微小RNA-141靶向表皮生長因子受體調(diào)控乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機制研究

王 婧, 周 蓓, 吳 忠, 吳沉昊

(海南省婦女兒童醫(yī)學中心 乳腺外科, 海南 ?？? 570206)

研究[1]顯示乳腺癌占全球女性浸潤性癌癥的22.9%, 每年約有425 000名女性死于乳腺癌。更為嚴峻的是，每年有35 000名女性死于乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移，這是因為癌細胞可以通過血液擴散到全身，導致病情進一步惡化[2-3]。根據(jù)定義乳腺癌表型和預測治療反應的分子標志物，可以將乳腺癌分為不同的亞型，包括管腔亞型和基底亞型，其中基底亞型是癌細胞中侵襲性最強的，腫瘤轉(zhuǎn)移率高，患者存活率較低[4-5]。上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指通過特定的程序?qū)⑸掀ぜ毎D(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學過程[6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)EMT異常激活與加速各種癌癥的進展有關(guān)。研究[8-9]表明, EMT是惡性腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的基礎，是源自上皮細胞的惡性細胞遷移和侵襲的重要生物學過程。研究[10]表明，表皮生長因子受體(EGFR)的表達與乳腺癌的發(fā)生和預后有關(guān)。研究[11-12]報道在三陰性乳腺癌患者中可觀察到EGFR的遺傳改變，并可被視為乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的潛在生物標志物。本研究探討EGFR在乳腺癌中的作用及其上游調(diào)控機制，為乳腺癌早期生物標志物的篩選及靶向治療提供依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年10月—2017年10月本院收集的60份腫瘤組織和癌旁正常組織樣本(距離腫瘤組織>5 cm)。納入標準: ① 經(jīng)2名以上病理學家確診者; ② 患者均未進行術(shù)前或術(shù)后藥物治療; ③ 患者無其他惡性疾病或腫瘤; ④ 患者依從性良好。排除標準: ① 男性乳腺癌患者; ② 合并其他惡性疾病或腫瘤者; ③ 接受過相關(guān)干預治療者; ④ 依從性較差的患者。所有樣本取出后迅速轉(zhuǎn)移到液氮中保存并貯存在-80 ℃冰箱中。所有納入患者均對本研究知情同意。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會審核通過(審批號: 2022倫申第1號)。

1.2 細胞系和細胞培養(yǎng)

人乳腺纖維細胞系(Hs578Bst)和3種人乳腺癌細胞系(MCF-7、MDA-MB-231和 MDA-MB-435)均購自北納生物。人乳腺細胞系Hs578Bst在90%的DMEM培養(yǎng)基和10%的胎牛血清(FBS)中培養(yǎng)。MCF-7和MDA-MB-231在90%的DMEM和10% FBS組成的CM1-1培養(yǎng)基中培養(yǎng)。人乳腺癌細胞MDA-MB-435在90%的L15和10%的FBS中培養(yǎng)。細胞在37 ℃、5% CO2的潮濕環(huán)境中生長。

1.3 微陣列分析

使用癌癥基因組圖譜計劃(TCGA)數(shù)據(jù)分析癌旁組織和乳腺癌組織之間的前20個差異表達基因。篩選標準為log2(倍數(shù)變化)mRNAs>1和P<0.05。

1.4 加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡分析(WGCNA)

WGCNA R軟件包用于在共表達網(wǎng)絡中收集多組強共表達基因。使用加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡重建算法創(chuàng)建共表達網(wǎng)絡。差異表達數(shù)據(jù)預處理后，去掉所有樣本中表達量都很低的基因，去掉所有樣本中表達量幾乎沒有差異的基因，可用sd篩選，但不建議只保留差異基因。構(gòu)建相關(guān)性矩陣，相關(guān)系數(shù)范圍是-1～1, 而后構(gòu)建拓撲重疊矩陣，對基因進行聚類，每條線代表1個基因，相似的基因被聚到1個分支。

1.5 雙熒光素酶報告基因檢測

通過Targetscan和Miranda預測微小RNA-141(miR-141)的靶基因，然后使用雙熒光素酶報告基因檢測證明miR-141與靶基因之間的靶向關(guān)系。Dual-Luciferase Reporter System(Progema, 美國)用于測量螢火蟲和海腎熒光素酶活性的熒光素酶活性。根據(jù)制造商的說明，在Lipofectamie 2000 (Invitrogen, 美國)基礎上應用miR-141模擬物或miR-141 NC轉(zhuǎn)染含有EGFR 3′UTR-WT或EGFR 3′UTR-MUT的psi-CHECK2 載體或psi-CHECK2。所有寡核苷酸均購自Sangon Biotech(中國上海)。

