雷公藤治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析*

楊鋒磊，紀(jì) 偉

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.江蘇省中醫(yī)院風(fēng)濕科，江蘇 南京 210029)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種好發(fā)于育齡期女性，以多臟器受損為主要臨床特征的慢性自身免疫性疾病，主要累及心、肺、腎、腦等多個(gè)系統(tǒng)。SLE在中國(guó)大陸地區(qū)的患病率為30/10萬(wàn)～70/10萬(wàn)[1]，男女比例約為1∶9。目前SLE發(fā)病機(jī)制不明，存在較多爭(zhēng)議，多認(rèn)為是免疫、遺傳、感染、性激素等因素綜合作用導(dǎo)致。SLE治療多采用糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑，同時(shí)，長(zhǎng)期使用此治療方案帶來(lái)的一些不良反應(yīng)，如骨髓抑制、肝腎損傷和骨質(zhì)疏松等不容忽視。

中藥雷公藤具有清熱化瘀、利水消腫、祛風(fēng)除濕、止痛等功效。雷公藤常被運(yùn)用于治療風(fēng)濕免疫疾病，被用于SLE的治療且療效確切。既往基礎(chǔ)研究及臨床研究表明，雷公藤有效成分及其制劑等可以改善狼瘡小鼠癥狀及相關(guān)指標(biāo)，在治療SLE過(guò)程中，與激素或免疫抑制劑聯(lián)用優(yōu)于單用激素或免疫抑制劑[2-5]。雷公藤治療SLE雖有一定的臨床療效，但對(duì)其作用機(jī)制研究卻并不全面，本研究力求通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，深入挖掘雷公藤有效成分治療SLE潛在作用機(jī)制，為雷公藤治療SLE提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1雷公藤有效成分、靶點(diǎn)基因的篩選 在TCMSP平臺(tái)[6]以口服生物利用度(OB值)≥30%、藥物相似性(DL值)≥0.18為篩選條件，初步篩得雷公藤有效活性成分及相應(yīng)靶標(biāo)，將藥物靶點(diǎn)在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)[7]中處理成標(biāo)準(zhǔn)化基因名。

1.2SLE疾病靶點(diǎn)信息的篩選 以“systemic lupus erythematosus”為關(guān)鍵詞在Genecards[7]、OMIM[7]、TTD[8]、Drugbank[9]數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，去重后，獲取SLE疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3雷公藤對(duì)SLE作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將收集到的雷公藤成分靶點(diǎn)和SLE靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)相互映射，得到兩者共同靶點(diǎn)，即雷公藤治療SLE潛在作用靶點(diǎn)。采用Cytoscape軟件(V3.9.0)繪制“雷公藤-活性成分-潛在作用靶點(diǎn)-SLE”圖。

1.4蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 雷公藤對(duì)SLE的治療效應(yīng)是多個(gè)蛋白交互作用的結(jié)果。使用STRING網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)[10]分析雷公藤治療SLE的作用靶點(diǎn)，形成PPI，篩選置信度0.400以上的蛋白互作關(guān)系數(shù)據(jù)，將其導(dǎo)入Cytoscape軟件(V3.9.0)重新繪制可視化作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5GO和KEGG富集分析 為分析雷公藤治療SLE的潛在作用機(jī)制，了解其靶點(diǎn)在基因功能和信號(hào)通路中的作用，將雷公藤治療SLE靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)[11]，展開(kāi)GO、KEGG富集分析。限定物種為“Homo sapiens”，標(biāo)識(shí)符設(shè)置為“official gene symbol”，設(shè)定P<0.05，用微生信作圖工具(http://www.bioinformatics.com.cn/login/)將富集結(jié)果中與疾病相關(guān)基因功能及信號(hào)通路進(jìn)行可視化展示。

2 結(jié) 果

2.1雷公藤成分靶點(diǎn)和SLE疾病靶點(diǎn)篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得雷公藤51種潛在藥效成分、493個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，剔除23個(gè)沒(méi)有對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的成分和343個(gè)重復(fù)靶點(diǎn)，得到28個(gè)藥物有效成分和150個(gè)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。根據(jù)收集到的數(shù)據(jù)構(gòu)建“雷公藤-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1。圖中結(jié)點(diǎn)(node)表示雷公藤、活性成分、潛在靶點(diǎn)，邊(edge)表示三者之間的關(guān)系。其中多個(gè)成分可以共同作用于一個(gè)靶點(diǎn)，度值(dgree)>30的成分分別為山柰酚(63)、β-谷甾醇(39)、雷公藤甲素(35)、川陳皮素(35)、豆甾醇(31)。在Genecards、OMIM、TTD、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索“systemic lupus erythematosus”，去重后得到與SLE相關(guān)的靶點(diǎn)共1 447個(gè)。

