基于Th17/Treg免疫平衡觀察清熱化濕調(diào)樞方對潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠的預(yù)防作用*

王欣，張濤，李敏，邱潤苓，蘇曉蘭，魏瑋

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥信息研究所，北京 100700）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性、遷延性、炎癥性腸病。近年來UC發(fā)病率顯著增加，UC成為全球性疾病，已經(jīng)受到世界各國醫(yī)療工作者的關(guān)注[1]。UC治療缺乏特異性，病程遷延反復(fù)，治愈難度大，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[2]。西醫(yī)指南和共識中涉及的藥物取得了一定的臨床療效，但仍不能滿足目前治療的需求。中醫(yī)藥治療UC從整體觀念出發(fā)，針對患者不同的體質(zhì)及UC病情發(fā)展不同時期制定相應(yīng)的個體化干預(yù)措施，可以緩解患者的臨床癥狀，提高其生活質(zhì)量，尤其在誘導(dǎo)緩解、預(yù)防復(fù)發(fā)等方面具有明顯的優(yōu)勢[3]。在臨床取得良好療效的前提下，深入探討中醫(yī)藥治療UC的效應(yīng)機制顯得極為迫切。目前UC發(fā)病機制可能是環(huán)境、遺傳、微生物等多種因素共同作用，誘發(fā)腸道局部炎癥。在諸多發(fā)病因素當中，免疫調(diào)節(jié)異常占據(jù)重要地位[4]。

魏瑋教授在傳承國醫(yī)大師路志正先生“重脾胃、調(diào)臟腑”學(xué)術(shù)思想的基礎(chǔ)上，立足于UC活動期“濕熱蘊腸，氣血不調(diào)”的核心病機，結(jié)合大量臨床實踐經(jīng)驗總結(jié)和現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，提出“清熱、化濕、調(diào)樞”理論。既往臨床研究發(fā)現(xiàn)，路志正經(jīng)驗方烏梅敗醬方能夠較好地緩解UC患者臨床癥狀、改善生存質(zhì)量，臨床有效率為85.0%～91.5%[5-6]。根據(jù)烏梅敗醬方化裁而成的清熱化濕調(diào)樞方經(jīng)過多年臨床實踐取得了較好的臨床療效，但其干預(yù)機制尚未闡明。故本研究采用葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)法建立UC小鼠模型，以免疫平衡角度作為切入點闡釋清熱化濕調(diào)樞方治療UC的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8周齡C57BL/6雄性小鼠60只，體質(zhì)量（20±2）g，購于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2015-0015。小鼠飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所（IAM CACMS）清潔級動物房，12 h光照、12 h黑暗循環(huán)，溫度（24±2）℃，相對濕度35%～45%。實驗動物的所有操作均嚴格遵守中國中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所動物研究委員會指南，并經(jīng)機構(gòu)動物護理和使用委員會批準（批準號：D2021-03-16-2）。所有手術(shù)均在麻醉狀態(tài)下（10%烏拉坦腹腔注射）進行，以盡量減少痛苦。

1.2 藥物與試劑 清熱化濕調(diào)樞方，方藥組成：烏梅15 g，敗醬草12 g，黃連6 g，木香9 g（后下），當歸10 g，炒白芍12 g，炒枳實10 g，太子參15 g，炒白術(shù)15 g，茯苓15 g，葛根12 g，炙甘草6 g。上述藥物采用中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院中藥顆粒藥房提供的中藥免煎劑。美沙拉嗪腸溶片（批準文號：H20171358）購于Losan Pharma GmbH；葡聚糖硫酸鈉（DSS，43 kDa）（批號：160110）購于美國MP Biomedicals公司；便潛血（OB）試劑（批號：B210601）購于珠海貝索生物技術(shù)有限公司；APC antimouse IL-17A（批號：506916）、Alexa Flour 488 anti-mouse/rat/huaman FOXP3（批號：320012）均購于Biolegend公司。

