響應面法優(yōu)化超聲波輔助提取黑加侖多酚工藝及其抗氧化活性分析

寧志雪，朱立斌，朱 丹 ，牛廣財, ，魏文毅，徐瑞航

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319；

2.黑龍江省農產品加工工程技術研究中心，黑龍江大慶 163319；

3.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江大慶 163319）

黑加侖（Ribes nigrumL.）學名為黑穗醋栗，俗稱黑豆果，是虎耳草科茶藨子屬的一種多年生小灌木漿果植物，成熟果實為紫黑色、酸甜可口，具有耐寒、抗風沙等特點[1-2]。黑加侖果實中的酚類化合物種類繁多，包括酚酸、類黃酮、花青素和原花青素等[3]，具有優(yōu)良的抗菌、抗氧化、抗高血壓和抗腫瘤特性[4-5]，逐漸成為了近年來營養(yǎng)學研究的熱點。從黑加侖果實中提取的酚類化合物，在食品、保健品和醫(yī)藥工業(yè)中具有廣闊的應用前景。

從植物中提取多酚的傳統(tǒng)方法主要包括溶劑萃取、加壓液體萃取、酶提取等[1]。近年來，超聲波輔助提取技術因其高效、相對環(huán)保的特點而日益受到關注[6]，在多酚提取中取得良好效果。例如，王文良[7]采用超聲波輔助乙醇溶劑法對海棠果進行處理并測定其抗氧化性，在乙醇體積分數(shù)44%，超聲時間41 min，液料比26:1、超聲溫度51 ℃的條件下處理海棠果，此時，多酚提取量可達28.26 mg/g，經LSA-900C型大孔樹脂純化后，12 μg/mL的海棠果多酚就可使DPPH自由基清除率達到88.37%。劉皓涵等[8]采用超聲波輔助酶法對歐李果中多酚進行提取，在料液比1:30 g/mL、超聲波功率105 W、酶解溫度50 ℃、酶解時間80 min的條件下處理歐李果實，多酚提取量為42.63 mg/g，其對DPPH、ABTS+和羥自由基清除率的IC50值分別為98.42、49.87和66.92 μg/mL。由此可見，采用超聲波輔助對多酚進行提取，具有時間短、萃取量多、操作簡單的優(yōu)點[9]。目前，尚未見采用超聲輔助乙醇溶劑法對黑加侖中多酚進行提取的研究。本研究以黑加侖果為原料，采用超聲波輔助乙醇溶劑法提取多酚，通過單因素實驗和響應面法優(yōu)化提取工藝，并對其抗氧化活性進行測定，以期為黑加侖多酚的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑加侖果 購于黑龍江省尚志市亞布力北方小漿果種植專業(yè)合作社，挑選成熟度一致、新鮮飽滿、無機械損傷及病蟲害的果實作為實驗原料；沒食子酸美國 Sigma公司；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）、2,2'-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）、水溶性維生素 E（Trolox） Aldrich 化學試劑公司；維生素C標準品（HPLC≥99%） 上海源葉生物科技有限公司；福林酚試劑、無水碳酸鈉、無水乙醇、甲醇、過硫酸鉀、硝酸鈰、濃硫酸、硫酸亞鐵、過氧化氫 均為國產分析純。

HG7701型手持式多功能食物攪拌機 寧波禾高電子科技有限公司；YM-T1000CT多用途恒溫超聲波提取器 上海豫明儀器有限公司；EX324型電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；DK-98-ⅡA型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；L420型臺式低速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；756型紫外可見分光光度計 上海光學儀器一廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑加侖果多酚超聲波輔助提取工藝流程與操作要點 黑加侖果→挑選→清洗→打漿→加乙醇溶劑→超聲波輔助提取→提取液離心→定容→測定→計算黑加侖多酚提取量

操作要點：準確稱取10 g黑加侖果漿于燒杯中，按照設定的料液比加入一定體積的乙醇溶液，覆膜后置于恒溫超聲波提取器中，按照設定的參數(shù)進行提取，然后以4000 r/min的速度對提取液離心15 min，取上清液定容后，進行測定，并計算黑加侖多酚提取量。

