酶促類蛋白反應(yīng)的研究進(jìn)展

李云亮，周安奇，阮思煜，馬海樂(lè)

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

類蛋白是指氨基酸單體或其衍生物通過(guò)酰胺鍵連接形成類似天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的聚氨基酸[1]，可通過(guò)直接熱聚合[2]、氨基酸開(kāi)環(huán)聚合法[3]等方法合成。在食品科學(xué)領(lǐng)域中，類蛋白可通過(guò)酶促類蛋白反應(yīng)（Enzyme catalyzed plastein reactions，ECPC）形成。ECPC具體指在適宜的條件下，將濃縮的蛋白水解物在蛋白酶的作用下形成凝膠狀蛋白類物質(zhì)的過(guò)程，可被認(rèn)為是蛋白質(zhì)水解過(guò)程的逆反應(yīng)。ECPC的反應(yīng)過(guò)程分為三步：a.水解反應(yīng)，用酸或者蛋白酶在合適pH下對(duì)底物蛋白質(zhì)進(jìn)行水解；b.濃縮，利用減壓蒸餾、噴霧干燥等方式將水解后的產(chǎn)物進(jìn)行濃縮；c.合成反應(yīng)，將濃縮物，或者其他原料來(lái)源的氨基酸加入，并用蛋白酶催化反應(yīng)[4-6]。

國(guó)外對(duì)ECPC的研究開(kāi)展的比較早，對(duì)其反應(yīng)機(jī)制、影響條件及應(yīng)用等有很多的報(bào)道[7]。近些年，國(guó)內(nèi)對(duì)于ECPC的研究也越來(lái)越多，該反應(yīng)已經(jīng)被應(yīng)用于大豆蛋白[8]、乳蛋白[9]、魚(yú)酶促類蛋白[10]等改性蛋白生產(chǎn)中，取得了良好效果。ECPC不僅彌補(bǔ)了天然蛋白的氨基酸組成結(jié)構(gòu)缺陷，提高了蛋白質(zhì)功能性，還改善了蛋白水解物的風(fēng)味，為食品行業(yè)提供了新的蛋白質(zhì)來(lái)源。

鑒于ECPC的營(yíng)養(yǎng)性、功能性和安全性等優(yōu)點(diǎn)所體現(xiàn)出來(lái)的廣闊前景，本文主要概述了ECPC發(fā)生的機(jī)理，討論了影響反應(yīng)的主要因素和反應(yīng)產(chǎn)物的特性，并總結(jié)了該反應(yīng)的部分用途，為更好地了解和利用該反應(yīng)提供理論依據(jù)。

1 ECPC反應(yīng)機(jī)理

ECPC作為蛋白酶解反應(yīng)的逆反應(yīng)，有關(guān)其主導(dǎo)機(jī)制一直存在很大爭(zhēng)議，目前主流的ECPC反應(yīng)機(jī)制包括：物理聚合作用、縮合反應(yīng)和轉(zhuǎn)肽作用，其中縮合反應(yīng)和轉(zhuǎn)肽作用涉及到新肽鍵的生成，即蛋白質(zhì)水解物通過(guò)類蛋白反應(yīng)能生成原料蛋白質(zhì)中沒(méi)有的新肽段，具有很大研究?jī)r(jià)值。

物理聚合作用：1976年，Michiko等[11]提出，疏水基之間相互作用是ECPC發(fā)生的主要原因。上世紀(jì)90年代初，Andrews等[12]使用衍生自酪蛋白的肽作為底物，研究了類蛋白合成反應(yīng)的各個(gè)方面，證明該反應(yīng)是一個(gè)純粹的熵驅(qū)動(dòng)的物理聚集過(guò)程，物理鍵的疏水作用是整個(gè)酶促反應(yīng)的關(guān)鍵步驟。曲玲玲[13]用掃描電鏡和原子力顯微鏡觀測(cè)到ECPC過(guò)程中大豆蛋白-酪蛋白復(fù)合物的形貌及尺寸均發(fā)生變化，認(rèn)為疏水相互作用在大豆多肽和酪蛋白非磷酸肽的結(jié)合中起到了至關(guān)重要的作用。梁雪[14]也發(fā)現(xiàn)在ECPC過(guò)程中有疏水相互作用和氫鍵的參與。物理聚合作用主要涉及蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，但是形成的相互作用力比較弱。此外，物理聚合作用導(dǎo)致疏水性增加，從而更易將反應(yīng)產(chǎn)物從反應(yīng)中分離出來(lái)。