1.3 主要儀器ML4002/02型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；SL202N型電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；JT-A20型凈水開水器（上海宏溪實業(yè)有限公司）；U-TvO.5xC.24H01726型電子顯微鏡、AHB-2-LB型萬能照相機（日本奧林巴斯公司）；Eq150H型脫水機、H1122Q型烤片機、RM2255型切片機（徠卡公司）；Multiskan FC型酶標儀（賽默飛世爾科技）；42592型96孔酶標板（康寧公司）；TDZ4-WS型低速臺式離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1.4 造模與分組60只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，根據(jù)小鼠體質(zhì)量使用Excel中的Rand函數(shù)隨機分為正常組、模型組、清熱化濕調(diào)樞方高劑量組、清熱化濕調(diào)樞方中劑量組、清熱化濕調(diào)樞方低劑量組、美沙拉嗪腸溶片組，每組10只。除正常組外，其余各組均參照WIRTZ S等[7]的造模方法進行UC模型復(fù)制，具體操作：將DSS用蒸餾水配制成2.5%的溶液，除正常組外，其余組小鼠自由飲用，正常組小鼠自由飲用蒸餾水，連續(xù)7 d。

1.5 實驗給藥 在UC小鼠模型復(fù)制同時給予藥物干預(yù)。給藥濃度計算方法參照《中藥藥理研究方法學(xué)》[8]。按實驗動物與人體表面積比等效劑量換算比率[9]，將人每天劑量折算成小鼠等效劑量作為中劑量。高劑量為2倍中劑量，低劑量為1/2中劑量。造模第1天開始，清熱化濕調(diào)樞方高、中、低劑量組小鼠每天分別灌胃給予清熱化濕調(diào)樞方，0.736、0.368、0.184 g/kg；美沙拉嗪腸溶片組小鼠每天灌胃給予美沙拉嗪腸溶片溶液，0.011 g/kg；正常組和模型組小鼠灌胃給予等體積純凈水，0.5 mL/次，2次/d，連續(xù)7 d。

1.6 觀察指標

1.6.1 一般情況觀察 分別于干預(yù)前和干預(yù)結(jié)束后，觀察小鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤度、活動情況、體質(zhì)量、腹瀉、便血等情況。

1.6.2 疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分[10]以MURANO M等[11]制定的DAI評分標準為基準。觀察各組小鼠體質(zhì)量下降情況、糞便性狀和便血情況，并計算DAI評分。DAI評分=（體質(zhì)量下降分數(shù)+大便性狀分數(shù)+便血分數(shù)）／3。

1.6.3 結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察 干預(yù)結(jié)束后，使用10%的水合氯醛麻醉且處死小鼠，分離小鼠結(jié)腸位置，測量結(jié)腸長度。取結(jié)腸遠端約1 cm處，用10%的中性甲醛將其固定，使用石蠟包埋HE染色及切片。光鏡下觀察切片組織學(xué)變化情況。

1.6.4 流式細胞術(shù)檢測脾臟組織Treg、Th17細胞百分比 剖取完整脾臟，用手術(shù)剪剪碎，冰浴勻漿，轉(zhuǎn)移至70 μm孔徑的Falcon細胞篩網(wǎng)濾過，收集細胞懸液，再加紅細胞裂解液，反應(yīng)停止，離心，棄上清，重復(fù)2次，MACS緩沖液重懸，將細胞懸液通過40 μm孔徑的Falcon細胞篩網(wǎng)，去除細胞團塊，采集過濾后的細胞懸液，經(jīng)流式細胞術(shù)檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以“均數(shù)±標準差”（±s）表示，當滿足正態(tài)分布且方差齊時，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；當不滿足正態(tài)分布或方差不齊時，則采用Kruskal-Wallis H檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠一般情況 干預(yù)前，各組小鼠活潑好動、毛色黑亮、狀態(tài)均正常。干預(yù)結(jié)束后，正常組小鼠狀態(tài)正常；模型組小鼠活動遲緩，精神萎靡，喜蜷縮呈弓背狀；與模型組比較，美沙拉嗪腸溶片組和清熱化濕調(diào)樞方高、中、低劑量組小鼠精神狀態(tài)和活動度均有改善。實驗過程中無小鼠死亡。

