高效液相色譜波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定黃疸茵陳顆粒中8種指標(biāo)性成分的含量

毛淑倩

（中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院，福建 福州 350000）

黃疸茵陳顆粒由茵陳、黃芩、大黃、甘草組方，具有清熱利濕、退黃疸功效，臨床用于治療急、慢性黃疸型傳染性肝炎[1］。方中，茵陳為君藥，具有清熱利濕、利膽退黃等功效，可有效治療黃疸、濕熱型濕疹、膽囊炎及肝內(nèi)膽汁淤積癥等，含有機(jī)酚酸類、香豆素類、黃酮類、揮發(fā)油等成分[2-3］，2020年版《中國(guó)藥典（一部）》以濱蒿內(nèi)酯來(lái)評(píng)價(jià)綿茵陳中綠原酸及花茵陳的質(zhì)量[4］。黃芩為臣藥，清肝膽、祛濕，主要有效成分為黃酮類化合物黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩苷，具有保肝、解毒、解熱、抗炎等藥理作用[5-7］。大黃為佐藥，清濕熱、逐瘀通經(jīng)以退黃疸，其蒽醌類成分大黃酚可抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)及改善肝細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮保肝利膽作用[8-9］。甘草為使藥，性溫，調(diào)和諸藥，主要活性成分為甘草酸銨[10］。黃疸茵陳顆粒收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第四冊(cè)）》，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)[1］，現(xiàn)有文獻(xiàn)僅以該制劑中茵陳、黃芩及大黃的有效成分進(jìn)行定量分析[11-13］。本研究中建立了同時(shí)測(cè)定黃疸茵陳顆粒中綠原酸、濱蒿內(nèi)酯、黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩苷、大黃酚、甘草酸銨8種指標(biāo)性成分含量的高效液相色譜（HPLC）波長(zhǎng)切換法，為有效控制黃疸茵陳顆粒的質(zhì)量提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），配有紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器；BT25S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器＜北京＞有限公司，精度為0.01 mg）；DTA-25型超聲波清洗器（湖北鼎泰高科有限公司，功率為600 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

綠原酸對(duì)照品（批號(hào)為110753-202118，純度為96.1%），濱蒿內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)為111511-202004，純度為99.9%），黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為110715-202122，純度為94.2%），漢黃芩素對(duì)照品（批號(hào)為111514-202006，純度為95.9%），黃芩素對(duì)照品（批號(hào)為111595-201808，純度為97.9%），漢黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為112002-201902，純度為98.5%），大黃酚對(duì)照品（批號(hào)為10796-201922，純度為99.4%），甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)為110731-202119，純度為97.8%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；黃疸茵陳顆粒（福建省泉州羅裳山制藥廠，批號(hào)分別為201001054，201012061，202102029，甘肅岷海制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)分別為20210117，20210305，20210528，蘭州佛慈制藥股份有限公司，批號(hào)分別為190919，191127，201112，規(guī)格均為每袋20 g）；甲醇、甲酸均為色譜純，其他試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[14-16］

色譜柱：Supfex JX C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.12%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～15 min時(shí)16%A，15～44 min時(shí)16%A→58%A，44～60 min時(shí)58%A→70%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～44 min時(shí)325 nm（綠原酸、濱蒿內(nèi)酯、黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩苷），44～50 min時(shí)237 nm（甘草酸銨），50～60 min時(shí)258 nm（大黃酚）；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液制備

分別取綠原酸、濱蒿內(nèi)酯、黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩苷、大黃酚、甘草酸銨對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇適量，超聲（功率為500 W，頻率為40 kHz）使溶解，配制成每1 mL含綠原酸1 208.0μg、黃芩苷975.3μg、濱蒿內(nèi)酯298.6μg、漢黃芩素361.1μg、黃芩素611.4μg、漢黃芩苷370.7μg、甘草酸銨581.9μg、大黃酚566.5μg的混合對(duì)照品溶液。取樣品10袋，研勻，取細(xì)粉2.0 g，精密稱定，置250 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率為500 W，頻率為40 kHz）40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。按處方工藝分別制備缺茵陳、黃芩、大黃、甘草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：分別吸取2.2項(xiàng)下3種溶液各10μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果8種指標(biāo)性成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.52，對(duì)稱因子均小于1.11。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Chlorogenic acid 2.Baicalin 3.Scoparone 4.Wogonin 5.Baicalein 6.Wogonoside 7.Ammonium glycyrrhizinate 8.Chrysophanol A.Mixed reference solution B.Test solution C-F.Negative reference solution（lack of Artemisiae Scopariae Herba，Scutellariae Radix，Rhei Radix et Rhizoma and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma，respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察與檢測(cè)限和定量限確定：分別精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，得系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。分別以信噪比（S/N）為10∶1和3∶1時(shí)混合對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為定量限和檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表1。