縮合和轉(zhuǎn)肽作用：有研究者認(rèn)為，合成類蛋白反應(yīng)是單純的動(dòng)力學(xué)驅(qū)使的蛋白質(zhì)水解反應(yīng)的逆反應(yīng)，通過(guò)酶催化多肽和氨基酸底物再次發(fā)生縮合作用，轉(zhuǎn)化成新的蛋白質(zhì)或分子量較大的聚合肽。這一作用在加入端基封閉氨基酸的試驗(yàn)中得到驗(yàn)證，另外封閉肽的氨基比羧基對(duì)類蛋白的合成影響更大[15]，然而也有研究表明封閉肽的氨基和羧基末端只會(huì)稍微降低類蛋白的產(chǎn)量[9]。這表明，縮合作用在不同類蛋白反應(yīng)中貢獻(xiàn)不一樣，也可能還有其他機(jī)制[16]。彭新顏等[7]認(rèn)為ECPC實(shí)際上就是一種轉(zhuǎn)肽過(guò)程，肽鍵斷裂和形成的過(guò)程導(dǎo)致氨基酸殘基重排。在類蛋白反應(yīng)過(guò)程中，肽分子通過(guò)轉(zhuǎn)肽的作用，將疏水性氨基酸轉(zhuǎn)化為疏水性多肽，并逐漸形成不溶于水的類蛋白產(chǎn)物[14]。趙謀明[6]認(rèn)為，ECPC僅僅是由濃縮反應(yīng)形成新的肽鍵或轉(zhuǎn)肽作用產(chǎn)生是不恰當(dāng)?shù)?，要證明是哪一種機(jī)制占主導(dǎo)地位需要分析產(chǎn)物的平均分子量是否增加，以及生成的不溶性物質(zhì)是否與分子量的增加有關(guān)?？s合和轉(zhuǎn)肽作用主要涉及的是多肽分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，可通過(guò)分子標(biāo)記來(lái)監(jiān)測(cè)具體是哪種作用在起作用。

ECPC機(jī)制復(fù)雜，同一個(gè)反應(yīng)中多種機(jī)制相互作用，要明確具體哪一種機(jī)制在反應(yīng)中起主要作用仍需進(jìn)一步深入研究。隨著科技的革新和進(jìn)步，核磁共振、質(zhì)譜、高效液相色譜等分析技術(shù)可以進(jìn)一步幫助解析其機(jī)理。

2 影響ECPC條件

影響ECPC的因素很多，如酶的種類、底物濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH等，選擇適宜的反應(yīng)條件、控制水解反應(yīng)將更有利于ECPC的進(jìn)行，部分學(xué)者通過(guò)研究該反應(yīng)總結(jié)出來(lái)的最適反應(yīng)條件如表1所示。

