沉香化氣膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升*

張琳琳，馬臨科，鄭 成△

（1.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 杭州 310052；2.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310052）

沉香化氣膠囊由沉香、木香、廣藿香、香附、砂仁、陳皮、莪術(shù)、六神曲、麥芽、甘草10味中藥材組方，具有疏肝理氣、消積和胃功效，可改善肝胃氣滯、脘腹脹痛、胸膈痞滿、不思飲食、噯氣泛酸等癥狀[1］。有研究表明，沉香化氣膠囊具有改善糖尿病模型大鼠腸動(dòng)力障礙的作用[2］，臨床常用于治療功能性消化不良[3-4］和便秘型腸易激綜合征[5］，并與西藥奧美拉唑聯(lián)用治療非糜爛性反流病[6］?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn) 新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)：第64冊(cè)》WS3-036（Z-009）-2004（Z）-2019[1］，但僅收載了沉香、砂仁的顯微鑒別項(xiàng)、廣藿香的薄層色譜（TLC）鑒別項(xiàng)及陳皮的含量測(cè)定項(xiàng)，缺乏君藥沉香的含量控制項(xiàng)。目前，關(guān)于沉香化氣膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究報(bào)道較少。本研究中在現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，修訂了廣藿香的TLC鑒別，增加了木香和沉香的TLC鑒別，以及建立了測(cè)定沉香中沉香四醇含量的高效液相色譜（HPLC）法，為科學(xué)評(píng)價(jià)沉香化氣膠囊的質(zhì)量提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo U3000RSLC型高效液相色譜儀（美國(guó)賽默飛公司），配有二極管陣列（DAD）檢測(cè)器；Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），配有DAD檢測(cè)器；Shimadzu LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司），配有DAD檢測(cè)器；XPE-205型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為十萬(wàn)分之一）；Milli-Q Advantage A型超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；薄層顯像系統(tǒng)（瑞士卡瑪公司）；薄層層析硅膠G板（青島海洋化工有限公司）；UF55 Plus型電熱恒溫干燥箱（德國(guó)美墨爾特公司）；Elmasonic P型超聲波清洗儀（美國(guó)Elma公司，功率為500 W，頻率為37 kHz）。

1.2 試藥

去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)為111525-201711，純度99.8%），百秋李醇對(duì)照品（批號(hào)為110772-201608，純度99.8%），沉香四醇對(duì)照品（批號(hào)為111980-201602，純度98.3%），沉香對(duì)照藥材（批號(hào)為121222-201102），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；乙腈和甲酸均為色譜純，水為純化水，其余試劑均為分析純；沉香化氣膠囊（杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為1511911，1611991，1611990，1711904，1711906，1711911，1811901，1811917，1911901，1911902）。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

廣藿香：取樣品內(nèi)容物4.5 g，置250 mL圓底燒瓶中，加水100 mL，浸泡過(guò)夜，連接揮發(fā)油測(cè)定器，自測(cè)定器上端加水至刻度，并溢入燒瓶為止，再加入乙酸乙酯1 mL，加熱回流提取3 h，將提取液移至分液漏斗中，分取乙酸乙酯液作為供試品溶液。取百秋李醇對(duì)照品適量，精密稱定，加乙酸乙酯制成每1 mL含2 mg的對(duì)照品溶液。稱取除廣藿香外的其余藥材，制備陰性樣品，取4.5 g，按供試品溶液制備方法制備缺廣藿香的陰性對(duì)照品溶液。按2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 TLC法試驗(yàn)，吸取供試品溶液4～8μL、陰性對(duì)照品溶液5μL、對(duì)照品溶液2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-丙酮（10∶3，V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛-5%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1 A。

木香：取樣品5 g，加水30 mL使溶解，加乙醚30 mL，超聲處理30 min，置分液漏斗中分取乙醚液，揮干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。取去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的對(duì)照品溶液。稱取除木香外的其余藥材，制備陰性樣品，取5 g，按供試品溶液制備方法制備缺木香的陰性對(duì)照品溶液。按2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 TLC法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1，V/V/V）的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1 B。

