雙通道放電低溫等離子體滅活螺旋魚腥藻研究

蒲思川，邊 娜，劉 釗，賀 佳，師蘭婷

(1.西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710048；2.西安石油大學(xué) 陜西省油氣田環(huán)境污染控制技術(shù)與儲層保護(hù)重點實驗室，陜西 西安 710065；3.西安電力高等專科學(xué)校 能源與動力工程系，陜西 西安 710032)

0 引 言

近年來，隨著我國人口的增長和工業(yè)化進(jìn)程的加速，大量氮、磷等有機營養(yǎng)物質(zhì)排入水體，造成水體嚴(yán)重富營養(yǎng)化，藍(lán)藻水華頻繁爆發(fā)[1]，成為我國湖泊、河流污染治理的難題之一，亟需尋求安全、有效的藍(lán)藻水華控制技術(shù)來解決這一問題。

目前，國內(nèi)外治理藍(lán)藻水華的方法有化學(xué)法、生物法和物理法等。采用化學(xué)方法在湖泊中投放殺藻劑[2]和金屬鹽[3]，雖然比較快速、高效，但無法徹底根除[4]，還會使部分藻類的藻毒素釋放到水中威脅水質(zhì)安全[5]，殺藻劑本身也容易造成水體的二次污染[6]，通常只能作為應(yīng)急措施。生物法利用生態(tài)系統(tǒng)中的食物鏈原理和生物之間的相生相克關(guān)系來控制藻類生長[7]，雖然不存在化學(xué)污染問題，是一種“綠色”的除藻方法，但在湖泊大量投放食藻動物，有可能對湖泊生物種群結(jié)構(gòu)、生物多樣性造成一定的影響。且微生物的培養(yǎng)馴化對技術(shù)和管理要求都很高，作用時間長[8]，并需要投入大量的資金[9]。物理方法中的機械清除[10]、直接過濾[11]、超聲[12]、氣浮[13]和混凝沉淀[14]等方法，能直接清除湖面藍(lán)藻水華，且無明顯負(fù)面影響，但存在對高藻水的除藻效果不理想，受場地限制難于進(jìn)行規(guī)?；\行[15]，能耗大[16]，實施難度也大[17]等問題。綜上所述，雖然人們在藍(lán)藻治理方面進(jìn)行了不少研究，但現(xiàn)有的藍(lán)藻處理方法存在二次污染[18]，藍(lán)藻藻毒素釋放到水體中影響水質(zhì)安全[19]，處理效率不高，不能從根本上消除藍(lán)藻水華，容易反彈[20]。

低溫等離子體(Low-temperature/Cold plasma)，又稱非平衡態(tài)等離子體，主要是由氣體放電產(chǎn)生的，內(nèi)部電子溫度在104K以上，而原子、分子及離子等重粒子的溫度卻非常接近常溫(300～500 K)[21]，從而形成熱力學(xué)上的非平衡態(tài)。低溫等離子體的非平衡性使得電子有足夠的能量激發(fā)、電離和離解反應(yīng)物，可以進(jìn)行熱力學(xué)上不易發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)。低溫等離子體主要有電暈放電、介質(zhì)阻擋放電、常壓輝光放電、次輝光放電、微波放電等幾種產(chǎn)生方式[22]。目前，低溫等離子體應(yīng)用廣泛，包括刻蝕[23]、薄膜沉積[24]、聚合膜改性[25]，對廢氣、廢水的處理[26-27]，各種材料的表面處理[28-29]，O3制備[30]，滅菌消毒[31]、等離子體顯示[32]、農(nóng)業(yè)育種[33]等。低溫等離子體技術(shù)具有清潔、高效、無選擇性，能在常溫下實現(xiàn)普通化學(xué)實驗室里難以實現(xiàn)的化學(xué)反應(yīng)，且無二次污染[34]的特點。