1.2.2 單因素實驗 參考代沛珊等[10]的方法并根據(jù)預實驗的結果，設定乙醇體積分數(shù)70%，超聲波功率300 W，提取時間15 min，料液比1:10 g/mL，提取溫度60 ℃為黑加侖果多酚單因素實驗過程中的固定條件，在此基礎上，研究乙醇體積分數(shù)、超聲波功率、提取時間、料液比對黑加侖多酚提取量的影響。

1.2.2.1 乙醇體積分數(shù)對黑加侖多酚提取量的影響以料液比為1:10 g/mL，超聲波功率為300 W，提取溫度為60 ℃，乙醇體積分數(shù)分別為30%、40%、50%、60%、70%的條件下提取15 min，考察乙醇體積分數(shù)對黑加侖多酚提取量的影響。

1.2.2.2 超聲波功率對黑加侖多酚提取量的影響以料液比為1:10 g/mL，乙醇體積分數(shù)為70%，提取溫度為 60 ℃，超聲波功率分別為 200、250、300、350、400 W的條件下提取15 min，考察超聲波功率對黑加侖多酚提取量的影響。

1.2.2.3 提取時間對提取率的影響 以料液比為1:10 g/mL，乙醇體積分數(shù)為70%，超聲波功率為300 W，提取溫度為60 ℃，提取時間分別為5、10、15、20、25 min的條件下提取，考察提取時間對黑加侖多酚提取量的影響。

1.2.2.4 料液比對提取率的影響 以超聲波功率為300 W，提取溫度為60 ℃，乙醇體積分數(shù)為70%，料液比分別為 1:5、1:10、1:15、1:20、1:25 g/mL 的條件下提取15 min，考察料液比對黑加侖多酚提取量的影響。

1.2.3 響應面優(yōu)化黑加侖多酚提取工藝 以乙醇體積分數(shù)（A）、超聲波功率（B）、提取時間（C）、料液比（D）為因素，多酚提取量為響應值，進行響應面分析，因素與水平編碼表見表1。

表1 試驗因素與水平設計編碼Table 1 Codes of experimental factors and levels in Box-Behnken design

1.2.4 多酚標準曲線繪制 采用福林酚法測定多酚含量，以沒食子酸為標準物質，參考洪玲等[11]修改如下：配制濃度為0.20 mg/mL的沒食子酸標準溶液，分別量取0、1、2、3、4、5 mL沒食子酸標準溶液于100 mL容量瓶中，然后添加0.5 mL福林酚試劑，反應5 min，再添加3 mL的7.5%的Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至刻度，搖勻；于20 ℃水浴1 h。用分光光度計在765 nm波長處測吸光度。以沒食子酸濃度（mg/mL）為橫坐標（x），吸光度為縱坐標（y），得標準曲線方程為：y=0.7651x-0.0012，R2=0.9960。

1.2.5 黑加侖多酚提取量的測定 按照1.2.1的提取工藝流程，取1 mL定容后的黑加侖上清液、10 mL蒸餾水、0.5 mL福林酚試劑于100 mL容量瓶中反應5 min，再加3 mL 7.5%的Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至刻度，搖勻。于20 ℃水浴1 h后，在765 nm波長處測吸光度，并按照公式（1）計算多酚含量。

式中：m表示黑加侖多酚提取量，mg/100 g；C表示樣品液總酚濃度，mg/mL；V表示提取液體積，mL；N表示稀釋倍數(shù)；W表示黑加侖果質量，g。

1.2.6 黑加侖多酚抗氧化活性測定

1.2.6.1 DPPH自由基清除率測定 參照Brand-Williams等[12]的方法并做了適當修改，具體操作步驟如下：在甲醇中配制1 mmol/L的DPPH溶液，稀釋至0.1 mmol/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。將溶液的吸光度在517 nm 處調整為 0.650±0.020。然后，將 200 μL 樣品或Trolox標準品與2800 μL DPPH溶液混合，靜置6 min后，在517 nm處測定吸光度。空白溶液中加入等量的DPPH試劑和200 μL甲醇。DPPH自由基清除率計算如下：