沉香：取沉香對(duì)照藥材1 g，加乙醚30 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。稱取除沉香外的其余藥材，制備陰性樣品，取5 g，按木香項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備缺沉香的陰性對(duì)照品溶液。按2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 TLC法試驗(yàn)，取木香TLC鑒別項(xiàng)下供試品溶液及上述陰性對(duì)照品溶液和對(duì)照藥材溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮（9∶1，V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛-5%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與沉香對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1 C。

圖1 薄層色譜圖1.Negative reference solution 2-6.Test solution 7-8.Reference solution（patchouli alcohol and dehydrocostus lactone，respectively）9.Solution of reference medicinal materials A.Pogostemonis Herba B.Aucklandiae Radix C.Aquilariae Lignum ResinatumFig.1 TLC chromatograms

2.2 HPLC法測(cè)定沉香四醇含量

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Shim-Pack VP-ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸（15∶85，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：252 nm；進(jìn)樣量：10μL。

2.2.2 溶液制備

取樣品內(nèi)容物適量，混勻，研細(xì)，取1.5 g，精密稱定，加70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理60 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取沉香四醇對(duì)照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成質(zhì)量濃度為40μg/mL的對(duì)照品溶液。取除沉香外的其余9味藥材，制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備缺沉香的陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下3種溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，供試品溶液在沉香四醇對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間處檢出了相應(yīng)的色譜峰，沉香四醇與其他雜質(zhì)峰分離度良好，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，表明方法專屬性良好。

圖2 高效液相色譜圖1.Agarotetrol A.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取沉香四醇對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為38.08μg/mL）1，2，5，10，20，25μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以沉香四醇進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、色譜峰峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=2 486.6X+1.594 9（r=1.000 0，n=6）。結(jié)果表明，沉香四醇進(jìn)樣量在0.038～0.950μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取供試品溶液（批號(hào)為1611991）10μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄沉香四醇的峰面積。結(jié)果的RSD為0.18%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為1611991）適量，精密稱定，共6份，依法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果沉香四醇平均含量為1.673 mg/g，RSD為0.32%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一批（批號(hào)為1611991）樣品適量，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于室溫下放置0，2，7，12，20，24 h時(shí)按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄沉香四醇的峰面積。結(jié)果的RSD為0.56%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為1611991）0.75 g，精密稱定，共6份，分別精密加入沉香四醇對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為0.952 0 mg/mL）1 mL，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

耐用性試驗(yàn)：比較了3種品牌（島津、安捷倫及賽諾菲）高效液相色譜儀、3種品牌[VP-ODS C18柱、Agilent 5TC C18（2）柱及Hypersil GOLD C18柱，規(guī)格均為（250 mm×4.6 mm，5μm）］色譜柱對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果供試品溶液均能較好分離，含量測(cè)定結(jié)果的RSD均小于1.0%，表明方法耐用性良好。

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取10批樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，每批平行測(cè)定2次，計(jì)算樣品中沉香四醇的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=2）Tab.2 Results of the content determination of agarotetrol in samples（n=2）

3 討論

3.1 TLC建立

廣藿香藥材的TLC法為修訂項(xiàng)目，原標(biāo)準(zhǔn)收載于《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn) 新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)：第64冊(cè)》WS3-036（Z-009）-2004（Z）-2004[7］，該標(biāo)準(zhǔn)中直接用石油醚提取，但由于制劑工藝將提取的揮發(fā)油進(jìn)行了包合，石油醚提取不易滲入膠囊包合物中，無(wú)法對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行有效提取，造成TLC中百秋李醇斑點(diǎn)不易檢視，故對(duì)提取方法進(jìn)行了修改，采用揮發(fā)油提取。本研究中對(duì)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了驗(yàn)證，但斑點(diǎn)不夠清晰，故進(jìn)一步改進(jìn)制劑中廣藿香的TLC鑒別。木香TLC鑒別中，以木香對(duì)照藥材、去氫木香內(nèi)酯和木香烴內(nèi)酯對(duì)照品為對(duì)照，結(jié)果制劑中僅檢出去氫木香內(nèi)酯，并經(jīng)HPLC法進(jìn)行了驗(yàn)證，故僅以去氫木香內(nèi)酯為對(duì)照。沉香TLC鑒別中，比較了三氯甲烷-丙酮（9∶1，V/V）和環(huán)己烷-丙酮（10∶3，V/V）2種不同展開(kāi)劑及噴/不噴顯色劑的影響。結(jié)果表明，以三氯甲烷-丙酮（9∶1，V/V）為展開(kāi)劑時(shí)的斑點(diǎn)集中，比移值適中，分離度良好，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，故選擇此展開(kāi)劑；噴以5%香草醛-5%硫酸乙醇溶液較不噴顯色劑主斑點(diǎn)干擾較少，且主斑點(diǎn)清晰，故選擇噴5%香草醛-5%硫酸乙醇溶液后檢視。