目前，低溫等離子體技術(shù)在除藻方面已有一些研究和應(yīng)用。李俊楠等利用同軸型三電極介質(zhì)阻擋放電反應(yīng)器對銅綠微囊藻進(jìn)行抑制效應(yīng)研究[35]。MIZUKOSHI等利用高壓脈沖放電等離子體處理硅藻和鈣球藻，發(fā)現(xiàn)低溫等離子體對藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞內(nèi)容物具有破壞作用[36]。MARLEK等利用低溫等離子體技術(shù)結(jié)合水力空化技術(shù)去除自來水廠預(yù)處理前原水中的藍(lán)藻，去除效果好，且無微囊藻毒素產(chǎn)生，不會造成二次污染[37]。宋丹利用平板式介質(zhì)阻擋放電反應(yīng)器對小球藻進(jìn)行了殺滅試驗，放電處理10 min，小球藻滅活率達(dá)到100%[38]。

在藍(lán)藻水華中，螺旋魚腥藻是爆發(fā)最多的優(yōu)勢藻種之一[39]。魚腥藻可產(chǎn)生毒素，對環(huán)境和人畜健康造成極大危害[40]。本文以螺旋魚腥藻為研究對象，采用雙通道放電低溫等離子體反應(yīng)器對螺旋魚腥藻進(jìn)行滅活研究，并檢測其滅活效果，分析其作用機理，以期為藍(lán)藻水華治理提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑

硼酸、氯化錳、檸檬酸、硫酸鋅(AR，天津市博迪化工有限公司)；鹽酸、磷酸、無水乙醇(AR，西安三浦精細(xì)化工有限公司)；乙二胺四乙酸二鈉、碳酸鈉(AR，天津市登峰化學(xué)試劑廠)；氫氧化鈉、磷酸氫二鉀(AR，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠)；檸檬酸鐵銨、氯化鈣、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉(AR，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；鉬酸鈉(AR，天津市化學(xué)試劑四廠)；氯化鈉(AR，天津市化學(xué)試劑六廠)；硝酸鈷(AR，西安門捷科技有限責(zé)任公司)；硫酸鎂(AR，天津市巴斯夫化工有限公司)；無水硝酸鈉(AR，成都金山化學(xué)試劑有限公司)；硫酸銅(AR，天津市恒興化學(xué)試劑有限責(zé)任公司)；硫代巴比妥酸(AR，上?？笊锛夹g(shù)有限公司)。實驗用水均為去離子水。

1.1.2 儀器

臺式離心機(TGL-16C，上海安亭科學(xué)儀器廠)；電導(dǎo)率測試儀(EC215，意大利哈納公司)；智能型智能光照培養(yǎng)箱(GXZ，寧波江南儀器廠)；臺式酸度測定儀(pH213，意大利哈納公司)；紫外可見分光光度計(Agilent8453，安捷倫科技有限公司)；全自動壓力滅菌消毒器(LDZX-40II，上海申安醫(yī)療器械廠)。

1.1.3 藻種

螺旋魚腥藻(購自中科院武漢水生生物研究所國家淡水藻種庫，F(xiàn)ACHB)。

1.1.4 實驗裝置

采用課題組自行研發(fā)的雙通道放電低溫等離子體反應(yīng)器，雙通道放電低溫等離子體反應(yīng)器結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖 1 雙通道放電低溫等離子體反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意圖注：1—電源;2—電極;3—絕緣板;4—絕緣套管; 5—空氣等離子體區(qū);6—螺旋魚腥藻溶液。Fig.1 Structural diagram of dual channel discharge low temperature plasma reaction device

1.2 實驗過程

1.2.1 藻種培養(yǎng)

將螺旋魚腥藻接種在新鮮的BG11培養(yǎng)基中，放置在智能光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)期，培養(yǎng)條件為(24±1) ℃，2 500 lx光照強度，光暗比L∶D=12 h∶12 h[41]。