2.2 各組小鼠干預(yù)前后體質(zhì)量比較 干預(yù)前，6組小鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)后，與正常組比較，模型組小鼠體質(zhì)量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，美沙拉嗪腸溶片組和清熱化濕調(diào)樞方高、中、低劑量組小鼠體質(zhì)量均明顯升高（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組小鼠干預(yù)前后體質(zhì)量比較 （±s，g）

表1 各組小鼠干預(yù)前后體質(zhì)量比較 （±s，g）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（g/kg）干預(yù)前 干預(yù)后正常組 10 - 23.99±0.98 24.96±0.93模型組 10 - 24.14±1.14 20.18±1.52a美沙拉嗪腸溶片組 10 0.011 24.17±1.83 22.23±2.39a b清熱化濕調(diào)樞方高劑量組10 0.736 24.33±1.25 22.27±2.67a b清熱化濕調(diào)樞方中劑量組10 0.368 23.82±1.31 22.80±1.67a b清熱化濕調(diào)樞方低劑量組10 0.184 24.18±0.99 22.68±1.26a b F 1.744 5.889 P 0.142 0.002

2.3 各組小鼠結(jié)腸長度比較 與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸長度明顯縮短（P＜0.05）；與模型組比較，美沙拉嗪腸溶片組和清熱化濕調(diào)樞方高、中劑量組小鼠結(jié)腸長度均明顯增加（P＜0.05）；清熱化濕調(diào)樞方低劑量組小鼠結(jié)腸長度與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組小鼠結(jié)腸長度比較 （±s，cm）

表2 各組小鼠結(jié)腸長度比較 （±s，cm）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（g/kg）結(jié)腸長度正常組 10 - 7.03±0.06模型組 10 - 4.50±0.87a美沙拉嗪腸溶片組 10 0.011 6.13±0.64b清熱化濕調(diào)樞方高劑量組10 0.736 6.43±0.31b清熱化濕調(diào)樞方中劑量組10 0.368 6.43±0.51b清熱化濕調(diào)樞方低劑量組10 0.184 5.70±0.99 F 8.855 P 0.000

2.4 各組小鼠DAI評分比較 與正常組比較，模型組小鼠DAI評分明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，美沙拉嗪腸溶片組和清熱化濕調(diào)樞方高、中、低劑量組小鼠DAI評分均明顯降低（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組小鼠DAI評分比較 （±s，分）

表3 各組小鼠DAI評分比較 （±s，分）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（g/kg）DAI評分正常組 10 - 0.22±0.67模型組 10 - 4.00±0.13a美沙拉嗪腸溶片組 10 0.011 2.15±0.44a b清熱化濕調(diào)樞方高劑量組10 0.736 2.50±0.59a b清熱化濕調(diào)樞方中劑量組10 0.368 2.19±0.56a b清熱化濕調(diào)樞方低劑量組10 0.184 2.50±0.71a b F 7.146 P 0.029

2.5 各組小鼠脾臟Treg、Th17細胞百分比比較 與正常組比較，模型組小鼠脾臟中Treg細胞百分比明顯減少（P＜0.05），Th17細胞百分比明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，清熱化濕調(diào)樞方高、中、低劑量組和美沙拉嗪腸溶片組小鼠脾臟中Treg細胞百分比明顯增加（P＜0.05），Th17細胞百分比明顯減少（P＜0.05）。與正常組比較，模型組小鼠脾臟中Treg/Th17值明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，清熱化濕調(diào)樞方高、中、低劑量組和美沙拉嗪腸溶片組小鼠脾臟中Treg/Th17值均明顯升高（P＜0.05）。（見表4、圖1～2）

