基于信息熵賦權(quán)法和正交試驗(yàn)優(yōu)選烏頭桂枝湯提取工藝*

盛竹君，楊滿琴，高玉菊，楊曉丹，胡 蝶，徐維平

（1.安徽省針灸醫(yī)院，安徽 合肥 230061；2.安徽省立醫(yī)院，安徽 合肥 230002）

烏頭桂枝湯出自《金匱要略》，由制川烏、桂枝、白芍、炙甘草、生姜和大棗組方。方中，川烏具有祛風(fēng)除濕、鎮(zhèn)痛、抗炎、增強(qiáng)免疫等作用[1-3］；桂枝具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、擴(kuò)血管、調(diào)節(jié)免疫等作用[4-6］；白芍具有抗炎、鎮(zhèn)痛、養(yǎng)血等藥理作用，用于調(diào)節(jié)免疫和治療風(fēng)濕免疫疾病等[7-8］；炙甘草具有止痛、補(bǔ)脾益氣、調(diào)和諸藥等功效[9］。烏頭桂枝湯鎮(zhèn)痛抗炎作用明顯，是治療各種痹癥的代表方劑[10-11］。由于中藥湯劑成分復(fù)雜，有效成分較多，采用單一指標(biāo)評(píng)價(jià)具有片面性。查閱文獻(xiàn)和《中國(guó)藥典》可確定湯劑中多個(gè)有效成分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通常由主觀賦權(quán)法或客觀賦權(quán)法獲得綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)而優(yōu)選中藥湯劑制備工藝。主觀賦權(quán)法是根據(jù)研究者主觀意愿賦予權(quán)重系數(shù)，受主觀意識(shí)影響較大，具有一定局限性；客觀賦權(quán)法是基于矩陣的方法，對(duì)多個(gè)有效指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，計(jì)算出權(quán)重系數(shù)（Wi）。熵起源于熱力學(xué)，是熱能的變化量與溫度的比值，廣泛應(yīng)用于工程技術(shù)及經(jīng)濟(jì)社會(huì)。信息熵（Hi）是信號(hào)集的平均信息量，度量系統(tǒng)的不確定性和無(wú)序性，廣泛用于多指標(biāo)評(píng)價(jià)[12］。本研究中以芍藥苷、桂皮醛、甘草苷、甘草酸單銨鹽、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰烏頭原堿含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用信息熵賦權(quán)法將多項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)轉(zhuǎn)換成單一評(píng)價(jià)指標(biāo)，并利用正交試驗(yàn)優(yōu)選湯劑提取工藝。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），配有2966型二極管陣列檢測(cè)器、Empower3色譜工作站；BSA124S型賽多利斯電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，精度為萬(wàn)分之一）。

1.2 試藥

芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)為AF9030313），桂皮醛對(duì)照品（批號(hào)為20051753），甘草苷對(duì)照品（批號(hào)為AF20071952），甘草酸單銨鹽對(duì)照品（批號(hào)為AF20031131），苯甲酰新烏頭原堿對(duì)照品（批號(hào)為AF8052807），苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品（批號(hào)為AF9112602），苯甲酰烏頭原堿對(duì)照品（批號(hào)為AF20033001），均購(gòu)于成都埃法生物科技有限公司，采用面積歸一化法檢測(cè)的純度均大于98%；乙腈（色譜純，成都市諾爾施科技有限責(zé)任公司）；三乙胺（分析純，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；磷酸（分析純，科隆化學(xué)品有限公司）；水為怡寶純凈水；制川烏（批號(hào)為356391），桂枝（批號(hào)為357151），白芍（批號(hào)為357158），炙甘草（批號(hào)為357359），生姜（批號(hào)為357601），大棗（批號(hào)為356516），均購(gòu)于亳州市滬譙藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate LP-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為磷酸+三乙胺混合溶液（0.5 mL磷酸和0.5 mL三乙胺，pH 6.5），梯度洗脫（0～30 min時(shí)20%A→60%A，30～31 min時(shí)60%A→80%A，31～35 min時(shí)80%A，35～36 min時(shí)80%A→20%A，36～45 min時(shí)20%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm（芍藥苷、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰烏頭原堿），237 nm（甘草苷），290 nm（桂皮醛），254 nm（甘草酸單銨鹽）；柱溫：35℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10μL。

