喉痛靈制劑中重金屬及有害元素與禁用農(nóng)藥殘留量測(cè)定*

張 美，董文靜，王 榮，張 瑤，楊建興，李 智，吳少濤，馬桂娟，田 雨，王 慶△

（1.寧夏回族自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，寧夏 銀川 750000；2.寧夏回族自治區(qū)食品檢測(cè)研究院，寧夏 銀川 750000；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004）

喉痛靈制劑處方由水牛角濃縮粉、野菊花、荊芥穗、板藍(lán)根或南板藍(lán)根4味藥材組方，具有清熱解毒、消炎、利咽喉功效，用于治療咽喉炎、急性化膿性扁桃體炎、感冒發(fā)熱、上呼吸道炎、疔瘡等[1］。重金屬及有害元素與農(nóng)藥殘留是影響中藥安全性的主要外源性污染物。重金屬及有害元素會(huì)引起不同程度的中毒，農(nóng)藥蓄積會(huì)引起心腦血管疾病、肝病等[2］。農(nóng)藥的慢性危害雖不能直接危及人的生命，但可降低人體免疫力，影響人體健康。本研究中參考重金屬及有害元素[2-11］和農(nóng)藥殘留[2，11-13］的測(cè)定方法，采用電感耦合等離子體-質(zhì)譜（ICP-MS）法測(cè)定喉痛靈制劑中鉛、鎘、砷、銅、鈣元素，采用原子熒光法測(cè)定汞元素（Hg），采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GCMS/MS）法和超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法篩查喉痛靈制劑中的33種禁用農(nóng)藥，為該制劑的安全用藥和質(zhì)量控制提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

7700e型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，Agilent1290型液相色譜儀-Agilent6460型三重四極桿質(zhì)譜儀，均購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；AFS-9750型原子熒光光度計(jì)（北京海光儀器有限公司）；Mettler Toledo XS-205型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為萬(wàn)分之一）；Milli-Q A10 System型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；MARS-6型微波消解儀（美國(guó)CEM公司）；BHW-09C型趕酸儀（美國(guó)Perkin Elmer公司）；TQ8040型氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；BUCHI Rotavapor R-300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琦公司）；SIGMA 3K15型離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；Organomation MULTIVAP型氮吹儀（美國(guó)Organomation公司）；Vortex-genie 2型漩渦混合器（美國(guó)SI公司）。

1.2 試藥

硝酸（優(yōu)級(jí)純，美國(guó)Sigma-Alorich公司）；過(guò)氧化氫（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)為GBW＜E＞080129-14062，質(zhì)量濃度為100μg/mL），鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)為GBW＜E＞080119-15061，質(zhì)量濃度為100μg/mL），砷標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)為GBW＜E＞080117-15022，質(zhì)量濃度為100μg/mL），汞標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)為GBW＜E＞080124-14124，質(zhì)量濃度為100μg/mL），銅標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)為GBW＜E＞080122-18121，質(zhì)量濃度為1 000μg/mL），鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)為GBW＜E＞080118，質(zhì)量濃度為1 000μg/mL），均購(gòu)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；水為超純水。CDAA-M-490360-JA-1 mL 33種農(nóng)藥混標(biāo)（GC-MS/MS組，100 mg/L于乙腈，1 mL），CDAA-M-490361-JA-1 mL 30種農(nóng)藥混標(biāo)（LC-MS/MS組，100 mg/L于乙腈，1 mL），CDAA-S-412134-JD-1 mL三苯基磷酸酯（內(nèi)標(biāo)，1 000 mg/L于乙腈，1 mL），均購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。喉痛靈片、喉痛靈顆粒產(chǎn)品信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 重金屬及有害元素測(cè)定

2.1.1 試驗(yàn)條件

ICP-MS工作參數(shù)由儀器自動(dòng)調(diào)諧設(shè)定，以靈敏度、背景、穩(wěn)定性等各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)儀器參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定了工作參數(shù)。ICP-MS工作參數(shù)：射頻功率為1 550 W；ICP RF功率為1 550 W；載氣流速為1.0 L/min；輔助氣流速為1.0 L/min。ICP-MS調(diào)諧參數(shù)：鋰（Li）為（7±0.1）amu，Max Intensity≥3 000；釔（Y）為（89±0.1）amu，Max Intensity≥1 000；鉈（Ti）為（205±0.1）amu，Max Intensity≥6 000。

