基于P38 MAPK信號通路探討扶正利濕抗癌方含藥血清對前列腺癌LNCaP細胞增殖及凋亡的影響

王 鵬,喬澤昀,趙文兵

(1山西省中西醫(yī)結合醫(yī)院·山西 太原 030013；2山西中醫(yī)藥大學·山西 晉中 030619)

扶正利濕抗癌方是本研究團隊針對晚期前列腺癌獨創(chuàng)的中藥組方，在前期研究中發(fā)現(xiàn)，扶正利濕抗癌方含藥血清能夠抑制雄激素非依賴性前列腺癌PC-3細胞增殖并誘導其凋亡，說明其可能對去勢抵抗性前列腺癌患者有效[1]。然而，扶正利濕抗癌方是否對前列腺癌早期患者即雄激素依賴性前列腺癌有效，卻不得而知。為此，本研究通過觀察不同濃度的扶正利濕抗癌方含藥血清對雄激素依賴性前列腺癌LNCaP細胞增殖、凋亡、p38 MAPK信號傳導通路及凋亡相關蛋白表達的影響，探討扶正利濕抗癌方含藥血清對雄激素依賴性前列腺癌的作用及機制。

1 實驗材料

1.1 實驗藥物 紫杉10 g，莪術10 g，白術15 g，龍葵10 g，豬苓30 g，桂枝10 g，以550 mL蒸餾水浸泡30 min，煮沸繼續(xù)煎煮30 min后紗布過濾。將380 mL蒸餾水加入所剩藥渣，再次煎煮20 min后紗布過濾。將前后兩次濾液予以蒸餾，濃縮至50 mL，生藥濃度為1 g/mL。

1.2 實驗動物及細胞 健康SD 雌性大鼠32 只，體質量200～220 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SYXK(京)2006-0024。飼養(yǎng)條件為SPF 級，溫度為21～25 ℃，相對濕度為45%～60%，全部大鼠自由進食、飲水，每日更換飲水瓶1 次，2 日更換墊料1 次。人前列腺癌細胞LNCaP：購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.3 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基：美國Gibco；胎牛血清：美國Gibco；胰酶：美國Hyclone；CCK8試劑盒：日本同仁；細胞凋亡試劑盒：BD Pharmingen；p38 MAPK、p-p38 MAPK、Bax、Bcl-2、Caspase-3、p53、GAPDH抗體：Abcam；羊抗鼠-HRP：Abmart；羊抗兔-HRP：杭州華安生物技術有限公司；蛋白marker：北京全氏金生物技術有限公司。

1.4 主要儀器 240i細胞培養(yǎng)箱：美國Thermo Scientific；超凈工作臺：蘇州凈化SW-CJ-1FD；MK3酶聯(lián)免疫檢測儀：美國Thermo；FACSCalibur流式細胞儀，美國BD；Mini Protean 3 Cell垂直電泳儀，美國Bio-Rad。

2 方法

2.1 扶正利濕抗癌方含藥血清的制備 將大鼠按隨機數字法分為空白組、扶正利濕抗癌方高劑量組、中劑量組及低劑量組，每組8只。依照《實驗動物學》[2]人與動物體表面積換算公式計算給藥劑量，予以灌胃給藥。中藥低劑量組12.5 g/(kg·d)、中劑量組25 g/(kg·d)、高劑量組50 g/(kg·d)，空白組生理鹽水10 mL/(kg·d)；每日1次，連續(xù)灌服10 d。末次給藥后1 h后處死大鼠、采血，室溫靜置30 min，離心(3 000 r/min，15 min,離心半徑15 cm)分離血清，56 ℃滅活30 min。

2.2 細胞培養(yǎng) LNCaP細胞株常規(guī)培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，5%CO2、37 ℃孵箱培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，待細胞長滿采用胰酶消化、傳代。

2.3 觀察指標及檢測方法

2.3.1 CCK-8法檢測LNCaP細胞增殖抑制率 取處于指數生長期的LNCaP細胞，以2 000個/孔接種于96孔板，每孔100μL，每組設3個復孔。24 h 后吸去培養(yǎng)液，加入“2.1”4 組血清培養(yǎng)液100μL，培養(yǎng)24 h后吸去培養(yǎng)液。每孔加CCK-8試劑10μL，5%CO2、37 ℃孵箱培養(yǎng)2 h。在酶標儀上檢測各組細胞在450 nm 處的吸光值(OD 值)，并計算細胞增殖抑制率(IR)：IR=(1-實驗組OD值均數/對照組OD值均數)×100%。

2.3.2 流式細胞儀檢測LNCaP細胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化各分組干預的LNCaP細胞(空白含藥血清以及扶正利濕抗癌方低、中、高劑量含藥血清干預48 h)，于室溫2 000 r/min離心5～10 min，離心半徑15 cm，收集細胞；用預冷1×PBS(4 ℃)重懸細胞1 次，2 000 r/min離心5～10 min，離心半徑15 cm，洗滌細胞2 次，再用1×Binding Buffer緩沖液制成1×106 細胞/mL的懸液；Falcon試管中加入300μL 的1×Binding Buffer 懸浮細胞；Annexin V-FITC標記：加入5μL的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫20 ～25 ℃孵育15 min；上機前5 min再加入5μL的PI染色；上流式細胞儀檢測。細胞凋亡率(AR)=Q2與Q3象限百分比的和。