圖1 各組小鼠脾臟組織Treg細胞流式圖

表4 各組小鼠Treg、Th17細胞百分比比較 （±s，%）

表4 各組小鼠Treg、Th17細胞百分比比較 （±s，%）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（g/kg）Treg Th17 Treg/Th17正常組 10 - 5.20±0.16 1.78±1.64 2.92±0.12模型組 10 - 2.16±0.67a 4.01±1.62a 0.54±0.08a美沙拉嗪腸溶片組 10 0.011 4.64±1.21b 2.20±2.56b 2.11±0.07b清熱化濕調(diào)樞方高劑量組10 0.736 4.17±0.49b 2.38±0.62b 1.75±0.11b清熱化濕調(diào)樞方中劑量組10 0.368 4.66±1.20b 2.62±4.33b 1.78±0.09b清熱化濕調(diào)樞方低劑量組10 0.184 4.09±0.99b 2.58±4.25b 1.59±0.10b F 17.062 45.389 9.697 P 0.000 0.000 0.000

2.6 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)情況 正常組小鼠腸黏膜上皮完整，上皮細胞連接緊密，固有層可見完整隱窩結(jié)構(gòu)，有序排列，杯狀細胞分泌旺盛，黏膜下層未見明顯病變；模型組小鼠腸黏膜上皮缺損，而上皮細胞連接疏松，隱窩結(jié)構(gòu)破壞，排列紊亂，杯狀細胞明顯減少，間質(zhì)層可見大量淋巴細胞及中性粒細胞等炎癥細胞浸潤，黏膜下層不同程度充血、水腫；清熱化濕調(diào)樞方高劑量組和美沙拉嗪腸溶片組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)較模型組明顯改善，黏膜缺損情況均得到明顯修復(fù)，上皮細胞連接較緊密，杯狀細胞分泌增多，極少隱窩破壞，炎癥細胞浸潤程度低于模型組；清熱化濕調(diào)樞方中劑量組小鼠部分結(jié)腸黏膜組織中斷，缺損面積小，少量隱窩破壞，黏膜下層可見少量炎癥細胞浸潤、水腫；清熱化濕調(diào)樞方低劑量組小鼠仍見多處結(jié)腸組織黏膜中斷、隱窩破壞、間質(zhì)出現(xiàn)充血、水腫及炎癥細胞浸潤。（見圖3）

圖2 各組小鼠脾臟組織Th17細胞流式圖

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織病理切片圖（HE，×100）

3 討 論

中醫(yī)學(xué)根據(jù)臨床表現(xiàn)將UC歸屬于“腸癖”“腸風(fēng)”“臟毒”等范疇[12-14]。UC中醫(yī)病機可歸納為外感時邪、飲食不節(jié)（潔）、情志內(nèi)傷、素體脾腎不足，基本病理因素包括氣滯、濕熱、血瘀、痰濁。病位在大腸，但與脾（胃）、肝、腎密切相關(guān)，而肺氣失調(diào)，大腸不固亦與UC發(fā)病相關(guān)。濕熱蘊腸為主要病理因素。研究[15]顯示，大腸濕熱證為UC最常見的證型。脾虛肝郁為主要發(fā)病基礎(chǔ)，飲食不調(diào)為主要發(fā)病誘因。魏瑋教授在傳承國醫(yī)大師路志正先生“持中央、運四旁，怡情志、調(diào)升降，顧潤燥、納化?！睂W(xué)術(shù)思想的基礎(chǔ)上，創(chuàng)立清熱化濕調(diào)樞方。方中君藥烏梅收澀止瀉；臣藥敗醬草、黃連清熱化濕，解毒排膿；當歸、白芍養(yǎng)血活血，柔肝止痛；葛根、枳實二味亦為臣藥，調(diào)理中焦氣機，一陰一陽，一升一降，葛根升清陽，枳實降濁陰；佐以木香行氣止痛，恢復(fù)中焦脾升胃降之生理機能；佐藥太子參、炒白術(shù)、茯苓健脾化濕；甘草為使藥，取其調(diào)和之性。諸藥合用，共奏清熱、化濕、健脾、調(diào)樞之功。其中“調(diào)樞”可以看作是調(diào)控疾病及其病理變化過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。全方方小藥專，切中病機，輕清靈動，符合路志正臨證治療脾胃病的主要學(xué)術(shù)思想。