1.6 細胞轉(zhuǎn)染

將購自Genepharma(中國上海)的miR-141模擬物、miR-141抑制劑、pcDNA3.1-EGFR 重組質(zhì)粒和miRNA對照轉(zhuǎn)染到MDA-MB-231和MDA-MB-435細胞中。轉(zhuǎn)染前1 d, 將處于對數(shù)期的MDA-MB-231和MDA-MB-435細胞(5×104/mL)接種到12孔板中。第2天，當細胞達到約80%匯合時，采用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染效率通過實時定量聚合酶鏈式反應(PCR)測試進行評估。

1.7 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

根據(jù)制造商的說明，使用TRIzol試劑(Invitrogen)從組織或細胞系中提取總RNA。根據(jù)制造商的說明，使用多合一TM miRNA qRT-PCR檢測試劑盒制備提取的RNA。HiScipt Ⅱ (Vazyme，China)用于合成cDNA。使用AB7300 thrmo-recycler (Applied Biosystems, USA)進行qRT-PCR, 相關(guān)的EGFR、GAPDH、miR-141和U6的引物序列見表1。GAPDH和U6分別作為EGFR和miR-141檢測的內(nèi)參基因。通過2-△△ct計算EGFR和miR-141的相對表達水平，每個實驗獨立進行3次。

表1 qRT-PCR相關(guān)的引物序列

1.8 細胞增殖試驗

使用Cell Counting Kit-8(CCK-8系統(tǒng), Dojindo, 日本)評估細胞增殖能力。轉(zhuǎn)染后，將細胞接種于96孔板(每孔密度為2×103個細胞)，并通過CCK-8系統(tǒng)記錄細胞增殖情況，每24 h記錄1次，持續(xù)3 d。使用酶標儀在450 nm處檢測光密度值。

1.9 Transwell實驗

使用24孔Transwell小室(Corning, NY, USA)評價乳腺癌細胞遷移能力。在Transwell上室加入200 μL乳腺癌細胞懸液(1×105個細胞); 在下室添加600 μL含有1% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基; 24 h后，將遷移到下表面的乳腺癌細胞用無水乙醇固定10 min, 然后用0.5%結(jié)晶紫染色10 min。在顯微鏡(Olympus，日本)下放大200倍觀察染色的細胞。

1.10 BrdU增殖情況檢測

BrdU標記細胞完成后，去除培養(yǎng)液，并加入1 mL 4%的多聚甲醛，室溫固定15 min后，每孔加入1 mL含0.3% TritonX-100的PBS，室溫孵育15 min。每孔加入0.5 mL Click反應液，輕輕搖晃培養(yǎng)板以確保反應混合物可以均勻覆蓋樣品。室溫避光孵育30 min, 吸除Click反應液，用洗滌液洗滌3次。1×Hoechst 33342溶液的配制: 按1∶1 000比例用PBS稀釋Hoechst 33342。吸除洗滌液后，每孔加1×Hoechst 33342溶液1 mL, 室溫避光孵育10 min。用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.11 蛋白質(zhì)印跡分析

使用RIPA裂解緩沖液裂解轉(zhuǎn)染后的乳腺癌細胞。使用BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒(Thermo Fisher Scientific，美國)測量細胞裂解物的蛋白質(zhì)濃度。等量蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)至PVDF膜(Millipore, 德國), 5%脫脂奶粉室溫密封2 h, 然后用原代培養(yǎng)抗體4 ℃過夜。一抗包括抗波形蛋白(Santa Cruz, CA，USA; 1∶5 000)、抗E-cadherin(Santa Cruz; 1∶5 000)、抗EGFR(Santa Cruz; 1∶5 000)和抗GAPDH(Santa Cruz; 1∶5 000)。使用辣根過氧化物酶(HRP)滯后的二抗在室溫下孵育膜1 h。掃描印跡并使用Quantity One成像軟件(Bio-Rad, 美國)測量條帶密度。

1.12 裸鼠皮下移植實驗

取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞，制備單細胞懸液計數(shù)，按2×105個/只分別接種于BALB/c裸鼠背部左側(cè)或右側(cè)皮下，每組6只裸鼠, 4周后處死裸鼠，觀察成瘤情況。

1.13 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad 7.0(GraphPad Software, 美國)進行統(tǒng)計分析。經(jīng)正態(tài)檢驗后，滿足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差的形式表示, 2組間比較分析采用t檢驗，多組比較分析采用單因素方差分析(ANOVA)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 EGFR在乳腺癌組織和細胞中的表達情況