2.3.3 Western Blot檢測p38 MAPK信號傳導通路及凋亡相關蛋白的表達 取對數生長期的LNCaP細胞，調整細胞濃度為1.0×106個細胞/孔，接種于培養(yǎng)皿培養(yǎng)至完全貼壁，分別給予不同濃度扶正利濕抗癌方含藥血清處理48 h,收集細胞沉淀，用4 ℃預冷的PBS洗滌2次，加入1 mL含PMSF的裂解液，冰上裂解30 min。4 ℃下12 000 r/min×5 min，離心半徑15 cm。將離心后的上清液分裝置于-70 ℃冰箱保存。使用BCA分析測定蛋白質濃度。蛋白質(50 μg)通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，然后轉移到PVDF膜上。加入一抗(1∶1 000)，4 ℃條件下孵育過夜，加入二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h 后，滴加ECL 化學發(fā)光液顯影，暴露于X射線膠片進行可視化。采用美國 BIO-RAD 公司的 Quantity-One 圖像分析軟件分析各樣品目的條帶的灰度值，以GAPDH為內參，計算各蛋白相對表達水平。

3 結果

3.1 扶正利濕抗癌方含藥血清對LNCaP細胞增殖的影響 扶正利濕抗癌方含藥血清可明顯抑制LNCaP細胞的增殖，并隨扶正利濕抗癌方含藥血清濃度增加，對LNCaP細胞的抑制率明顯升高。見圖1。

3.2 扶正利濕抗癌方含藥血清對LNCaP細胞凋亡的影響 不同濃度扶正利濕抗癌方含藥血清均可誘導LNCaP細胞凋亡，呈濃度依賴性，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果見圖2。

3.3 扶正利濕抗癌方含藥血清對LNCaP細胞p38 MAPK信號傳導通路及凋亡相關蛋白表達水平的影響 不同濃度的扶正利濕抗癌方含藥血清作用48 h 后，LNCaP細胞中p-p38 MAPK 水平逐漸增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而p38MAPK 蛋白表達水平則無顯著變化(P>0.05)。見圖3。扶正利濕抗癌方含藥血清以劑量依賴性的方式上調Bax、Caspase-3及p53蛋白的表達，而下調Bcl-2蛋白的表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

前列腺癌是臨床常見的惡性腫瘤，也是西方國家男性癌癥相關死亡的第二大原因。在過去幾十年中，隨著我國飲食結構的改變及人口壽命的大幅增加，前列腺癌在國內的發(fā)病率也在增加[3-4]。中醫(yī)藥是治療腫瘤的主要輔助手段，一方面可以有效地抑制腫瘤生長，另外一方面其副作用相對較小。中醫(yī)認為虛、毒是前列腺癌的主要病機，其次兼有痰濕瘀，故以扶正攻毒為最主要的治則。通過益氣、補血、養(yǎng)陰、溫陽進行扶正，同時采用祛瘀攻毒、化濕解毒等藥物進行攻毒。本研究團隊據此構建扶正利濕抗癌方，經多年臨床觀察，該方由紫杉、白術、莪術、龍葵、豬苓、桂枝等藥材組成，其中紫杉、龍葵消癌散結，豬苓、白術利水化濕，莪術行氣活血、消積止痛，桂枝通陽，全方共奏扶正益氣、清熱利濕、抗癌解毒之功，在臨床上治療前列腺癌患者有較好的療效。

p38 MAPK 是絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase,MAPK)4個亞家族的一員，其可介導胞外信號向細胞核內傳遞，參與細胞增殖、分化、凋亡等過程的調控，在幾種不同類型的腫瘤中作為增殖和凋亡的重要介質而發(fā)揮作用[5-6]。研究表明，細胞凋亡的機制與活性氧(ROS)的產生有關[7]。近期有證據表明，凋亡通過幾種常見的分子相互作用，如p53、Bcl-2家族和PI3K/AKT/mTOR及p38 MAPK信號通路[8]。ROS通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號并誘導MAPK信號介導凋亡的發(fā)生[9-10]。此外，在凋亡過程中，細胞內ROS的產生在PI3K/AKT/mTOR失活和MAPK活化中起著至關重要的作用[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，扶正利濕抗癌方主要成分及其含藥血清可能通過抑制PI3K/AKt 信號通路誘導雄激素非依賴性前列腺癌PC-3細胞的凋亡[1]。

血清藥理學方法模擬了中藥進入體內產生藥理效應的過程，提高了中藥研究結果的可靠性[12]。本研究通過CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)扶正利濕抗癌方含藥血清可抑制雄激素依賴性前列腺癌LNCaP細胞的增殖，且抑制作用具有濃度依賴性。同時，扶正利濕抗癌方含藥血清能夠濃度依賴性的誘導LNCaP細胞的凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)，扶正利濕抗癌方含藥血清可以并下調Bcl-2蛋白表達水平，而上調p-p38MAPK、Bax、caspase-3及p53蛋白表達水平，而對p38 MAPK 蛋白表達水平無影響。分析其機制，扶正利濕抗癌方含藥血清激活LNCaP細胞p38 MAPK信號傳導通路，上調p53蛋白的表達，進一步介導凋亡相關蛋白Bcl-2 的下調和 Bax 的上調，激活caspase 家族級聯(lián)反應，最終導致caspase-3 活化而誘導線粒體途徑凋亡的發(fā)生[13-15]。

綜上所述，扶正利濕抗癌方含藥血清可促進雄激素依賴性前列腺癌LNCaP細胞凋亡，其機制可能與激活p38 MAPK介導的凋亡途徑有關。