原子熒光分光光度計(jì)工作參數(shù)：總燈電流為25 mA；負(fù)高壓為280 V；載氣流速為400 mL/min；屏蔽氣為1 000 mL/min；原子化氣高度為10 mm。

2.1.2 溶液制備

標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密量取鉛、砷、鎘、銅、汞、鈣單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液各適量，用10%硝酸溶液稀釋成質(zhì)量濃度鉛、砷、鎘分別為1，5，10，30，50μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，銅為10，50，100，300，500μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，鈣為0.4，2，4，12，20μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，汞為0.4，0.8，1.2，1.6，2.0μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

供試品溶液：取樣品0.5 g，精密稱定，置50 mL干凈的消解罐中，加入硝酸5 mL、過(guò)氧化氫1 mL，室溫預(yù)消解30 min，置微波消解儀內(nèi)按程序消解。消解完畢，使消解罐自然冷卻至室溫，緩慢擰松消解罐蓋，將消解罐置趕酸儀插孔中，加熱至70℃趕酸30 min，將消解液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用水清洗消解罐及其蓋子5次，將清洗液合并于容量瓶中，用水定容，搖勻，即得。

2.1.3方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.1.2項(xiàng)下系列單一標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按2.1.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、信號(hào)強(qiáng)度或峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 6種重金屬及有害元素線性關(guān)系考察結(jié)果（n=5）Tab.2 Results of the linear relation tests of six heavy metals and harmful elements（n=5）

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)16）0.5 g，精密稱定，共6份，依法制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄信號(hào)強(qiáng)度，并計(jì)算汞、鉛、鎘、砷、銅、鈣含量。結(jié)果的RSD分別為3.52%，3.04%，2.80%，2.72%，2.11%，2.13%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（編號(hào)16）0.5 g，精密稱定，共6份，加入同一質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，依法制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄信號(hào)強(qiáng)度，并計(jì)算回收率。結(jié)果汞、鉛、鎘、砷、銅、鈣的平均回收率分別為86.82%，90.61%，92.64%，95.48%，101.19%，93.67%，RSD分 別 為3.83%，3.22%，3.23%，3.01%，2.51%，2.70%（n=6）。

2.1.4 含量測(cè)定

取樣品0.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄信號(hào)強(qiáng)度，并計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表3至表4。

表3 14批喉痛靈片樣品中6種重金屬及有害元素含量測(cè)定結(jié)果（μg/片）Tab.3 Results of the content determination of six heavy metals and harmful elements in the 14 batches of Houtongling Tablets samples（μg/tablet）

表4 21批喉痛靈顆粒樣品中6種重金屬及有害元素含量測(cè)定結(jié)果（μg/g）Tab.4 Results of the content determination of six heavy metals and harmful elements in the 21 batches of Houtongling Granules samples（μg/g）

2.2 禁用農(nóng)藥殘留測(cè)定

2.2.1 試驗(yàn)條件

GC-MS/MS色譜條件：色譜柱為DB-17（50%苯基）-甲基聚硅氧烷為固定液的彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；進(jìn)樣口溫度為250℃，不分流進(jìn)樣；載氣為高純氦氣（He）；進(jìn)樣口為恒壓模式，柱前壓為146 kPa，流速為1.5 mL/min；進(jìn)樣量為1μL；采用程序升溫，初始溫度為60℃、保持1 min，以30℃/min的速率升至120℃，以10℃/min的速率升至160℃，以2℃/min的速率升至230℃，以15℃/min的速率升至300℃后，保持6 min。質(zhì)譜條件：以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，離子源為電子轟擊（EI）源，離子源溫度為250℃；碰撞氣為氬氣；質(zhì)譜傳輸接口溫度為250℃；質(zhì)譜監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。33種農(nóng)藥中33個(gè)農(nóng)藥組分的離子及電壓監(jiān)測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 GC-MS部分33個(gè)農(nóng)藥組分離子及電壓監(jiān)測(cè)結(jié)果Tab.5 Results of the ion and voltage monitoring of 33 pesticide components by the GC-MS