此外，本研究中也對(duì)制劑中香附和莪術(shù)的TLC鑒別分別進(jìn)行了探索。其中，以α-香附酮為指標(biāo)對(duì)香附進(jìn)行TLC鑒別，發(fā)現(xiàn)方法的專屬性差，故未增加香附的TLC鑒別。以莪術(shù)對(duì)照藥材和吉馬酮、莪術(shù)二醇對(duì)照品為指標(biāo)，進(jìn)行莪術(shù)的TLC鑒別，結(jié)果沉香化氣膠囊樣品中未檢出莪術(shù)的特征斑點(diǎn)，故未增加莪術(shù)的TLC鑒別。

3.2 含量測(cè)定指標(biāo)成分選擇

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中采用HPLC法，以橙皮苷為指標(biāo)性成分，測(cè)定了方中陳皮的含量，但沉香為沉香化氣膠囊中的君藥，卻無(wú)含量控制項(xiàng)。制劑中沉香以生粉入藥，2020年版《中國(guó)藥典（一部）》中沉香項(xiàng)下規(guī)定沉香四醇為含量測(cè)定指標(biāo)[8］。沉香四醇既是沉香藥材的差異成分，也是其主要活性成分[9-11］，且在沉香藥材中含量較高，穩(wěn)定性較好[12-13］，適合作為沉香質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)性成分。故增加了制劑中沉香四醇的含量測(cè)定項(xiàng)。此外，本研究中也曾采用HPLC法測(cè)定沉香化氣膠囊中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的總含量，結(jié)果樣品中未檢出木香烴內(nèi)酯，檢出去氫木香內(nèi)酯，但峰面積較低，達(dá)不到定量要求，故木香成分的含量測(cè)定未納入標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 樣品提取方法選擇

比較了超聲和回流提取方法對(duì)沉香四醇提取率的影響，結(jié)果這2種提取方法的提取結(jié)果無(wú)顯著差異，超聲提取更簡(jiǎn)便，故選擇超聲提取。比較了不同提取溶劑（乙醇、甲醇、20%甲醇、50%甲醇與70%甲醇），不同提取時(shí)間（30，60，90 min）和不同提取量（25，50，100 mL）對(duì)沉香四醇提取效率的影響，最終確定供試品溶液的制備方法為取樣品約1.5 g，加入50 mL 70%甲醇，超聲處理60 min。

3.4 含量限度制訂

含量測(cè)定結(jié)果顯示，10批樣品中沉香四醇的含量范圍為每粒0.216～1.004 mg，最高值是最低值的4.65倍。李遠(yuǎn)彬等[14］的研究顯示，52批沉香中沉香四醇的含量范圍為0.10%～6.60%。不同產(chǎn)區(qū)沉香中沉香四醇的含量差異也較大[15］。調(diào)研企業(yè)生產(chǎn)投料的10批沉香飲片的沉香四醇含量范圍為0.42%～2.29%。沉香飲片中沉香四醇含量差異較大。沉香以生粉入藥，影響制劑中沉香四醇含量的主要因素是沉香藥材的質(zhì)量。按處方工藝沉香的量折算每粒沉香化氣膠囊中含沉香細(xì)粉0.074 g，2020年版《中國(guó)藥典（一部）》沉香含量測(cè)定項(xiàng)下沉香四醇含量限度為0.10%[8］，每粒膠囊理論最低含量為0.074 mg。結(jié)合10批樣品含量測(cè)定結(jié)果，綜合考慮限度暫定為每粒含沉香以沉香四醇（C17H18O6）計(jì)，不得少于0.15 mg。

3.5 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定可靠、專屬性和重復(fù)性均較好，可用于沉香化氣膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升。