應用TCGA數(shù)據(jù)庫分析乳腺癌基因表達情況。在乳腺癌細胞中，差異表達前20個基因組的熱圖顯示，含有EGFR的基因組在乳腺癌細胞中的表達上調(diào)(圖1A)。根據(jù)其在乳腺癌中的表達，基因組被分為不同的模塊，每個模塊用不同的顏色表示(圖1B)。不同模塊中基因組的統(tǒng)計分析通過Z-summary進行評估，其中模塊的Z-summary>0表示該模塊在乳腺癌細胞中高表達(圖1C)。每個基因塊都由PLotMA映射，并分別在12個模塊中選擇特定的中心基因(圖1D)。結(jié)合其他文獻，初步篩選出棕色模塊中的EGFR基因。此外，使用基于STRING數(shù)據(jù)庫的Cytoscape有助于建立棕色模塊中所有基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡，最終確定EGFR的核心位置(圖1E)。

應用qRT-PCR檢測miR-141和EGFR在乳腺癌組織或細胞中的表達，結(jié)果表明, miR-141在癌組織中表達降低，而EGFR在癌組織中的表達水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); miR-141在3種乳腺癌細胞系(MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435 )中的表達低于正常乳腺細胞系(Hs 578Bst), 而EGFR在3種乳腺癌細胞系(MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435)中表達均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

A: 倍數(shù)變化>2的前20個基因組差異表達的熱圖,紅色代表上調(diào),綠色代表下調(diào); B: 基于相異性測量聚類的所有差異表達基因的樹狀圖; C: 基于相異性度量聚類的所有差異表達基因的氣泡圖; D: 12個模塊中模塊特征基因的散點圖; E: 棕色模塊中基因的PPI網(wǎng)絡,每個節(jié)點的顏色強度與加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡中的連接程度呈正比,紅色為正相關(guān),綠色為負相關(guān)。圖1 乳腺癌中EGFR的表達情況

2.2 miR-141與EGFR的靶向關(guān)系驗證

本研究通過HMDD數(shù)據(jù)庫找出了578個與乳腺癌相關(guān)的miRNA, 共篩選出34個靶向EGFR的上游miRNA。韋恩圖顯示有20個重疊的miRNA, 最終選擇了miR-141作為上游miRNA進行研究(圖3A)。雙熒光素酶報告基因檢測表明，轉(zhuǎn)染miR-141模擬物后, EGFR-WT 組的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05), 含有相同片段突變序列的EGFR-MUT組的熒光素酶活性在轉(zhuǎn)染后幾乎保持不變(圖3B)。結(jié)果表明,EGFR是miR-141的靶基因。本研究進一步驗證了miR-141過表達及抑制模型的構(gòu)建情況，結(jié)果提示miR-141模擬物顯著增高了miR-141的表達(P<0.05), 而miR-141抑制劑則顯著抑制了miR-141的表達(圖3C)。進一步檢測發(fā)現(xiàn), miR-141過表達能夠顯著抑制EGFR的表達(P<0.05), 而miR-141受抑制則能夠顯著增高EGFR的表達(圖3D)。

2.3 miR-141和EGFR在調(diào)控細胞遷移、增殖及EMT進程中的作用

本研究同時構(gòu)建了miR-141和EGFR的干預模型,EGFRmRNA檢測結(jié)果顯示, miR-141模擬物組EGFR表達水平降低, miR-141抑制劑組EGFR升高，但miR-141模擬物+EGFR組的EGFR表達上調(diào)被逆轉(zhuǎn)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 蛋白質(zhì)表達檢測中也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果。上述結(jié)果表明miR-141靶向EGFR, 并且EGFR在乳腺癌中的表達受到miR-141的調(diào)節(jié)。見圖4。

Transwell實驗結(jié)果顯示, miR-141過表達能夠顯著降低細胞遷移能力，但miR-141抑制劑和EGFR過表達則能顯著增強細胞遷移能力(P<0.05); 此外, miR-141模擬物+EGFR組細胞遷移數(shù)與空白組無顯著差異(P>0.05)。細胞增殖能力檢測顯示，與空白組相比, EGFR組和miR-141抑制劑組的增殖能力增強，而miR-141過表達組的增殖能力下降。此外，模擬物+EGFR組中miR-141和EGFR的共同過表達顯著減輕了EGFR誘導的增殖能力增強的現(xiàn)象(P<0.05), 這一結(jié)果在BrdU免疫熒光檢測中同樣得到了證實。見圖5。此外，蛋白質(zhì)印跡分析顯示，在miR-141過表達細胞中, E-cadherin表達顯著增加而Vimentin表達減少。相反，在EGFR 過表達細胞和miR-141抑制細胞中則觀察到E-cadherin表達顯著降低和Vimentin表達顯著增加。EGFR過表達能夠顯著逆轉(zhuǎn)miR-141抑制的EMT進程(P<0.05), 見圖6。