1.2.2 除藻實驗

以發(fā)育完好，生命力強的對數(shù)期螺旋魚腥藻為研究對象，采用雙通道放電低溫等離子體反應(yīng)器對其進(jìn)行放電處理。以滅活率為衡量指標(biāo)，通過改變雙通道放電低溫等離子體場的電氣參數(shù)(電極-液面間距、放電時間和液層厚度)及螺旋魚腥藻溶液液相體系因素(藻液初始濃度和初始pH值)等參數(shù)，進(jìn)行滅活螺旋魚腥藻的研究。

藻細(xì)胞的干重和懸浮液光密度(optical density，OD)具有良好的線性關(guān)系，因此以O(shè)D值作為藻液活細(xì)胞生物量(藻細(xì)胞濃度、細(xì)胞密度)的度量標(biāo)準(zhǔn)[42]。經(jīng)紫外-可見吸收光譜測定，選擇測定其在最大吸收波長680 nm處的OD值來反映放電處理對其滅活效果。螺旋魚腥藻的滅活率(η，%)的計算公式為

(1)

式中：A0和At分別為處理前后螺旋魚腥藻溶液在最大吸收波長處的光密度值。

1.3 理化性質(zhì)

1.3.1 MDA含量

采用硫代巴比妥酸(TBA)法對MDA含量進(jìn)行測定。測定一定量的離心后樣品鮮重，再加入一定量的0.05 mol/L的磷酸緩沖液，凍融5次后進(jìn)行離心，取離心后上清液2 mL，以1∶1比例加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的TBA溶液，混勻后于100 ℃水浴30 min，冷卻后以3 500 r/min速度離心10 min，取上清液分別于450、532和600 nm處測定OD值，MDA含量[CMDA, μmolg-1(FW)]計算方法為

CMDA=[6.45(OD532-OD600)-0.56OD450]V×

1 000/V1×155×W

(2)

式中：155 (mmol·cm-1)為消光系數(shù)；6.45為用經(jīng)驗公式求解的換算系數(shù)；V為提取液體積，mL；V1為測定用提取液體積，mL；W為樣品鮮質(zhì)量，g。

1.3.2 細(xì)胞膜相對通透性

取一定量經(jīng)放電處理的螺旋魚腥藻試樣和空白樣，測定電導(dǎo)率記為R1。而后在沸水浴中處理樣品15 min，冷卻至室溫后測定電導(dǎo)率記為R2。為保證測定準(zhǔn)確性，每個樣品均測定3次取平均值。以相對電導(dǎo)率(電導(dǎo)率與總電導(dǎo)率的比值)來表示細(xì)胞膜的相對通透性，電導(dǎo)率(σ)計算公式為

σ=R1/R2×100%

(3)

式中：R1和R2分別為放電前后溶液的電導(dǎo)率。

2 結(jié)果與討論

2.1 電氣參數(shù)對螺旋魚腥藻滅活效果的影響

2.1.1 電極-液面間距

在電源電壓220 V，放電時間5 min，液層厚度10 mm，藻液初始OD值0.35的條件下，考察電極-液面間距變化對螺旋魚腥藻滅活效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖 2 電極-液面間距對螺旋魚腥藻的滅活效果Fig.2 Inactivation effect of electrode liquid level spacing on Anabaena spiroides

在相同放電時間下，隨著電極-液面間距的增大，螺旋魚腥藻的滅活率先升后降。當(dāng)電極-液面間距為2 mm時，放電5 min后螺旋魚腥藻滅活率可達(dá)97%。電極-液面間距增加到5 mm以上時，同樣的放電時間，滅活率不到76%。因為在產(chǎn)生等離子體的電極-液面間距范圍內(nèi)，電極-液面間距越小，其電場強度越大，易于生成高能電子及活性物種，有利于反應(yīng)的進(jìn)行；而隨著電極-液面間距的增大，其電場強度變小，阻礙了高能電子的產(chǎn)生和加速電子的漂移，活性物種數(shù)量減少，反應(yīng)不易進(jìn)行，滅活率降低。且電極-液面間距變小時，液滴可能濺到電極表面，影響電極正常放電?？紤]實驗時的處理量，設(shè)定電極-液面間距為2 mm。