表1 ECPE反應(yīng)條件Table 1 Reaction condition of ECPC

2.1 酶的種類

酶是影響ECPC至關(guān)重要的因素。酶的種類有很多，通常選用內(nèi)切蛋白酶，如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等來(lái)進(jìn)行ECPC，而較少選擇外切蛋白酶[26]，這是因?yàn)楣I(yè)上采用的水解酶通常為內(nèi)切酶。不同類型原料進(jìn)行ECPC所適用的蛋白酶有所不同。Li等[27]在研究堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)豬血紅蛋白和肉蛋白水解物形成類蛋白反應(yīng)的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶比木瓜蛋白酶可以誘導(dǎo)更多的肽經(jīng)過(guò)疏水相互作用聚集。周麗杰[28]通過(guò)對(duì)比胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶催化獲得的類蛋白反應(yīng)產(chǎn)物的性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)木瓜蛋白酶催化得到的修飾產(chǎn)物的血管緊張素轉(zhuǎn)移酶（ACE）抑制率比其他三種蛋白酶要高，達(dá)到70.37%。相同的原料在不同蛋白酶催化下獲得類蛋白產(chǎn)物產(chǎn)率也有所差異，鹿波[29]采用堿性蛋白酶和胰蛋白酶分別催化酪蛋白水解物合成類蛋白，產(chǎn)物產(chǎn)率分別為71.4%和64.37%。ECPC中，水解和合成采用的酶可以一致，也可不同。兩個(gè)過(guò)程都采用一種酶可以有效減少水解作用的影響，這是因?yàn)橐妆凰獾逆I在水解過(guò)程中已經(jīng)被水解斷[6]。

整體看來(lái)，考慮到酶既具有水解蛋白又具有合成蛋白的能力，在進(jìn)行合成反應(yīng)的時(shí)候，則需要盡可能地減少酶的水解作用，這時(shí)就會(huì)選擇改變反應(yīng)條件來(lái)調(diào)整反應(yīng)的進(jìn)行，由于不同蛋白酶的最適反應(yīng)條件有所不同，所以需要針對(duì)不同的反應(yīng)原料和反應(yīng)條件選擇最為恰當(dāng)?shù)牡鞍酌?。比如?dāng)pH為5.0左右時(shí)，胃蛋白酶的水解能力最弱，這時(shí)以胃蛋白酶水解產(chǎn)物為底物，選擇胃蛋白酶催化合成反應(yīng)的產(chǎn)物得率比其他酶要高[6]。目前，也有學(xué)者嘗試采用固定化酶來(lái)催化類蛋白反應(yīng)，取得了較好的合成效果[18]。但是，關(guān)于利用復(fù)合酶制劑來(lái)催化該反應(yīng)的報(bào)道比較少，很大可能是因?yàn)閺?fù)合酶之間會(huì)相互影響，機(jī)制不明確，不利于ECPC的有效控制。

2.2 底物濃度

底物濃度對(duì)整個(gè)ECPC的影響很大，當(dāng)反應(yīng)體系中底物濃度低于7%時(shí)，ECPC進(jìn)程停止，反應(yīng)體系中以水解反應(yīng)為主；當(dāng)?shù)孜餄舛戎饾u增加，反應(yīng)體系逐漸變?yōu)橐院铣煞磻?yīng)為主[30]。王晗欣等[31]的報(bào)道證實(shí)了這一觀點(diǎn)，認(rèn)為當(dāng)?shù)孜餄舛鹊蜁r(shí)，會(huì)發(fā)生蛋白水解作用，導(dǎo)致ECPC產(chǎn)率下降；但是當(dāng)?shù)孜餄舛冗^(guò)高時(shí)，混合物粘性增加，阻礙了酶的催化作用，也會(huì)影響ECPC的進(jìn)行。徐薇等[22]在研究底物濃度對(duì)酪蛋白水解物ECPC的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^(guò)40%時(shí)，由于黏度過(guò)大，修飾后樣品的游離氨基變化量減少，因此，該反應(yīng)最適底物濃度應(yīng)在7%～40%之間。相關(guān)研究表明，類蛋白合成時(shí)，底物濃度從11%～43%范圍內(nèi)類蛋白產(chǎn)量呈線性增加[32]。酶的水解和合成能力各有不同，能適應(yīng)的底物濃度范圍也有所差異，也會(huì)影響產(chǎn)物的合成[33]。綜上所述，在較低的底物濃度條件下，酶的水解作用起主導(dǎo)作用，隨著底物濃度的增加，合成作用逐漸加強(qiáng)，當(dāng)?shù)孜餄舛鹊竭_(dá)一定高度的時(shí)候，由于反應(yīng)體系粘度增加，酶的運(yùn)動(dòng)被限制，其催化作用也被減弱。

