丹貝益肺湯對博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化大鼠肺纖維化及肺血管重塑的影響

李 強，楊雅婷，程 娜，金冠男，杜松毫，張碧海，江柏華，蔡蕭君

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·黑龍江 哈爾濱 150036)

特發(fā)性肺纖維化(Idopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種常見的肺部彌漫性炎癥疾病，以漸進性勞力性氣促、限制性通氣功能障礙為主要表現(xiàn)，具有病程進展快、肺功能進行性下降、嚴重可因呼吸衰竭而死亡的特點，是間質(zhì)性肺炎(usual interstitial pneumonia，UIP)最常見、最嚴重的臨床亞型[1]。目前，尼達尼布、吡非尼酮及部分中藥方劑應(yīng)用于臨床輕、中度IPF的治療[2]，而肺移植仍是特發(fā)性肺纖維化患者疾病后期的最終選項；但由于供體有限及其在手術(shù)水平及移植后器官維持治療等方面依舊面臨巨大挑戰(zhàn)[3-4]，迫切需要明確特發(fā)性肺纖維化的形成機制，開發(fā)治療IPF相關(guān)藥物成為臨床及實驗研究熱點。多項研究顯示，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞功能紊亂是有效控制IPF血管重塑、改善低氧的理想手段[5]。

丹貝益肺湯是江柏華教授依據(jù)多年臨床經(jīng)驗總結(jié)出的治療肺纖維化的有效方劑。本實驗通過構(gòu)建BLM誘導(dǎo)肺纖維化大鼠模型，觀察丹貝益肺湯對肺纖維化肺組織病理變化及血清eNOS、ET-1及vWF因子水平的影響，探討丹貝益肺湯對特發(fā)性肺纖維化及肺血管重塑的作用，為該方藥臨床治療IPF提供實驗室依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康SPF級5周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部，合格證號:SCXK(黑)2019-001，在濕度40%～65%、溫度20～26 ℃、清潔級動物房內(nèi)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。動物實驗過程符合3R原則。

1.2 實驗藥物 丹貝益肺湯(丹參、平貝、黨參、黃芪、補骨脂、五味子、川芎、桃仁、地龍、麥冬、桔梗)中藥飲片購自黑龍江省藥材公司，中藥浸膏制備委托黑龍江省祖研北藥科技開發(fā)有限責(zé)任公司加工成為干浸膏,于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆?。臨用時制備成生藥濃度為0.38 g/mL水溶液。甲潑尼龍片(MT)：天津天藥藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20020224。

1.3 實驗試劑 注射用鹽酸博來霉素：瀚暉制藥有限公司；HE染液、Masson 染液：南京建成科技有限公司；大鼠eNOS、ET-1、vWFELISA檢測試劑盒：杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。

1.4 實驗儀器 KW-WH大鼠霧化給藥儀：南京卡爾文生物科技有限公司；3K15低溫高速離心機：Sigma公司；3K15顯微低溫高速離心機：Sigma公司； BX51-cell Sens Entry顯微照相系統(tǒng)：Olympus公司；MULTISKAN GO酶標(biāo)儀：Thermo公司；OmegaLum G化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：Aple-gen公司。

2 實驗方法

2.1 動物造模與分組給藥 120 只SD大鼠采用隨機數(shù)字表法分為正常對照組、模型組、陽性對照組和丹貝益肺湯高、中、低劑量組，每組20只。除正常組外，其余各組大鼠各組用BLM稀釋液(60 g/L)進行霧化吸入造模[6]，每次30 min，每天1 次，連續(xù)霧化吸入7 d；正常對照組霧化吸入等量生理鹽水。成模后模型組給予生理鹽水(15 mL/kg)；陽性組給予MT混懸液(4.2 mg/kg)；高、中、低劑量組分別給予丹貝益肺中藥液15.2、7.6、3.8 g/kg灌胃,每天1 次，連續(xù)灌胃28 d。灌胃給藥期間，模型組死亡3 只，陽性組和丹貝低、中、高劑量組均死亡2 只。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 血清eNOS、ET-1、vWF測定 末次給藥后禁食不禁水12 h，腹主動脈采血，離心取血清，ELISA檢測各組大鼠血清eNOS、ET-1及vWF。

2.2.2 病理觀察 采血后，處死大鼠，取肺組織，4%多聚甲醛溶液中固定，橫切，間隔3 mm，4%多聚甲醛溶液中固定72 h，不同梯度酒精脫水，4 ℃二甲苯溶液透明，浸蠟，55℃恒溫4 h，包埋，5μm切片，分別行HE染色、Masson染色，光鏡觀察。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血清eNOS、ET-1、vWF測定結(jié)果比較 見表1。

表1 各組大鼠血清eNOS、ET-1、vWF水平比較

3.2 各組大鼠病理學(xué)觀察結(jié)果

3.2.1 HE染色結(jié)果 正常對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，沒有明顯形態(tài)學(xué)變化,未見病理變化。模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)不完整，肺泡間隙明顯變寬，肺泡結(jié)構(gòu)部分紊亂、塌陷，同時伴有炎性細胞浸潤,以及纖維細胞及纖維組織增生。甲潑尼龍組病情較正常肺組織肺泡間隙明顯變寬，肺泡結(jié)構(gòu)存在部分紊亂、塌陷，存在少許炎性細胞浸潤,以及部分成纖維細胞及纖維組織增生。丹貝高、中、低劑量組大鼠病理改變較模型組明顯減輕，丹貝高劑量組病理改變與甲潑尼龍組相近。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果(×100)