2.1.2 放電時間

設(shè)電源電壓為220 V，電極-液面間距2 mm，液層厚度10 mm，藻液初始OD值0.35，考察放電時間對螺旋魚腥藻滅活效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖 3 放電時間對螺旋魚腥藻的滅活效果Fig.3 Inactivation effect of discharge time on Anabaena spiroides

螺旋魚腥藻的滅活率隨著放電時間的延長而升高。放電1 min時滅活率僅為10%，而6 min時可達(dá)到99.2%。因為放電時間增加，產(chǎn)生的高能電子及活性物種濃度增大，與藻細(xì)胞的作用時間延長，細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)容物外泄，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。由此可知，低溫等離子體放電短時間內(nèi)便可實現(xiàn)對螺旋魚腥藻的滅活。

2.1.3 液層厚度

設(shè)電源電壓為220 V，電極-液面間距2 mm，放電時間5 min，初始藻液OD值為0.35，考察液層厚度改變對螺旋魚腥藻滅活效果的影響，結(jié)果如圖4所示。液層厚度在相同的處理液面面積下即代表著等離子體場中待處理的螺旋魚腥藻溶液量。

圖 4 液層厚度對螺旋魚腥藻的滅活效果Fig.4 Inactivation effect of liquid layer thickness on Anabaena spiroides

由圖4可以看出，隨著液層厚度的增加，螺旋魚腥藻的滅活率逐漸降低。液層厚度為5 mm時，放電處理5 min，螺旋魚腥藻的滅活率為98.5%，基本上完全滅活；而液層厚度為13 mm時，相同的處理時間滅活率僅為55.7%。滅活率差距大的原因在于，放電生成的高能電子及活性物種較易進(jìn)入液層厚度薄的溶液，可以與螺旋魚腥藻充分接觸并反應(yīng)，而隨著液層厚度的增加，螺旋魚腥藻細(xì)胞數(shù)目增多，同時放電產(chǎn)生的高能電子和活性物種數(shù)量很難到達(dá)液層內(nèi)部，導(dǎo)致滅活效率降低。雖然液層厚度增加滅活率會降低，但是可通過延長放電時間來保證較高的滅活率。同時考慮到藻液處理量不能太少，最終選擇液層厚度為10 mm進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 液相體系因素對螺旋魚腥藻滅活效果的影響

2.2.1 藻液初始濃度

在電源電壓為220 V，電極-液面間距2 mm，放電時間5 min，液層厚度10 mm的放電條件下，考察藻液初始濃度和放置培養(yǎng)時間對螺旋魚腥藻滅活效果的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖 5 藻液初始濃度對螺旋魚腥藻的滅活效果Fig.5 Inactivation effect of initial concentration on Anabaena spiroides

從圖5可以看出，放電當(dāng)天隨著藻液初始濃度的增加，在同一放電時間下，螺旋魚腥藻的滅活率呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。這是因為在一定的放電時間內(nèi)低溫等離子體產(chǎn)生的活性物種的數(shù)量有限，溶液初始濃度越大，進(jìn)入放電區(qū)的藻細(xì)胞越多，同時由碰撞反應(yīng)形成的中間產(chǎn)物也參與其中，藻細(xì)胞本身和其中間產(chǎn)物都爭相與活性物種反應(yīng)，使得藻細(xì)胞與活性物種反應(yīng)幾率降低，從而導(dǎo)致滅活率降低。

同一初始濃度的藻液隨放置培養(yǎng)時間的延長，滅活率也逐漸提高。初始OD值為0.2和0.4的藻液在放置培養(yǎng)的第2天滅活率即達(dá)到100%。初始OD值為0.6、0.8和1.0藻液的滅活率也一直呈上升趨勢，到第5天時滅活率最低也達(dá)到91%。這說明在放電完成之后，放電產(chǎn)生的活性物種的活性并沒有立即消失，而是在放置培養(yǎng)期間繼續(xù)存在于藻液中，并與藻細(xì)胞進(jìn)一步反應(yīng)，從而滅活率提高，并且處理效果基本不反彈。