LC-MS/MS色譜條件：色譜柱為Zorbax SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，1.8μm）；流速為0.3 mL/min；柱溫為40℃；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L甲酸銨），流動(dòng)相B為0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L甲酸銨-乙腈）-乙腈（5∶95，V/V），梯度洗脫（程序見(jiàn)表6）。質(zhì)譜條件：以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，離子源為電噴霧（ESI）離子源，正離子掃描模式，監(jiān)測(cè)模式為MRM。33種農(nóng)藥中30個(gè)組分的離子及電壓監(jiān)測(cè)見(jiàn)表7。

表6 流動(dòng)相梯度洗脫程序（%）Tab.6 Program of gradient elution of mobile phase（%）

表7 LC-MS部分30個(gè)農(nóng)藥組分離子及電壓監(jiān)測(cè)結(jié)果Tab.7 Results of the ion and voltage monitoring of 30 pesticide components by the LC-MS

2.2.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：分別取33種農(nóng)藥混標(biāo)（GC-MS/MS組）100 mg/L和30種農(nóng)藥混標(biāo)（LC-MS/MS組）的混合對(duì)照品，用乙腈稀釋至10μg/mL，即得。

供試品溶液：1）直接提取法。取供試品粉末（過(guò)3號(hào)篩）5 g，精密稱定，加氯化鈉1 g，立即搖勻，再加入乙腈50 mL，勻漿處理（轉(zhuǎn)速12 000 r/min）2 min，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min），取上清液，沉淀，再加乙腈50 mL，勻漿處理1 min，離心，取上清液，合并2次提取的上清液，減壓濃縮至約3～5 mL，放冷，用乙腈稀釋至10.0 mL，搖勻，即得。2）快速樣品處理（QuEChERS）法。取供試品粉末（過(guò)3號(hào)篩）3 g，精密稱定，置50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加1%冰醋酸溶液15 mL，渦旋使藥粉充分浸潤(rùn)，放置30 min，精密加入乙腈15 mL，渦旋使混勻，置振蕩器上劇烈振蕩（轉(zhuǎn)速為500次/分）5 min，加入無(wú)水硫酸鎂與無(wú)水乙酸鈉混合粉末（4∶1，m/m）7.5 g，立即搖勻，再置振蕩器上劇烈振蕩（轉(zhuǎn)速為500次/分）3 min，于冰浴中冷卻10 min，離心（4 000 r/min）5 min，取上清液9 mL，置預(yù)先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管中，渦旋使充分混勻，置振蕩器上劇烈振蕩（轉(zhuǎn)速為500次/分）5 min使凈化完全，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min）5 min，精密吸取上清液5 mL，置氮吹儀上于40℃水浴濃縮至約0.4 mL，加乙腈稀釋至1.0 mL，渦旋混勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

空白基質(zhì)溶液：取空白樣品，分別按不同供試品溶液的制備方法制備空白基質(zhì)溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察與檢測(cè)限確定：分別精密量取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，用已制備的空白基質(zhì)溶液稀釋至質(zhì)量濃度分別為2，5，10，25，50，100，200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。逐級(jí)稀釋以線性關(guān)系考察最低點(diǎn)質(zhì)量濃度為2 ng/mL的對(duì)照品溶液，以各物質(zhì)定量離子對(duì)色譜信號(hào)3倍信噪比（S/N）確定各物質(zhì)方法的檢測(cè)限。結(jié)果見(jiàn)表8和表9。

加樣回收試驗(yàn)：取空白基質(zhì)樣品適量，分別按照2.2.2項(xiàng)下2種供試品處理方法處理空白基質(zhì)，各6份，分別加入同一質(zhì)量濃度（50 ng/mL）的單一對(duì)照品溶液，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表8和表9。

表8 GC-MS部分33個(gè)農(nóng)藥組分回歸方程、檢測(cè)限與回收率Tab.8 Regression equations，limits of detection and recovery rates of 33 pesticide components by the GC-MS

表9 LC-MS部分30個(gè)農(nóng)藥組分回歸方程、檢測(cè)限與回收率Tab.9 Regression equations，limits of detection and recovery rates of 30 pesticide components by the LC-MS

精密度及穩(wěn)定性試驗(yàn)：取加樣回收試驗(yàn)中的任意一份樣品，重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，計(jì)算精密度，結(jié)果的RSD均小于6.50%（n=6）；同時(shí)，分別于第2，3，4，5，6，7天進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算精密度，并考察樣品的穩(wěn)定性，結(jié)果的RSD均小于7.04%（n=6）。表明儀器的精密度和樣品的穩(wěn)定性均良好。