2.3 反應(yīng)溫度

反應(yīng)體系溫度直接影響著蛋白酶的活性，是影響ECPC速率的關(guān)鍵因素。隨著溫度的升高，蛋白酶活性先增加后減少，ECPC產(chǎn)率也呈現(xiàn)先加快后減慢的趨勢(shì)。當(dāng)溫度較低時(shí)，蛋白酶的活性受到抑制；但是溫度升高到一定程度時(shí)，蛋白酶將變性失活，同樣不利于ECPC的進(jìn)行[34]。朱曉杰等[35]在研究溫度對(duì)海地瓜蛋白酶解物ECPC的影響時(shí)得出相同的結(jié)論，發(fā)現(xiàn)在45 ℃時(shí)，游離氨基減少速率最快，而溫度繼續(xù)升高時(shí)，游離氨基減少速率反而降低，說(shuō)明溫度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致蛋白酶失活, 不利于ECPC的進(jìn)行。汪敬科[36]認(rèn)為，ECPC在熱力學(xué)上是一個(gè)放熱反應(yīng)，溫度升高并不能增加反應(yīng)產(chǎn)率，低溫下更有利于平衡向生成肽鍵方向移動(dòng)，但是反應(yīng)溫度過(guò)低又會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速率下降。從總體上來(lái)看，蛋白質(zhì)的水解反應(yīng)和類蛋白的合成反應(yīng)的最佳溫度相差不大，其最佳的反應(yīng)溫度是由反應(yīng)使用的酶的特性來(lái)決定，酶的最適反應(yīng)溫度決定反應(yīng)的最適溫度。目前常用的酶固定化手段和改進(jìn)方法，使酶的最適作用溫度提高[37]或者耐低溫等極端溫度的能力也更強(qiáng)[38]，有效擴(kuò)寬了酶的使用范圍。

2.4 反應(yīng)pH

ECPC的最適pH往往與水解反應(yīng)的最適pH不同，也是影響ECPC的重要因素，如表1所示，根據(jù)水解反應(yīng)的最適pH與合成反應(yīng)的最適pH的差值-ΔpH，可將酶分為 3 類：胃蛋白酶型：ΔpH＞0，即合成最適pH大于水解最適pH；α-糜蛋白酶型：ΔpH＜0，即合成最適pH小于水解最適pH；中性蛋白酶型：ΔpH=0，即合成最適pH等于水解最適pH；而胰蛋白酶在任何pH范圍內(nèi)均不能催化生成類蛋白產(chǎn)物[14]。有學(xué)者提出，每種酶在水解反應(yīng)中都存在最適的pH；而在類蛋白的合成反應(yīng)中卻不存在這個(gè)情況[26]，這可能是因?yàn)楹芏嗟墓央暮偷鞍踪|(zhì)的等電點(diǎn)都在pH 4.0～7.0范圍內(nèi)。總而言之，酶的合成反應(yīng)與水解反應(yīng)最適宜的反應(yīng)pH不同，合成反應(yīng)最適的pH與水解產(chǎn)物的等電點(diǎn)密切相關(guān)。