式中：A0為對照的吸光度；A1為樣品的吸光度。

1.2.6.2 羥自由基清除率測定 參照范金波等[13]的方法并做了適當修改，具體操作步驟如下：在去離子水中配制0.16 mmol/L的Ce（NO3）3溶液、10 mmol/L的H2SO4溶液、1 mmol/L的FeSO4溶液和0.3 mmol/L的 H2O2溶液，分別取 3、3、2、6 mL上述溶液與2 mL樣品或Trolox標準品定容至25 mL，混均，靜置60 min后，在360 nm處測定吸光度。羥基自由清除率計算如下：

式中：F1為樣品組吸光值；F0為對照組吸光值；F為空白組吸光值。

1.2.6.3 ABTS+自由基清除率測定 參照Re等[14]的方法并做了適當修改，具體操作步驟如下：將7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L K2S2O8混合，并在室溫避光放置12～16 h后使用。用甲醇稀釋ABTS+·溶液，使其在734 nm處吸光度為0.70±0.02。將10～100 μL的樣品或Trolox標準品加入到2.5 mL稀釋后的ABTS+·溶液中，靜置6 min后，測定其在734 nm處的吸光度。

式中：A0為空白組吸光度；A1為樣品組吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗中單因素實驗均重復三次，結果取平均值±標準差，使用Origin 8.6軟件作圖， Design-Expert V8.0.6軟件對響應面試驗進行分析，SPSS 26.0軟件計算清除率為50%時的半數(shù)清除濃度（IC50）。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對黑加侖多酚提取量的影響由圖1可知，黑加侖多酚提取量在乙醇體積分數(shù)30%～50%時呈顯著（P＜0.05）上升趨勢，在50%時達到最大值530.23 mg/100 g，推測黑加侖多酚在50%乙醇的作用下溶解速率最佳，擴散能力最強[15]。多酚提取量在乙醇體積分數(shù)超過50%時呈下降趨勢，這可能是過高的乙醇濃度導致非酚類化合物溶出[16]。另外，乙醇濃度過高會導致極性下降和蛋白質變性[8,17]，而使多酚提取量下降，影響黑加侖多酚的提取。代沛珊等[10]在提取黑果枸杞多酚的實驗也表明，在乙醇體積分數(shù)為50%時，有利于水溶性與非水溶性多酚的溶出。因此，在本實驗中最佳乙醇體積分數(shù)為50%。

圖1 乙醇體積分數(shù)對黑加侖多酚提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on polyphenol extraction from blackcurrant

2.1.2 超聲波功率對黑加侖多酚提取量的影響 超聲波功率對黑加侖果多酚提取量的影響如圖2所示。結果表明，當超聲波功率為300 W時，多酚提取量最高，達到498.86 mg/100 g，當超聲波功率低于300 W時，隨著超聲波功率的增加，多酚提取量也不斷增加。這是因為超聲波產生的空化和振動效應會破壞植物細胞并釋放多酚化合物，還會促進溶劑滲透到植物組織中，從而增加傳質和提取介質的快速飽和[18-19]；而當超聲波功率高于300 W時，多酚提取量隨著超聲波功率的增加而減少，這是因為過高的超聲振幅可能會降解酚類成分，從而對提取多酚產生不利影響[20,21]。Wang等[22]采用超聲波輔助技術對百香果中多酚進行提取時，最佳超聲波功率也為300 W，與本實驗結果相一致。因此，在本實驗中最佳超聲波功率為300 W。

圖2 超聲波功率對黑加侖多酚提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on polyphenol extraction from blackcurrant

2.1.3 提取時間對黑加侖多酚提取量的影響 由圖3可知，在5～20 min范圍內，多酚化合物提取量隨著提取時間的延長不斷增加，20 min時達到最大值528.34 mg/100 g。這可能是因為在超聲波處理的早期階段，提取物和溶劑之間的濃度差異很大[23]，細胞組織被破壞的程度越來越重，多酚類物質的釋放和擴散會逐漸增強。當提取時間大于20 min時，多酚提取量開始下降，這可能是因為提取時間過長時，會產生一些來自細胞的不溶性物質，降低植物細胞內外的傳質速率，阻礙了多酚提取量的增加[24]。另外，長時間提取還會導致多酚化合物分解或氧化，降低提取效率[25]。金瑩等[26]在采用超聲波輔助技術提取蘋果中多酚的最佳提取時間也為20 min，這與本實驗結果一致。因此，在超聲波輔助提取黑加侖多酚時，最佳提取時間為20 min。