雖然藻液初始濃度提高導(dǎo)致滅藻效果減弱，但可通過延長放電時間來保證較高的滅活率。相對其他處理方法，雙通道放電低溫等離子體完全滅活螺旋魚腥藻所需時間仍然很短，即藻液初始濃度對螺旋魚腥藻的滅活率無顯著影響。

2.2.2 藻液初始pH值

在電源電壓220 V，電極-液面間距2 mm，放電時間5 min，液層厚度10 mm，藻液初始OD值0.35的放電條件下，考察較適宜螺旋魚腥藻生長的初始pH值(6～10)對螺旋魚腥藻滅活率的影響，實驗結(jié)果見圖6。

圖 6 藻液初始pH值對螺旋魚腥藻的滅活效果Fig.6 Inactivation effect of initial pH on Anabaena spiroides

從圖6可以看出，弱堿性藻液中螺旋魚腥藻的滅活率均高于弱酸性藻液。放電當(dāng)天，初始pH值為9的樣品滅活率最高，為70%以上。放置培養(yǎng)后的第3天除pH為6的樣品外，其余樣品滅活率均超過95%；第5天，pH值為6的樣品滅活率達(dá)到91%，其余樣品滅活率均達(dá)到了100%。

藍(lán)藻的生長環(huán)境一般為中性水體，隨著藍(lán)藻生長，其生長的水體會逐漸向微弱堿性變化。因為藻類光合作用消耗水體中的CO2，致使水中H+減少，pH值升高，使其水體pH值呈弱堿性。正常的藻細(xì)胞能夠根據(jù)生長環(huán)境的變化調(diào)節(jié)溶液的pH值向適合自身生長的方向發(fā)展。但是，部分細(xì)胞由于自身修復(fù)功能受損而致使調(diào)節(jié)能力降低，不能及時修復(fù)生長水體環(huán)境而逐漸衰亡，并且在放電過程中產(chǎn)生大量的·OH，O3，H2O2等強氧化性物質(zhì)。因此，在弱堿性溶液中，除了放電產(chǎn)生的直接效應(yīng)外，在這一系列活性物種的氧化作用下，滅活率得到了提高。在螺旋魚腥藻正常生長條件下，其生長環(huán)境pH值為弱堿性，故一般水體中若用雙通道放電低溫等離子體滅活時，pH值對滅活效果影響不大。

綜上所述，確定本實驗的最佳放電條件為：電極-液面間距2 mm，放電時間5 min，液層厚度10 mm，溶液初始OD值0.35，pH值為弱堿性。后續(xù)實驗均以此條件為基礎(chǔ)進(jìn)行。

2.3 理化性質(zhì)

2.3.1 MDA含量

丙二醛(MDA)是大量自由基對生物體進(jìn)行氧化攻擊，細(xì)胞膜中的脂類發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)生成的氧化終產(chǎn)物。MDA含量可體現(xiàn)細(xì)胞膜過氧化程度的高低，其產(chǎn)生和積累可作為間接反映細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損、藻細(xì)胞受脅迫程度的標(biāo)志。

雙通道放電低溫等離子體處理對螺旋魚腥藻細(xì)胞內(nèi)MDA含量的影響如圖7所示。

圖 7 MDA含量變化Fig.7 Changes of MDA content

從圖7可以看出，經(jīng)雙通道放電處理之后，藻細(xì)胞內(nèi)MDA含量隨放電時間延長而增加，隨培養(yǎng)時間增加MDA含量先升后降。在放電當(dāng)天MDA含量上升很快，處理10 min和20 min的樣品MDA含量分別為1.39和1.65 μmol·g-1(FW)，與空白樣[0.63 μmol·g-1(FW)]相比，分別上升120.63%和161.9%?？瞻讟釉诜胖门囵B(yǎng)期間，MDA含量基本不變。