精密度試驗(yàn)：精密量取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1.0 mL，置25 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果綠原酸、濱蒿內(nèi)酯、黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩苷、大黃酚、甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.25%，0.99%，0.51%，0.63%，0.44%，0.82%，0.59%，0.72%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為190919）適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0，5，10，15，20，25 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果綠原酸、濱蒿內(nèi)酯、黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩苷、大黃酚、甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.87%，1.09%，0.91%，1.02%，0.84%，0.76%，0.91%，0.59%（n=6），表明供試品溶液25 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為190919）6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。采用外標(biāo)法計(jì)算得綠原酸、濱蒿內(nèi)酯、黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩苷、大黃酚、甘草酸銨的平均含量分別為3.861 0，0.319 7，1.545 0，0.507 2，0.869 3，0.501 5，0.718 6，0.759 1 mg/g，RSD分別為0.79%，0.97%，0.86%，1.04%，1.17%，1.05%，1.25%，0.66%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為190919）1.0 g，精密稱定，共6份，置具塞錐形瓶中，精密加入混合對(duì)照品溶液適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 8種指標(biāo)性成分方法學(xué)考察結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the methodological investigation of eight index components（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取9批樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定3次，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中8種指標(biāo)性成分的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品中8種指標(biāo)性成分含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.2 Results of content determination of eight index components in samples（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

全波段掃描8種活性成分，結(jié)果甘草酸銨在237 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，大黃酚在258 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩苷的最大吸收波長(zhǎng)相似，濱蒿內(nèi)酯于345 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，且出峰時(shí)間接近黃芩苷。2020年版《中國(guó)藥典（一部）》中茵陳含量測(cè)定項(xiàng)下綠原酸的檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm。故采用波長(zhǎng)切換法，最終確定為2.1項(xiàng)下檢測(cè)波長(zhǎng)，在同一信號(hào)的不同時(shí)間段設(shè)置不同的檢測(cè)波長(zhǎng)，使黃疸茵陳顆粒中8種指標(biāo)性成分均可被靈敏、準(zhǔn)確地檢出，并節(jié)省了分析時(shí)間。

3.2 耐用性考察

分別考察了不同體積分?jǐn)?shù)（0.1%，0.12%，0.15%）的甲酸溶液，不同品牌的色譜柱[Supfex JX C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Waters XTERRA MS C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Thermo Hypersil Gold C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）］，不同柱溫（30，35，40℃），不同流速（0.8，1.0，1.1 mL/min）對(duì)黃疸茵陳顆粒中8種指標(biāo)性成分色譜峰分離的影響。結(jié)果各成分均能達(dá)到有效分離，表明方法耐用性良好。且按2.1項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)時(shí)色譜峰分離效果最佳。

3.3 含量測(cè)定結(jié)果分析

考察了3家生產(chǎn)企業(yè)的9批樣品中綠原酸、濱蒿內(nèi)酯、黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩苷、大黃酚、甘草酸銨的含量。由表3可知，不同生產(chǎn)企業(yè)的樣品中各成分含量存在差異，其中濱蒿內(nèi)酯的含量差異最明顯，僅1家生產(chǎn)企業(yè)檢出濱蒿內(nèi)酯，且生產(chǎn)年份為2019年，其他生產(chǎn)企業(yè)均未檢出。原因可能為該生產(chǎn)企業(yè)投料時(shí)選擇了花茵陳。黃疸茵陳顆粒中茵陳占處方總量的49%，茵陳藥材包括綿茵陳和花茵陳，濱蒿內(nèi)酯主要存在于花茵陳，在綿茵陳中含量極微，這與傳統(tǒng)習(xí)慣采用綿茵陳投料一致[17］。

3.4 方法評(píng)價(jià)

所建立的方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可用于同時(shí)測(cè)定黃疸茵陳顆粒中8種指標(biāo)性成分的含量。