A: 在2種人乳腺癌細胞系中調(diào)節(jié)miR-141或EGFR表達后,通過qRT-PCR檢測EGFR的表達; B: 在2種人乳腺癌細胞系中調(diào)節(jié)miR-141或EGFR表達后,通過蛋白質(zhì)印跡法檢測EGFR蛋白的表達。圖4 EGFR在乳腺癌細胞中受miR-141調(diào)控

A、B: 通過Transwell實驗檢測miR-141或EGFR表達調(diào)控的細胞的遷移能力; C、D: 通過CCK-8法檢測在0、24、48、72 h調(diào)節(jié)miR-141或EGFR表達后MDA-MB-231和MDA-MB-435細胞的增殖情況; E、F: 通過BrdU法檢測在72 h時miR-141或EGFR表達后MDA-MB-231和MDA-MB-435細胞的增殖情況。圖5 miR-141的下調(diào)或EGFR的上調(diào)可促進細胞遷移和細胞增殖

2.4 miR-141對裸鼠體內(nèi)成瘤的調(diào)控作用

生長曲線顯示, miR-141模擬物組腫瘤的體積顯著小于空白組(P<0.001); miR-141模擬物組腫瘤質(zhì)量顯著小于空白組(P<0.05); qRT-PCR結(jié)果顯示, miR-141過表達后, EGFR表達顯著下降(P<0.05), 而抑制miR-144的表達后EGFR顯著上升(P<0.05); 免疫組化檢測發(fā)現(xiàn), miR-141模擬物組的陽性細胞率顯著低于空白組(P<0.05), 說明miR-141對腫瘤有抑制作用。見圖7。

3 討 論

EGFR表達的改變與許多惡性腫瘤的發(fā)病機制和預后密切相關(guān)[13]。在乳腺癌患者中，經(jīng)常觀察到EGFR基因表達升高。有研究[14]鑒定并驗證了3種miRNA(miR-124、miR-147和miR-193a-3p)作為腫瘤抑制因子通過靶向EGFR調(diào)控細胞周期并抑制乳腺癌的進程。高EGFR表達是三陰性乳腺癌的獨立預后因素，而本研究發(fā)現(xiàn)EGFR表達在乳腺癌組織和細胞中上調(diào)并促進乳腺癌增殖和EMT進程。

近年來，已在多種人類癌癥中觀察到miRNA的異常表達。研究[15-16]表明, miR-141通過直接靶向乳腺癌基因來影響EMT、癌細胞遷移、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。研究[17]報道, SerpinB2促進了miR-200c/141簇的過表達并誘導了乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移。研究[18]顯示miR-141在乳腺癌中受FOXP3-KAT2B軸調(diào)控，并與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。其中轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者血漿中miR-141和miR-200c的表達水平高于非轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者。本研究提出miR-141作為一種抗癌基因，靶向EGFR并且miR-141的過表達可以抑制乳腺癌中的細胞遷移和增殖。本研究通過生物信息學分析篩選并驗證在乳腺癌細胞和組織中EGFR表達上調(diào)，并結(jié)合HDMM數(shù)據(jù)庫、Targetscan和miranda網(wǎng)站聯(lián)合分析并選擇miR-141作為EFGR的上游調(diào)控分子進行驗證。本研究進一步通過qRT-PCR證實了miR-141在乳腺癌組織和細胞中低表達。雙熒光素酶報告基因檢測進一步驗證了miR-141和EGFR之間的靶向關(guān)系。Transwell檢測和CCK-8檢測表明miR-141的下調(diào)或EGFR的上調(diào)可促進細胞遷移和細胞增殖，而miR-141過表達抑制細胞遷移和細胞增殖。此外，蛋白質(zhì)印跡分析表明EGFR過表達或miR-141抑制可以促進EMT的進程。

綜上所述，本研究有助于理解miR-141通過靶向EGFR介導乳腺癌的進展。EGFR和miR-141表達都可能作為未來預后的預測因素，而miR-141/EGFR軸可能是乳腺癌靶向治療的潛在靶點。