圖3 提取時間對黑加侖多酚提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on polyphenol extraction from blackcurrant

2.1.4 料液比對黑加侖多酚提取量的影響 由圖4可知，當料液比從1:5增加到1:10 g/mL時，多酚提取量呈上升趨勢，當料液比為1:10 g/mL時，多酚提取量最高，達到499.70 mg/100 g，這可能是因為料液比的增加提高了溶劑滲透率[27]，同時還可防止介質飽和[28]，增強了多酚的溶出。當料液比大于1:10 g/mL時，多酚提取量呈逐漸下降趨勢，這可能是因為過量的料液比會導致細胞膜的阻滯作用增大、超聲波衰減和溶劑粘度上升以及飽和度下降[29-32]，這都會影響多酚的提取。張家豪等[33]采用超聲波輔助技術對黑果腺肋花楸中多酚進行提取時，其最佳料液比為1:10 g/mL，說明這個料液比對于黑果腺肋花楸和黑加侖等漿果多酚的提取是合適的。因此，在本實驗中最佳料液比為1:10 g/mL。

圖4 料液比對黑加侖多酚提取量的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction amount of polyphenols from blackcurrant

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 模型的建立與分析 以乙醇體積分數(shù)（A）、超聲波功率（B）、提取時間（C）和料液比（D）為試驗因素，多酚提取量 Y（mg/100 g）為評價指標，運用Design-Expert V8.0.6 Box-Behnken進行響應面設計，其試驗設計及結果見表2。

對表2中數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到二次回歸模型如下：

表2 黑加侖多酚提取工藝的響應面試驗設計與結果Table 2 Response surface experiment design and results of polyphenols extraction from blackcurrant

Y=536.95+2.56A-4.67B-5.34C+3.16D-11.77AB-9.05AC+4.19AD-7.51BC+0.11BD+0.34CD-14.83A2-15.96B2-12.39C2-10.47D2

回歸系數(shù)顯著性檢驗結果如表3所示。從表3可知模型P＜0.0001，極顯著，回歸模型的失擬項P=0.3103＞0.05，說明該模型不存在顯著誤差，實驗可靠；模型決定系數(shù)R2值為0.8933，擬合度較高，表明該模型與實驗擬合程度較好，可用于黑加侖果多酚提取過程的分析和優(yōu)化。由F值可知，各因素對多酚提取量的影響大小順序為：提取時間＞超聲波功率＞料液比＞乙醇體積分數(shù)。

表3 回歸模型方差分析結果Table 3 Variance analysis results of regression model

2.2.2 數(shù)學模型及響應面分析 三維曲面圖反映了乙醇體積分數(shù)、超聲波功率、提取時間和料液比這四個因素中兩個獨立變量在其中心點保持不變時，其他兩個因素的相互作用對黑加侖多酚提取量的影響。其曲面坡度越陡峭、等高線形狀越扁平說明各因素之間交互作用越顯著[34]。

由圖5和表3可知，交互項AC、BC對Y影響顯著（P＜0.05），交互項 AB 對 Y 影響極顯著（P＜0.01），其余交互項均不顯著。其中，AB表明乙醇體積分數(shù)和超聲波功率對黑加侖果多酚提取量最為顯著，由圖5a、圖5b可知，隨著乙醇體積分數(shù)和超聲波功率的增加，黑加侖多酚提取量先增加后減少，且乙醇體積分數(shù)曲面的坡度較平滑，說明超聲波功率的影響大于乙醇體積分數(shù)。當乙醇體積分數(shù)為50%，超聲波功率為300 W時，為臨界最佳參數(shù)。圖5c、圖5e分別呈現(xiàn)出提取時間和超聲波功率、乙醇體積分數(shù)之間顯著的交互作用，圖中提取時間曲面較陡，說明提取時間的影響程度大于超聲波功率和乙醇體積分數(shù)。