2.2雷公藤-SLE治療靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 利用VENNY2.1.0將150個(gè)雷公藤靶點(diǎn)與1 447個(gè)SLE相關(guān)靶點(diǎn)取交集，雷公藤-SLE共同靶點(diǎn)共有82個(gè)，即雷公藤治療SLE作用靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2。將藥物、活性成分、關(guān)鍵作用靶點(diǎn)和疾病關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape軟件(V3.9.0)中構(gòu)建“雷公藤-活性成分-潛在作用靶點(diǎn)-SLE”圖，見(jiàn)圖3。從圖中可以看出，在雷公藤28個(gè)活性成分中，與82個(gè)潛在作用靶點(diǎn)相連接的共27個(gè)，治療SLE主要依靠5種活性成分：山柰酚(40)、雷公藤甲素(30)、川陳皮素(22)、β-谷甾醇(21)、豆甾醇(12)。

2.3PPI構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 將82個(gè)共同靶基因?qū)隨TRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)中，初步構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，去除游離靶點(diǎn)，該圖共涉及81個(gè)靶基因、1 054條基因互作關(guān)系線，見(jiàn)圖4。將在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的TSV文件導(dǎo)入Cytoscape軟件(V3.9.0)中，重新繪制PPI圖，見(jiàn)圖4。顏色越深、結(jié)點(diǎn)越大對(duì)應(yīng)的degree值越大；邊越粗、顏色越深反映combined score值越大。將degree值大小進(jìn)行降序排序，篩選排名前30的靶基因，繪制核心基因圖，見(jiàn)圖4。TNF、AKT1、JUN、VEGFA、TP53、CXCL8、PTGS2、MMP9前8個(gè)基因排名較前，這些degree值較大的基因可能在雷公藤治療SLE的網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。繪制前8位核心基因與雷公藤主要活性成分對(duì)應(yīng)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)除PTGS2外其余7個(gè)基因均與主要有效成分相連，此7個(gè)基因?yàn)楹诵幕?。?jiàn)圖4。

2.4GO功能富集分析 雷公藤治療SLE的GO功能富集分析見(jiàn)圖5，結(jié)果顯示，雷公藤治療SLE主要涉及細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、炎性反應(yīng)、對(duì)藥物的反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程；涉及質(zhì)膜、細(xì)胞外區(qū)、大分子復(fù)合物等細(xì)胞組成；涉及相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚化活性、酶結(jié)合、類固醇結(jié)合等分子功能。

2.5KEGG通路富集分析 雷公藤治療SLE的KEGG通路富集分析結(jié)果見(jiàn)圖6，結(jié)果顯示，雷公藤治療SLE的效應(yīng)機(jī)制主要與皮質(zhì)類固醇和心臟保護(hù)、通過(guò) Nrf2 誘導(dǎo)基因表達(dá)的氧化應(yīng)激、Th1/Th2 分化、非分型流感嗜血桿菌激活NF-κB、Toll樣受體通路、人類巨細(xì)胞病毒和圖激酶途徑、T細(xì)胞極化過(guò)程中趨化因子受體的選擇性表達(dá)等信號(hào)通路有關(guān)。

3 討 論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法，篩選獲得雷公藤有效成分28種，主要通過(guò)82個(gè)潛在作用靶標(biāo)治療SLE，根據(jù)雷公藤-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果顯示，山柰酚、雷公藤甲素、川陳皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等為雷公藤治療SLE的關(guān)鍵成分。山柰酚屬于黃酮類化合物，具有抗癌、抗炎、抗氧化應(yīng)激等生理功能[12]。研究表明，山柰酚通過(guò)降低促炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-8)的表達(dá)和AGS細(xì)胞中IL-8的產(chǎn)生，起到抗炎作用[13]。NLRP3炎癥小體在SLE疾病發(fā)展過(guò)程中的作用已被證實(shí)[14]，即抗原抗體免疫復(fù)合物通過(guò)上調(diào)Toll樣受體依賴的NF-κB途徑及刺激活性氧的產(chǎn)生，激活NLRP3炎癥小體，使IL-1β等分泌增加，加重SLE患者病情。山柰酚可以促進(jìn)細(xì)胞自噬，滅活NLRP3炎癥小體，仍需要更多研究證實(shí)山柰酚對(duì)SLE的治療作用。雷公藤甲素在治療SLE時(shí)具有減輕腎損傷、改善皮膚及黏膜損傷、減輕血管炎性反應(yīng)等作用。SLE患者外周血Tc與Th細(xì)胞比例在疾病發(fā)展不同階段存在差異，疾病活動(dòng)期Tc/Th失衡，Th1/Th2、Tc1/Tc2值增加[15-16]。雷公藤甲素[17]通過(guò)抑制Tc1/Tc2、Th1/Th2值，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌，使不同階段Tc、Th比值相對(duì)穩(wěn)定，從而減輕自身免疫組織損傷，控制SLE疾病進(jìn)展。川陳皮素具有抗氧化、減少M(fèi)MPs和炎癥表達(dá)的特性，通過(guò)激活SIRT-1/FOXO3a介導(dǎo)的自噬和線粒體功能來(lái)改善肝缺血和再灌注損傷[18]。LIN等[19]發(fā)現(xiàn)，川陳皮素抑制人滑膜細(xì)胞中IL-1誘導(dǎo)的PGE2的產(chǎn)生及干擾脂多糖誘導(dǎo)的PGE2的產(chǎn)生。β-谷甾醇、豆甾醇屬于植物甾醇[20]，通過(guò)減少促炎性細(xì)胞因子及趨化因子的釋放，抑制STAT1信號(hào)通路，發(fā)揮抗炎作用。