2.5 其他

伴隨著反應(yīng)的進(jìn)行，蛋白酶逐漸失活，因此，反應(yīng)時(shí)間也是一個(gè)影響ECPC的因素[23]。另外，反應(yīng)體系中的有機(jī)溶劑也對(duì)反應(yīng)有一定程度的影響。在反應(yīng)體系中添加有機(jī)溶劑可以降低底物的粘度，誘導(dǎo)疏水性氨基酸更多地暴露出來(lái)，形成疏水相互作用從而促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行[26]。有研究表明，底物的疏水性和親水性對(duì)反應(yīng)也有影響，認(rèn)為隨著疏水性的增強(qiáng)，反應(yīng)速度越快，但是，疏水性過(guò)高會(huì)對(duì)反應(yīng)起不利作用，因?yàn)榈孜镫y溶于水從而無(wú)法參與反應(yīng)[39]。1974年，Tanizama等[40]通過(guò)研究水含量對(duì)固定化的胰凝乳蛋白酶催化N-苯酰化-L-酪氨酸-β-硝基苯胺水解的影響，認(rèn)為含水量越低越有利于反應(yīng)。除此之外，底物成分也會(huì)影響反應(yīng)的進(jìn)行。以玉米醇溶蛋白水解物合成類蛋白時(shí)，最有效的底物主要成分是四肽、五肽和六肽，平均分子質(zhì)量分別為685和1043 Da的部分是效果最好的基質(zhì)[6]。向反應(yīng)中添加氨基酸酯比單純?cè)黾佑坞x氨基酸量或催化氨基酸衍生物更有利于推動(dòng)反應(yīng)進(jìn)行[39]。綜上所述，ECPC是一個(gè)各種因素共同決定的反應(yīng)，特別ECPC是一個(gè)酶催化的反應(yīng)，影響酶的條件也同樣會(huì)影響反應(yīng)的進(jìn)行。

3 酶促類蛋白反應(yīng)的產(chǎn)物特性

ECPC產(chǎn)物特性與蛋白質(zhì)原料和蛋白質(zhì)的水解物相比有較大差異。Bengt等[41]發(fā)現(xiàn)有些類蛋白反應(yīng)物不溶于水、鹽酸、氫氧化鈉和3～9的pH緩沖溶液中，但是可以完全溶解于50%的乳酸或者檸檬酸溶液中，微溶于50%的乙酸溶液中。此外，Gololobov等[42]在利用α-胰蛋白酶和木瓜蛋白酶催化大豆蛋白水解時(shí)，發(fā)現(xiàn)水解產(chǎn)物不發(fā)生平均分子量的變化，但是，類蛋白反應(yīng)發(fā)生后，氨基酸序列發(fā)生重排。也有研究表明，反應(yīng)過(guò)程中，分子量相對(duì)較小的多肽混合物會(huì)相互作用合成大分子的肽。張雅麗等[8]以大豆蛋白水解物和芝麻蛋白水解物為底物進(jìn)行ECPC，獲得了分子量約為10000 Da的類蛋白產(chǎn)物。孫輝等[43]利用類蛋白反應(yīng)修飾酪蛋白水解物，得到的產(chǎn)物中也存在分子質(zhì)量較大的肽分子。此外，類蛋白反應(yīng)產(chǎn)物同樣可以被動(dòng)物消化吸收。研究表明，當(dāng)色氨酸通過(guò)類蛋白反應(yīng)連接到水解蛋白上后，富含色氨酸的類蛋白反應(yīng)物中色氨酸和游離色氨酸的生物利用率無(wú)顯著差異[33]。姚玉靜等[44]在進(jìn)行大鼠喂食實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)類蛋白反應(yīng)產(chǎn)物的消化吸收率與其他天然蛋白質(zhì)并無(wú)區(qū)別。類蛋白反應(yīng)通過(guò)改變蛋白水解物的多肽序列，可以有目的性地向原料蛋白中導(dǎo)入含硫氨基酸、色氨酸、蛋氨酸等，使產(chǎn)物的氨基酸組成模式更接近聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織推薦的必需氨基酸模式[14]。

4 酶促類蛋白的應(yīng)用

4.1 蛋白質(zhì)水解物的脫苦

蛋白質(zhì)水解物的苦味強(qiáng)度受疏水氨基酸的含量、肽的分子量、水解酶的種類和水解度等多方面的影響[45]。研究表明，蛋白質(zhì)水解后的苦味源于肽中大量疏水性氨基酸的暴露，如苯丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、酪氨酸等[46]。對(duì)于小麥面筋水解物而言，在前2 h內(nèi)，水解反應(yīng)逐漸釋放疏水性氨基酸，苦味增加；隨著反應(yīng)的不斷進(jìn)行，長(zhǎng)鏈的苦味肽含量逐漸減少，苦味下降[47]。此外，當(dāng)疏水性氨基酸位于C、N端時(shí)苦味較低，位于肽鏈非端基位置時(shí)，表現(xiàn)出的苦味最大，以游離形式存在時(shí)苦味最低[48]。蛋白質(zhì)水解得到的苦味物質(zhì)的多肽分子量一般低于6000 Da，500～1000 Da范圍內(nèi)的肽段苦味最強(qiáng)[47-48]。