前期研究認為，異常激活的腸黏膜免疫是引發(fā)UC發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的重要因素之一[16]。而T細胞17（helper T cells 17，Th17）)/調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）在免疫調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵作用，二者在分化上相互協(xié)同，在功能上相互拮抗[17]。Th17細胞主要通過合成IL-17等炎癥因子增強靶細胞通透性，導(dǎo)致炎癥細胞募集和活化，最終促進炎癥發(fā)生。大量基礎(chǔ)研究表明，與健康對照組比較，UC患者腸黏膜中Th17細胞數(shù)量及相關(guān)因子（RORγt、IL-17、IL-22、IL-23）的表達水平明顯升高，且與UC疾病活動程度呈正相關(guān)[18-19]。Treg細胞是具有免疫抑制功能的T細胞亞群，在形成外周免疫耐受、維持機體免疫平衡方面具有重要作用。Treg細胞的主要作用是表達Foxp3，通過分泌IL-10等抑炎因子，直接或間接抑制過度激活的免疫應(yīng)答，從而抑制腸道炎癥反應(yīng)[20]。

本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠脾臟中的Treg細胞百分比明顯低于正常組，Th17細胞百分比明顯高于正常組，且二者的比值亦明顯降低，說明模型組小鼠體內(nèi)存在Treg和Th17細胞比例失衡。而美沙拉嗪腸溶片組和清熱化濕調(diào)樞方高、中、低劑量組小鼠Treg/Th17值高于模型組，并接近正常組，說明清熱化濕調(diào)樞方和美沙拉嗪一定程度上糾正了UC模型小鼠Treg和Th17細胞的比例失衡，并且可以明顯改善病理形態(tài)，抑制隱窩破壞及炎癥細胞浸潤。近年來相關(guān)藥理研究表明清熱化濕調(diào)樞方組成藥物所提取的單體及有效成分所具有的抑制UC腸黏膜炎癥反應(yīng)的潛在機制可能與調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡有關(guān)。王小婷等[21]發(fā)現(xiàn)烏梅提取物可通過抑制小鼠小腸推進運動來延緩蓖麻油致腹瀉小鼠的初次腹瀉時間、減少稀便次數(shù)。LIN H H等[22]研究表明，白芍中提取的總苷可通過調(diào)節(jié)相關(guān)細胞因子的產(chǎn)生來緩解UC腸黏膜的損傷，并能降低UC大鼠的Th17相關(guān)細胞因子IL-17和TNF-α水平，增加Treg相關(guān)細胞因子TNF-β、IL-10的水平，抑制Th17細胞的效應(yīng)表型和促進Treg反應(yīng)，從而達到調(diào)節(jié)平衡的作用。白芍與當歸配伍可增強機體免疫力，降低血液黏稠度，促進氧自由基清除[23]?；菀愕萚24]研究證實，黃連有效成分小檗堿的治療作用機制可能與通過抑制Notch通路從而有效修復(fù)UC小鼠受損的結(jié)腸黏膜有關(guān)。王鳳云等[25]發(fā)現(xiàn)，敗醬草總皂苷減少中性粒細胞浸潤達到治療作用的機制與降低UC大鼠結(jié)腸病變黏膜組織的丙二醛（MDA）水平及髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性，升高超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）水平相關(guān)。因此，調(diào)節(jié)免疫平衡、抑制腸黏膜炎癥反應(yīng)亦是清熱化濕調(diào)樞方干預(yù)過程中的靶點。

綜上所述，清熱化濕調(diào)樞方能有效改善DSS誘導(dǎo)的UC小鼠一般情況并恢復(fù)結(jié)腸形態(tài)，降低組織病理學(xué)評分，其作用機制可能與調(diào)節(jié)Treg/Th17免疫失衡狀態(tài)有關(guān)。但中藥復(fù)方治療UC的機制復(fù)雜，清熱化濕調(diào)樞方對Treg/Th17免疫平衡相關(guān)上下游通路細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的影響仍需進一步挖掘和驗證。后續(xù)研究可通過細胞和動物實驗進行多組學(xué)驗證，豐富清熱化濕調(diào)樞方的干預(yù)機制研究，從而提供更有力的證據(jù)闡釋該方對UC的免疫調(diào)節(jié)作用。