根據(jù)構(gòu)建的雷公藤-SLE蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及條形圖，TNF、AKT1、JUN、VEGFA、TP53為排列前5的靶蛋白。TNF[21]是一種主要的炎性細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)機(jī)體抗原與T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，被發(fā)現(xiàn)在SLE患者血清中升高，并與SLE疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)。AKT1[22]在PI3K/AKT信號(hào)通路處于下游位置，在外周B細(xì)胞分化和T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用，參與血管生成、蛋白合成等生物學(xué)過(guò)程，其通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR通路，激活I(lǐng)L-17、IL-4等細(xì)胞因子，抑制Treg細(xì)胞而參與SLE發(fā)病過(guò)程。另有研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者B細(xì)胞中AKT上調(diào)表達(dá)，AKT激活mTOR促進(jìn)B細(xì)胞增生[23]。JUN[24]通過(guò)參與SLE患者分泌產(chǎn)生AP-1依賴的促炎性細(xì)胞因子及FCGR2B啟動(dòng)子激活的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程，影響SLE疾病的進(jìn)程。VEGFA[25]，通常被稱為VEGF，是內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、毛細(xì)血管通透性增加和血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，連續(xù)血管生成、免疫介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙在SLE中起著重要的病理作用[26]，有研究表明，雷公藤在對(duì)BALB/c裸鼠誘發(fā)性紅斑狼瘡模型的治療中，可阻斷VEGFA與VEGFR1結(jié)合，抑制血管炎性反應(yīng)，減少組織血管新生及皮損[27]。

靶點(diǎn)GO功能富集分析顯示，雷公藤治療SLE主要涉及細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、炎性反應(yīng)、對(duì)藥物的反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程；涉及質(zhì)膜、細(xì)胞外區(qū)、大分子復(fù)合物等細(xì)胞組成；涉及相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚化活性、酶結(jié)合、類固醇結(jié)合等分子功能。

靶點(diǎn)KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，雷公藤治療SLE的效應(yīng)機(jī)制主要與皮質(zhì)類固醇和心臟保護(hù)、通過(guò) Nrf2 誘導(dǎo)基因表達(dá)的氧化應(yīng)激、Th1/Th2 分化、非分型流感嗜血桿菌激活NF-κB、Toll樣受體通路、人類巨細(xì)胞病毒和圖激酶途徑、T細(xì)胞極化過(guò)程中趨化因子受體的選擇性表達(dá)等信號(hào)通路有關(guān)。雷公藤可增強(qiáng)腎上腺皮質(zhì)功能[28]，其乙酸乙酯提取物興奮下丘腦-垂體-腎上腺軸，促進(jìn)皮質(zhì)激素分泌。有研究證實(shí)，雷公藤多苷聯(lián)合激素治療SLE在降低患者疾病活動(dòng)度方面優(yōu)于常規(guī)激素療法，可能與雷公藤多苷促進(jìn)GR表達(dá)，自身糖皮質(zhì)激素結(jié)合GR增多，自身免疫應(yīng)答得到抑制有關(guān)。能否使用雷公藤促進(jìn)SLE患者減少激素用量仍需要更多臨床研究證實(shí)[29-30]。通過(guò) Nrf2 誘導(dǎo)基因表達(dá)的氧化應(yīng)激通路是抗氧化防御的重要信號(hào)通路，有研究顯示，SLE患者的血液、組織和免疫細(xì)胞中的氧化應(yīng)激水平升高，氧化應(yīng)激水平與疾病活動(dòng)度相關(guān)，證明Nrf2具有治療SLE的靶標(biāo)潛力[31-33]。巨細(xì)胞病毒(CMV)屬于皰疹病毒家族[34-35]，在有初始癥狀或疾病惡化的SLE患者中觀察到CMV DNA和高血清IgM抗CMV水平，CMV感染被認(rèn)為可能是SLE發(fā)病重要的病因。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)闡述雷公藤活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)，分析雷公藤治療SLE的相關(guān)靶點(diǎn)及通路，初步預(yù)測(cè)其主要成分山柰酚、雷公藤甲素和川陳皮素等通過(guò)TNF、AKT1、JUN、VEGFA、TP53等核心靶點(diǎn)，以及皮質(zhì)類固醇和心臟保護(hù)、通過(guò) Nrf2 誘導(dǎo)基因表達(dá)的氧化應(yīng)激、Th1/Th2 分化等信號(hào)通路治療SLE。雷公藤治療SLE作用機(jī)制具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特性，為臨床及實(shí)驗(yàn)研究雷公藤治療SLE作用機(jī)制、有效撤減激素提供理論依據(jù)。