目前，常用的蛋白質(zhì)水解物脫苦方法包括選擇性分離[49]、包埋掩蓋法[50]、ECPC法[51]和酶法脫苦[52-55]。范巍巍[56]利用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和動(dòng)物蛋白酶酶解鱈魚(yú)骨頭，發(fā)現(xiàn)經(jīng)堿性蛋白酶處理得到的產(chǎn)物風(fēng)味最差，經(jīng)木瓜蛋白酶處理后得到的酶解液苦味值最低。Synowiecki等[57]研究發(fā)現(xiàn)牛紅細(xì)胞的蛋白水解物與谷氨酸進(jìn)行類蛋白反應(yīng)，水解產(chǎn)物的苦味顯著降低。劉小蕾[58]利用共沸異丁醇萃取、類蛋白反應(yīng)和加明膠一起酶解三種方法對(duì)豬骨湯酶解液脫苦，當(dāng)類蛋白反應(yīng)脫苦時(shí)，以風(fēng)味蛋白酶為轉(zhuǎn)肽酶，ECPC進(jìn)行2 h時(shí)，所得酶解液的苦味值最小。侯鈺柯等[16]認(rèn)為蛋白水解物中的疏水性氨基酸殘基可以在類蛋白反應(yīng)中被包埋聚集構(gòu)成“疏水核”，從而減少蛋白質(zhì)水解物的苦味。王朋等[59]利用類蛋白反應(yīng)法和物化法改善蛋白水解液苦味，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，類蛋白反應(yīng)法具有無(wú)添加、無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景更加廣闊。

總體來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)的苦味主要來(lái)源于水解過(guò)程中疏水性氨基酸殘基的暴露，由于在苦味強(qiáng)度上, 內(nèi)切酶效果要強(qiáng)于外切酶效果[59]，而蛋白的水解反應(yīng)更多的采用的是內(nèi)切酶，所以水解過(guò)程中苦味增加更加明顯，因此，蛋白水解物的脫苦就顯得尤為重要。ECPC能促進(jìn)底物之間相互作用，減少了疏水性氨基酸殘基的暴露，在降低蛋白水解物苦味的問(wèn)題上效果顯著。

4.2 制備活性肽，提高蛋白質(zhì)的生物效價(jià)

生物活性肽是一類具有抗氧化、改善睡眠、免疫調(diào)節(jié)、抗菌和降血壓等功能小分子多肽，其制備方法主要有：從自然界生物體中直接提取、采用酶水解或微生物降解得到和通過(guò)化學(xué)方法或重組DNA技術(shù)合成生物活性肽[45]。目前常用方法是通過(guò)蛋白酶水解法來(lái)獲得生物活性肽[60-62]，但是該方法制備的產(chǎn)物的活性受到了原料蛋白的限制，因?yàn)闊o(wú)論是酶水解還是微生物降解，都是利用蛋白酶催化水解反應(yīng)，對(duì)蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)上的酰胺鍵進(jìn)行水解，獲得的肽片段與原料蛋白的氨基酸序列一致，所以無(wú)法進(jìn)一步提高生物活性肽的活性。