以上結(jié)果說明，放電處理使細(xì)胞膜發(fā)生了脂質(zhì)過氧化，·OH自由基等活性物種攻擊細(xì)胞膜致其損傷，細(xì)胞質(zhì)外溢，細(xì)胞開始解體。在放置培養(yǎng)后期，MDA含量有所下降，說明放置培養(yǎng)后期脂質(zhì)過氧化作用減弱，可能是由于細(xì)胞膜內(nèi)細(xì)胞器受損嚴(yán)重，達(dá)到細(xì)胞的耐受極限，無法維持其正常生命活動，引起藻細(xì)胞分解死亡。

2.3.2 細(xì)胞膜相對通透性

細(xì)胞膜是分隔細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的重要屏障，細(xì)胞膜相對通透性的變化是反映細(xì)胞受損程度的重要標(biāo)志。細(xì)胞膜具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，可看作是平行平板電容的電解質(zhì)。因此，雙通道放電低溫等離子體對螺旋魚腥藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞的程度可由藻液電導(dǎo)率的變化來表示，反映螺旋魚腥藻細(xì)胞膜的相對通透性[43]。

雙通道放電低溫等離子體放電處理前后細(xì)胞膜相對通透性的變化見圖8。

圖 8 細(xì)胞膜相對通透性變化Fig.8 Changes of cell membrane relative permeability

從圖8可以看出，放電當(dāng)天樣品的細(xì)胞電解質(zhì)外滲率隨放電時間增加呈上升趨勢，且均高于空白樣。放置培養(yǎng)期間，細(xì)胞電解質(zhì)外滲率先升后降，但基本均高于空白樣，即放電處理過的藻細(xì)胞細(xì)胞膜相對通透性變大，說明細(xì)胞膜受損，內(nèi)容物外泄，細(xì)胞開始解體。培養(yǎng)到第5天時，處理樣的電解質(zhì)外滲率下降很快，放電5 min樣品已經(jīng)低于空白樣，這可能是因為細(xì)胞大部分已死亡，細(xì)胞膜破裂使得細(xì)胞內(nèi)的非電解質(zhì)溢出，使得電解率下降。

上述2個實驗結(jié)果說明，經(jīng)雙通道放電低溫等離子體處理后螺旋魚腥藻的細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到了嚴(yán)重破壞。MDA含量的變化表明細(xì)胞膜發(fā)生了脂質(zhì)過氧化，細(xì)胞受到了破壞，細(xì)胞膜相對通透性的變大恰好驗證了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞。初步推測磷脂的降解過程如下：放電產(chǎn)生的·OH等活性物種首先攻擊磷脂中的脂鍵及不飽和脂肪酸碳鏈，使其斷裂，不飽和基團(tuán)被·OH等活性物種氧化，生成過氧化物種，然后磷脂反應(yīng)分解出來的羧酸脫羧生成CO2、H2O以及小分子的醛、酮等。分解后的產(chǎn)物在·OH等活性物種的繼續(xù)氧化作用下可能生成CO2、H2O以及磷酸等無機小分子，如圖9所示。

圖 9 低溫等離子體放電破壞細(xì)胞膜磷脂雙分子層可能的反應(yīng)途徑Fig.9 Possible reaction pathway for the destruction of cell membrane lipid bilayer by low-temperature plasma

3 結(jié) 論

1) 雙通道放電低溫等離子體對螺旋魚腥藻的滅活率隨電極-液面間距和液層厚度的增大而降低；隨放電時間的延長而升高；溶液液相體系因素對滅活效果無顯著影響。

2) 經(jīng)雙通道放電低溫等離子體處理后，藻細(xì)胞的生長受到嚴(yán)重破壞。MDA含量隨放電時間的延長而增加；電解質(zhì)滲出率也隨放電時間的延長而增大，細(xì)胞膜相對通透性增大，細(xì)胞內(nèi)容物泄漏。

3) 在電極-液面間距2 mm，放電時間5 min，液層厚度10 mm，溶液初始OD值0.35，pH值為弱堿性時，螺旋魚腥藻的滅活率可達(dá)90%以上，且處理效果不反彈。說明雙通道放電低溫等離子體對螺旋魚腥藻具有很好的滅活效果。