2.2.3 禁用農(nóng)藥殘留量測(cè)定

取35批樣品各適量，分別按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件分別進(jìn)樣測(cè)定，平行3次，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量。結(jié)果35批樣品均未檢出農(nóng)藥殘留，可初步確定喉痛靈制劑農(nóng)藥殘留安全風(fēng)險(xiǎn)較低。

3 討論

3.1 重金屬及有害元素測(cè)定

鉛、鎘、砷、汞、銅是環(huán)境中主要的無(wú)機(jī)污染元素，當(dāng)這些重金屬元素在體內(nèi)蓄積到一定濃度時(shí)，可危害中樞神經(jīng)、血液及各個(gè)器官，導(dǎo)致類阿茲海默癥、帕金森病，甚至有致癌風(fēng)險(xiǎn)[2-11］。依據(jù)2020年版《中國(guó)藥典（四部）》對(duì)重金屬限量的要求，結(jié)合國(guó)家藥典委員會(huì)中藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估專業(yè)委員會(huì)建議，提出植物類中藥材中鉛、鎘、砷、汞、銅一致性限量值分別為5，1，2，0.2，20 mg/kg。參考喉痛靈片國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[1］和喉痛靈顆粒國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[14］，以及文獻(xiàn)[15-18］水煎煮條件下鉛、鎘、砷、汞、銅的轉(zhuǎn)移率分別為14%，14%，35%，24%，15%，以各重金屬元素的限量乘以處方量再乘以轉(zhuǎn)化率，最終得到喉痛靈片鉛、鎘、砷、汞、銅元素的限量分別為每片2.17，0.434，2.17，0.15，9.15μg；喉痛靈顆粒鉛、鎘、砷、汞、銅元素的限量分別為2.17，0.434，2.17，0.15，9.15μg/g。

喉痛靈片中各重金屬及有害元素均在所制定的安全限度范圍內(nèi)，喉痛靈顆粒有1批樣品中汞元素平行樣品所測(cè)含量為0.97μg/g（設(shè)定限量為0.15μg/g）。通過(guò)復(fù)測(cè)，結(jié)果一致。同時(shí)，將該企業(yè)生產(chǎn)的喉痛靈顆粒共3批均進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果另外2批測(cè)定結(jié)果分別為0.73μg/g和0.75μg/g，3批均超過(guò)擬定限量。此外，經(jīng)過(guò)廠家與批次間的比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)廠家與廠家間，同一廠家不同批次間的重金屬元素測(cè)定結(jié)果差異較大，其中江蘇某藥業(yè)有限公司15批樣品砷含量平均為0.21μg/g，銅含量平均為0.72μg/g，汞含量普遍高于其他企業(yè)。處方中投入了水牛角濃縮粉，除鉛、鎘、砷、汞、銅元素外，增加了鈣元素的測(cè)定，各廠家最高與最低之間的含量相差50多倍，可能存在投料問(wèn)題，需進(jìn)一步考察研究。本試驗(yàn)中重金屬元素測(cè)定結(jié)果可為企業(yè)考察原料藥材質(zhì)量、優(yōu)化生產(chǎn)條件、控制外源污染，進(jìn)一步提高產(chǎn)品質(zhì)量提供參考。

3.2 禁用農(nóng)藥殘留測(cè)定

參考2020年版《中國(guó)藥典（四部）》33種禁用農(nóng)藥的測(cè)定方法及文獻(xiàn)[12-13］，優(yōu)化了儀器測(cè)定參數(shù)，并比較了2種供試品的前處理方法，以儀器相應(yīng)較好且受基質(zhì)影響小的測(cè)定數(shù)據(jù)作為最終測(cè)定結(jié)果。經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，喉痛靈制劑處方中野菊花、板藍(lán)根或南板藍(lán)根中會(huì)有33種禁用農(nóng)藥中的部分農(nóng)藥，故對(duì)成方制劑的農(nóng)藥殘留進(jìn)行測(cè)定，以綜合考察處方原藥材中的農(nóng)藥殘留，為中成藥安全用藥及中藥材質(zhì)量控制提供參考。