ECPC能夠?qū)⑾拗菩园被徇B接到多肽中，可以有效改善肽的生物活性。目前的研究主要集中在利用該反應(yīng)制備ACE抑制肽[63-64]、抗氧化肽[65]和抑菌肽，如表2所示。研究表明，通過(guò)類蛋白反應(yīng)可以添加必需氨基酸或者原料中缺少的某些氨基酸，彌補(bǔ)原料蛋白氨基酸組成不均衡的缺陷，合成具備特定功能的蛋白質(zhì)，達(dá)到改善蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)組成，提高蛋白質(zhì)生物效價(jià)的目的。高丹丹等[25]在利用木瓜蛋白酶對(duì)泥鰍蛋白進(jìn)行類蛋白反應(yīng)修飾，結(jié)果表明：修飾產(chǎn)物的抗氧化活性是修飾前的1.99倍，DPPH自由基清除率為77.98%±0.08%。同年，高丹丹等[66]在對(duì)馬鈴薯蛋白ACE抑制肽的ECPC修飾研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甘氨酸作為外源氨基酸的時(shí)候修飾效果最好。Zhao等[67]兩人發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶催化的類蛋白反應(yīng)不僅能改善大豆蛋白DPPH自由基清除率，還能改善大豆蛋白水解物的抗氧化性能。馬春敏等[20,68]以色氨酸為外源氨基酸，通過(guò)類蛋白反應(yīng)得到乳鐵蛋白水解物（LHS），在研究中發(fā)現(xiàn)色氨酸修飾物對(duì)大腸桿菌的抑菌率較未修飾前提高了45.41%，純化后的色氨酸修飾物對(duì)大腸桿菌的抑菌率較未純化前提高了29.69%，將色氨酸修飾物均勻涂抹在茶腸制品上可以得到保質(zhì)期更長(zhǎng)、亞硝酸鹽含量更低的產(chǎn)品。在對(duì)牡蠣肽的類蛋白反應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)：疏水相互作用是類蛋白反應(yīng)的主要機(jī)理，為開(kāi)發(fā)安全、高效的鋅離子補(bǔ)充劑產(chǎn)品提供了新思路[69-71]。

表2 ECPC制備活性肽Table 2 Preparation of active peptides from ECPC

不僅如此，ECPC還可以增強(qiáng)蛋白水解物的膽汁酸結(jié)合能力[72-73]。鄭玥等[19]在探討醋蛋液水解物的類蛋白反應(yīng)修飾及其對(duì)膽酸結(jié)合能力的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)：ECPC可以提高醋蛋液水解物的膽酸結(jié)合能力和對(duì)蛋白酶抵抗的能力，并且結(jié)合能力最高的修飾產(chǎn)物的結(jié)合能力達(dá)到102.1%。梁雪[14]利用酶法合成類蛋白，與原料蛋白和水解物相比，合成的類蛋白具有更高的膽汁酸結(jié)合能力，類蛋白對(duì)?；悄懰徕c、脫氧膽酸鈉、膽酸鈉的結(jié)合量分別為2.31、2.23和3.05 μmol/100 mg蛋白。溫子健[18]通過(guò)大豆蛋白-乳清蛋白的類蛋白反應(yīng)及其結(jié)合膽汁酸能力的研究，其結(jié)果表明，大豆蛋白-乳清蛋白的類蛋白通過(guò)疏水作用合成，能有效提高水解物膽汁酸結(jié)合能力。由此證明，ECPC可以有效提高活性或者改善產(chǎn)品質(zhì)量。

4.3 改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)