圖5 各因素交互作用的響應面圖Fig.5 Response surface diagram of interaction of factors

2.2.3 響應面優(yōu)化結果及驗證 以黑加侖多酚提取量的最大化為目標，預測得到的最佳提取條件為：乙醇體積分數(shù)52.65%，超聲波功率290.83 W，提取時間18.73 min，料液比1:11 g/mL，在此提取條件下，回歸方程模型對黑加侖多酚提取量的預測值為538.71 mg/100 g?？紤]實際操作可行性，將提取參數(shù)調整為：乙醇體積分數(shù)50%，超聲波功率300 W，提取時間 20 min，料液比1:10 g/mL，在 60 ℃下進行3次平行試驗，得到黑加侖多酚的實際提取量538.00±5.45 mg/100 g，與預測理論值相差小于5%，表明該回歸模型適用于黑加侖多酚提取工藝參數(shù)的優(yōu)化和分析。

2.3 黑加侖果多酚體外抗氧化活性

由圖6可知，在2～10 mg/mL濃度范圍內，黑加侖多酚對DPPH自由基、羥自由基、ABTS+自由基都具有一定的清除能力。隨著濃度的升高，黑加侖多酚的清除能力隨之增強，當濃度為12 mg/mL時，黑加侖多酚對DPPH自由基、羥自由基、ABTS+自由基的清除率達到最大值，分別為60.87%、62.79%、77.70%，但均低于同質量濃度下VC的清除率。

圖6 黑加侖多酚的體外抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of blackcurrant polyphenols in vitro

由圖6和表4可知，黑加侖多酚對不同自由基的清除能力存在一定差異，清除ABTS+自由基的活性最強，其IC50值為5.26 mg/mL，清除DPPH自由基和羥自由基的活性相對較弱，其IC50值分別為7.97、7.92 mg/mL，這一規(guī)律與扶慶權等[35]對黑加侖多酚抗氧化的研究結果相一致。另外，Laczkó等[36]研究發(fā)現(xiàn)，使用超聲波輔助50%甲醇提取并且經尼龍膜純化后的黑加侖多酚對DPPH自由基清除率的IC50值為1.90 mg/mL，而對ABTS+自由基清除率的IC50值為0.49 mg/mL，這也說明黑加侖多酚對ABTS+自由基的清除能力最強，對DPPH自由基和羥自由基的清除能力次之。這可能是黑加侖多酚通過酚羥基與DPPH自由基的脫氫反應產生半醌自由基的能力相對較弱[37]，以及黑加侖多酚中清除羥自由基的關鍵結構鄰苯二酚基團，尤其是4-羥基的數(shù)量不多有關[38]。雖然上述黑加侖多酚清除DPPH自由基、羥自由基和ABTS+自由基的基本規(guī)律是一致的，但是，它們的IC50值差別很大，這可能是與其多酚的提取參數(shù)以及其純度有關系。由圖6和表4還可以看出，黑加侖果多酚對DPPH自由基、羥自由基和ABTS+自由基的清除能力要低于VC，其對應的IC50值為VC的3.83、2.94和2.55倍。這說明黑加侖多酚雖然具有較好的體外清除自由基能力，但是其抗氧化活性要弱于VC。

表4 黑加侖多酚清除DPPH自由基、羥自由基和ABTS+自由基的IC50值Table 4 IC50 values of scavenging DPPH free radical, hydroxyl free radical and ABTS+ free radical by polyphenols from blackcurrant

3 結論

本實驗通過響應面試驗設計優(yōu)化黑加侖果中多酚的提取工藝參數(shù)為：乙醇體積分數(shù)50%，超聲波功率300 W，料液比1:10 g/mL，提取時間20 min，該條件下黑加侖果多酚提取量為538.00 mg/100 g。黑加侖多酚具有較好的抗氧化活性，當其濃度在2～10 mg/mL時，隨著濃度的增加，它對自由基的清除能力逐漸增強。黑加侖多酚對DPPH自由基、羥自由基和 ABTS+自由基的 IC50值分別為 7.97、7.92和5.26 mg/mL，表明黑加侖果多酚具有較強的抗氧化活性。該研究結果為黑加侖果多酚的提取及其開發(fā)利用提供了理論基礎。