3.2.2 Masson染色結(jié)果 正常對照組肺組織結(jié)構(gòu)完整，支氣管壁未見明顯增厚，膠原層較為薄弱，部分肺泡區(qū)出現(xiàn)少量淺藍色的膠原纖維。模型組多數(shù)支氣管、血管以及肺泡隔厚度增加，可見大量藍色膠原纖維，肺泡結(jié)構(gòu)顯示不完整。甲潑尼龍組、丹貝益肺高劑量組、中劑量組、低劑量組肺纖維化程度相對較輕，肺間質(zhì)及其周圍的支氣管、血管、肺泡等區(qū)域，膠原藍染部分減少；其中，丹貝益肺高劑量組膠原藍染區(qū)域與甲潑尼龍組相近。

圖2 各組大鼠肺組織Masson 染色結(jié)果(×100)

4 討論

肺間質(zhì)纖維化是由炎癥引起的一種慢性疾病，長期的慢性炎癥可引起肺的血管重塑，疾病加重，臨床治療方法有限[7]。在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中，血管內(nèi)皮細胞功能失調(diào)如ET-1表達增加，引起新生血管異常生成，導(dǎo)致血管重塑的積累，病情進展[8]。

肺間質(zhì)纖維化屬中醫(yī)“肺痿”范疇，江柏華教授認為IPF的病因為先天稟賦不足、久病失養(yǎng)等引起肺氣虧虛,抗邪無力,外邪反復(fù)襲肺，導(dǎo)致肺失宣肅,痰瘀阻肺,久病累及脾、腎，致脾腎虧虛。氣虛血瘀、痰濁內(nèi)阻為IPF的核心病機,并貫穿疾病始終。因此,治療IPF應(yīng)以益氣破瘀化濁,虛實兼治。丹貝益肺湯由丹參、平貝、黨參、黃芪、補骨脂、五味子、川芎、桃仁、地龍、麥冬、桔梗組成。方中丹參味苦，寒，能夠活血止痛涼血，同時有安神除煩的效用，性緩，祛瘀生新不傷正；平貝化痰止咳，滋陰定喘，肺纖維化陰傷肺痿，平貝正宜；丹參、平貝辛開苦降，活血化瘀，祛痰通絡(luò)，共為君藥；黨參、黃芪、補骨脂健脾益氣，補益正氣，正氣足防止外邪侵擾，對于身體虛弱的長期慢性病患者尤其重要，而補骨脂可以納氣平喘；五味子益氣生津，斂肺補腎；川芎、地龍、桃仁活血通絡(luò)；麥冬滋養(yǎng)肺胃之陰。諸藥配伍得當(dāng)，升降有度，益氣活血不傷陰，補益肺腎。

肺組織纖維化大鼠血管內(nèi)皮細胞合成eNOS的功能明顯下降，促進肺纖維化的發(fā)展[9]，本實驗選取eNOS作為評價內(nèi)皮細胞功能和肺纖維化程度的指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中高劑量丹貝益肺湯干預(yù)后的肺纖維化大鼠血清eNOS水平明顯升高。在肺纖維化區(qū)域，由于毛細血管減少，反饋性調(diào)節(jié)促使促血管生成因子如ET-1表達增高，新血管生成并增生肥厚，導(dǎo)致血管重塑，同時隨著疾病進展，血管內(nèi)皮細胞損傷，標(biāo)志性因子vWF表達增加[5]。因此，ET-1和vWF兩者均可作為評估肺纖維化血管內(nèi)皮細胞損傷指標(biāo)。本研究中，博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠模型血清ET-1和vWF水平明顯增高，丹貝益肺湯干預(yù)后，二者明顯下降，尤其是中高劑量組。表明丹貝益肺湯可減輕肺纖維化血管內(nèi)皮細胞損傷，且呈劑量依賴性。

有研究顯示慢性炎癥的反復(fù)刺激可促進肺纖維化血管重塑的發(fā)展[10]。本研究在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型中通過HE染色發(fā)現(xiàn)，肺組織及氣道周圍炎癥細胞浸潤明顯增多，同時Masson染色發(fā)現(xiàn)在炎癥明顯增多的部位，膠原纖維明顯沉積，肺泡腔明顯擴大，肺泡壁增厚，肺組織纖維化程度加重。丹貝益肺湯干預(yù)后，炎癥細胞數(shù)量減少，膠原沉積減輕，尤其是中高劑量組。提示丹貝益肺湯具有減輕肺間質(zhì)纖維化大鼠肺組織炎癥和膠原沉積租用，抑制肺組織血管重構(gòu)。

綜上，丹貝益肺湯可劑量依賴性減輕博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化，抑制肺血管重塑，其他作用機制尚待進一步探討。