蛋白質(zhì)水解物的功能性質(zhì)主要包括水合性質(zhì)（溶解性、持水性、粘度等）、乳化性和起泡性、凝膠作用和成膜性，通過(guò)ECPC，水解產(chǎn)物在酶的作用下產(chǎn)生交聯(lián)，這些性質(zhì)會(huì)得到改善[79]。馮建國(guó)[17]利用胃蛋白酶催化大豆蛋白和燕麥蛋白進(jìn)行類蛋白反應(yīng)，測(cè)得的類蛋白在不同的pH范圍內(nèi)都具有較強(qiáng)的功能性質(zhì)，尤其是乳化性質(zhì)和起泡性明顯優(yōu)于原料蛋白。Jiang等[80]研究ECPC修飾小球藻ACE抑制肽的機(jī)理，通過(guò)差式掃描量熱法，發(fā)現(xiàn)在類蛋白反應(yīng)修飾后蛋白的熱穩(wěn)定性增強(qiáng)，并且其熱變性溫度從120 ℃增加到134 ℃。此外，以水解明膠和蛋氨酸酯為底物，通過(guò)ECPC接上氨基酸月桂酯，既可以提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還可以提高改性水解蛋白的乳化性和穩(wěn)定性[81]。楊楊等[21]通過(guò)對(duì)大豆蛋白-酪蛋白的類蛋白反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，制備出營(yíng)養(yǎng)組分更完善、成膜性更好的優(yōu)質(zhì)蛋白，為生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)組分豐富、價(jià)格便宜、可降解和可食用的動(dòng)植物蛋白膜提供理論依據(jù)。Willianms等[32]將ECPC應(yīng)用于霉菌蛋白改性，與常見(jiàn)的膠凝產(chǎn)品蛋白質(zhì)不同，以相對(duì)較差的底物合成獲得了不透明、觸變的粘性溶液?？偠灾珽CPC可以選擇較為廉價(jià)的蛋白作為原料，改善其功能性質(zhì)，ECPC產(chǎn)物在廣泛的pH范圍內(nèi)具有適用性，在酸性高蛋白飲料、糖果業(yè)制造等方面有良好的應(yīng)用前景。

4.4 提供新的蛋白質(zhì)來(lái)源

最開(kāi)始，ECPC因?yàn)榭梢岳煤Ｔ?、微生物、葉蛋白等幾乎無(wú)成本原料而受到很多人的關(guān)注，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的研究，該反應(yīng)被應(yīng)用到更廣的范圍。任增超等[10]利用胃蛋白酶對(duì)羅非魚(yú)下腳料進(jìn)行酶解蛋白合成類蛋白，為魚(yú)蛋白改性、開(kāi)發(fā)新的蛋白資源提供了新思路。Sukarno等[82]對(duì)虎蝦消化道中蛋白酶進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)通過(guò)固定化酶進(jìn)行ECPC修飾獲得的產(chǎn)物中，苯丙氨酸含量變得極低，得到的酶促類蛋白產(chǎn)品具有潛在的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可用于各種配方食品、飼料產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)品，也可以用于苯丙氨酸代謝障礙患者的食品。

ECPC還可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)回收，制備具有生物學(xué)功能的新型蛋白質(zhì)。Udenigwe等[83]使用不同蛋白酶水解雞肉蛋白制得的水解物進(jìn)行類蛋白反應(yīng)，對(duì)雞肉蛋白進(jìn)行回收，開(kāi)發(fā)出基于肽的膽汁酸結(jié)合樹(shù)脂，用于調(diào)節(jié)高脂血癥期間的內(nèi)源性脂質(zhì)水平。Li等[84]利用醍魚(yú)內(nèi)源性酶水解和豆粕的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)水溶性蛋白粉，蛋白質(zhì)回收率最高可達(dá)91%，為提高動(dòng)物蛋白利用率提供了方法。Sun等[85]發(fā)現(xiàn)模擬胃腸道（GIT）消化后蛋清蛋白水解物的類蛋白反應(yīng)顯著降低了其免疫球蛋白E（IgE）的結(jié)合活性，該方法可用于生產(chǎn)結(jié)構(gòu)修飾的免疫球蛋白。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

本文通過(guò)了解ECPC反應(yīng)機(jī)理、性質(zhì)和影響因素等方面的內(nèi)容，目的是為了對(duì)ECPC有更深層次的認(rèn)識(shí)，為蛋白質(zhì)的深度利用和高值化提供理論基礎(chǔ)。鑒于ECPC能有效地降低底物的苦味值，在多肽產(chǎn)品的研發(fā)中可以有效起到改善產(chǎn)品品質(zhì)和風(fēng)味的作用，而且ECPC無(wú)毒副作用，且能提高蛋白質(zhì)的效價(jià)，提供新蛋白來(lái)源，后續(xù)可以考慮將該反應(yīng)應(yīng)用于功能性食品的研發(fā)中，彌補(bǔ)天然食品的缺陷，滿足更多人群的營(yíng)養(yǎng)需求。