹽降解污染物的過(guò)程中也存在分解[24，26].因此，進(jìn)一步對(duì)HRP/H2O2/ABTS體系降解吲哚過(guò)程中成分的濃度變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果如圖4所示.圖4中：HRP酶活力為133.3 nkat·mL-1；ABTS濃度為30 μmol·L-1；H2O2濃度為500 μmol·L-1；吲哚濃度為6 μmol·L-1；初始pH值為7.0±0.1；反應(yīng)溫度為(25±2) ℃；c為濃度.由圖4及相關(guān)分析可知：大部分ABTS先迅速通過(guò)單電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)锳BTS·+；然后，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，生成的ABTS·+被吲哚及吲哚降解中間產(chǎn)物還原回ABTS，導(dǎo)致ABTS穩(wěn)態(tài)濃度緩慢上升，而ABTS·+穩(wěn)態(tài)濃度及兩者的疊加濃度均緩慢下降；隨著吲哚的降解，ABTS和ABTS·+的疊加濃度在15 min內(nèi)由30 μmol·L-1下降至25 μmol·L-1左右，即ABTS的消耗比例約為17%；ABTS的少量消耗可能是由于生成的ABTS·+被氧化劑進(jìn)一步氧化破壞所致[24，26].因此，在HRP/H2O2/ABTS體系降解吲哚的過(guò)程中，盡管ABTS起到了電子轉(zhuǎn)移體的作用，但依然稱不上“完美”的電子轉(zhuǎn)移體.

圖4 HRP/H2O2/ABTS體系降解吲哚過(guò)程中成分的濃度變化

2.2.3 ABTS強(qiáng)化吲哚降解的作用機(jī)制 由上述分析可知，ABTS·+是HRP/H2O2/ABTS體系降解吲哚的主要活性物質(zhì)，并且強(qiáng)化劑ABTS在體系中可作為電子轉(zhuǎn)移體循環(huán)作用于吲哚的降解.文獻(xiàn)[10，39]的研究表明，HRP催化H2O2可生成具有氧化性的中間體化合物.因此，推測(cè)ABTS強(qiáng)化HRP/H2O2體系降解吲哚的反應(yīng)機(jī)制為:首先，HRP被H2O2氧化，生成氧化性中間體；然后，氧化性中間體通過(guò)單電子轉(zhuǎn)移的方式氧化ABTS，生成具有較強(qiáng)氧化活性的ABTS·+(式(1))；隨后，生成的ABTS·+快速氧化降解吲哚，且其自身被還原回ABTS(式(2))，即ABTS在HRP/H2O2/ABTS體系降解吲哚過(guò)程中主要起電子轉(zhuǎn)移體的作用.

HRP/H2O2/ABTS體系降解吲哚的反應(yīng)機(jī)制圖，如圖5所示.

圖5 HRP/H2O2/ABTS體系降解吲哚的反應(yīng)機(jī)制圖

2.3 水質(zhì)背景的影響

(a) 共存物質(zhì) (b) 腐殖酸質(zhì)量濃度 (c) 實(shí)際水體

由圖6(b)可知：當(dāng)腐殖酸質(zhì)量濃度從5 mg·L-1提高至20 mg·L-1，HRP/H2O2/ABTS體系對(duì)吲哚的降解效能沒(méi)有顯著影響，說(shuō)明HRP/H2O2/ABTS體系對(duì)較高質(zhì)量濃度的腐殖酸具有良好的抗干擾性能，可以運(yùn)用于較高濃度腐殖酸水體中吲哚的降解.

由圖6(c)可知：HRP/H2O2/ABTS體系可在10 min內(nèi)將超純水、湖水及二沉池出水中外加的6 μmol·L-1吲哚降解完全，呈現(xiàn)出高效的降解效能.這些現(xiàn)象表明，HRP/H2O2/ABTS體系應(yīng)用于吲哚的降解時(shí)對(duì)實(shí)際水體具有良好的抗干擾性能；湖水和二沉池出水水質(zhì)背景對(duì)吲哚降解有微弱抑制作用，主要是因?yàn)閷?shí)際水體中存在的天然有機(jī)物會(huì)與吲哚競(jìng)爭(zhēng)部分ABTS·+.

2.4 吲哚降解路徑及生物毒性分析

2.4.1 吲哚降解的產(chǎn)物和路徑 采用LC/Q-TOF/MS對(duì)HRP/H2O2/ABTS體系中吲哚的可能降解產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果如表2所示.表2中：tR為保留時(shí)間；RSD為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差.除吲哚本身外，還檢測(cè)出了5種吲哚降解產(chǎn)物.

表2 吲哚降解產(chǎn)物的信息

基于產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果，推測(cè)出兩種吲哚降解的路徑，如圖7所示.圖7中：DP1*和DP5*表示未檢測(cè)到.由圖7可得以下兩種吲哚降解的可能路徑.

圖7 HRP/H2O2/ABTS體系降解吲哚的途徑

圖8 HRP/H2O2/ABTS體系降解吲哚過(guò)程中的生物毒性變化

此外，由于吲哚對(duì)綠藻表現(xiàn)出顯著的毒性[31]，采用ECOSAR軟件進(jìn)一步模擬評(píng)估HRP/H2O2/ABTS體系降解吲哚過(guò)程中對(duì)綠藻急性毒性及慢性毒性的變化，確定吲哚及其降解產(chǎn)物的危險(xiǎn)等級(jí).

吲哚及其降解產(chǎn)物對(duì)綠藻的急性毒性和慢性毒性，如表3所示.表3中：EC50定義為96 h的半最大效應(yīng)質(zhì)量濃度，是指引起50%最大效應(yīng)的質(zhì)量濃度；ρChV為最大無(wú)可見(jiàn)不利影響質(zhì)量濃度和最低可見(jiàn)不利影響質(zhì)量濃度的幾何平均值.根據(jù)HJ-T 154-2004 《新化學(xué)物質(zhì)危害評(píng)估導(dǎo)則》，將危險(xiǎn)等級(jí)分為極高(EC50/ρChV≤1 mg·L-1)、高(1 mg·L-1100 mg·L-1).

由表3可知：吲哚對(duì)綠藻具有很強(qiáng)的急性毒性及慢性毒性，但其降解產(chǎn)物對(duì)綠藻的毒性均顯著低于吲哚，且其中降解產(chǎn)物DP7的毒性達(dá)到低危險(xiǎn)等級(jí)，這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了HRP/H2O2/ABTS體系降解吲哚可以顯著改善吲哚的毒性.

表3 吲哚及其降解產(chǎn)物對(duì)綠藻的急性毒性和慢性毒性

3 結(jié)論

ABTS的加入顯著強(qiáng)化了HRP/H2O2體系在pH值為5.0～11.0范圍內(nèi)對(duì)6 μmol·L-1吲哚的降解效能，且其強(qiáng)化效能隨著ABTS濃度的增加而提高.當(dāng)pH值為7.0時(shí)，30 μmol·L-1ABTS的加入可將HRP/H2O2體系中6 μmol·L-1吲哚降解的表觀速率常數(shù)提高36.2倍.HRP催化H2O2氧化ABTS生成的具有較高氧化活性的ABTS·+對(duì)吲哚降解起到主要作用，并且ABTS·+生成濃度與吲哚降解的表觀速率常數(shù)具有良好的線性關(guān)系(R2>0.99).