2.1.2 溶液制備

精密稱取芍藥苷13.5 mg，用甲醇溶解定量至25 mL，精密稱取桂皮醛15.5 mg，用甲醇溶解定量至25 mL，精密稱取甘草苷13 mg，用甲醇溶解定量至25 mL；精密稱取甘草酸單銨鹽10.8 mg，用甲醇溶解定量至10 mL；精密稱取苯甲酰新烏頭原堿8 mg，用甲醇溶解定量至200 mL，精密稱取苯甲酰次烏頭原堿9.2 mg，用甲醇溶解定量至200 mL，精密稱取苯甲酰烏頭原堿3.2 mg，用甲醇溶解定量至200 mL，分別配制終質(zhì)量濃度為0.540，0.620，0.520，1.080，0.040，0.046，0.016 mg/mL的對(duì)照品溶液。

精密稱取芍藥苷1.1 mg，桂皮醛1.0 mg，甘草苷0.8 mg，甘草酸單銨鹽1.0 mg，苯甲酰新烏頭原堿0.9 mg，苯甲酰次烏頭原堿0.6 mg和苯甲酰烏頭原堿0.6 mg，用甲醇溶解定量至10 mL，配制成混合對(duì)照品溶液。

取制川烏20 g，桂枝12 g，白芍9 g，炙甘草6 g，生姜9 g，大棗9枚，置圓底燒瓶中，加水浸泡后煎煮，取煎煮液定容至1 000 mL。取樣品5 mL，45℃水浴超聲10 min，混勻，放冷，0.45μm針頭濾器濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取2.1.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液10μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。以待測(cè)成分響應(yīng)值分別為3倍和10倍信噪比（S/N）時(shí)的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限和定量限。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察與檢測(cè)限、定量限確定結(jié)果Tab.1 Results of the linear relation test，LOD and LOQ

2.2 提取工藝優(yōu)化

2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

以藥物浸泡時(shí)間（A）、提取時(shí)間（B）、加水量（C）為影響因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，以芍藥苷、甘草苷、甘草酸單銨鹽、單酯型生物堿、桂皮醛含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，其中單酯型生物堿以苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿的總含量計(jì)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)[13］。因素與水平見表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。

表2 因素與水平Tab.2 Factors and their levels

2.2.2 信息熵賦權(quán)法確定Wi

1）構(gòu)建原始評(píng)價(jià)指標(biāo)矩陣（Xij）mn

2）將（Xij）mn轉(zhuǎn)化為概率矩陣（Pij）mn

5）計(jì)算綜合評(píng)分（Mm）

由表3和公式計(jì)算結(jié)果可知，當(dāng)Hi越小、Wi越大時(shí)，評(píng)價(jià)指標(biāo)在綜合評(píng)價(jià)中作用力度越大；反之，越小。芍藥苷、甘草苷、單酯型生物堿、甘草酸單銨鹽與桂皮醛的Hi分別為0.991 7，0.998 5，0.968 3，0.986 1，0.963 8，Wi分別為0.090 6，0.016 4，0.346 1，0.151 7，0.395 2?？梢?，桂皮醛含量的Hi小、Wi大，在不同試驗(yàn)條件下變化最顯著，在綜合評(píng)價(jià)中作用力度最大；甘草苷含量則相反。

2.2.3 方差分析

由表3可知，各因素對(duì)烏頭桂枝湯綜合評(píng)分的影響主次順序?yàn)樘崛r(shí)間＞浸泡時(shí)間＞加水量。烏頭桂枝湯提取最優(yōu)工藝為A2B2C2，即加10倍量水浸泡1.0 h，提取1.0 h。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。可見，提取時(shí)間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），浸泡時(shí)間和加水量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Results of the ANOVA

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按優(yōu)選最佳工藝提取3批烏頭桂枝湯進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表5?？梢?，提取工藝、數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)方法具有可行性。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of the verification test

3 討論

3.1 評(píng)價(jià)指標(biāo)選擇

參考2020年版《中國(guó)藥典（一部）》，本研究中以白芍中芍藥苷，制川烏中苯甲酰新烏頭原堿，苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿，桂枝中桂皮醛[14］288，炙甘草中甘草苷[14］89和甘草酸單銨鹽[14］200為評(píng)價(jià)指標(biāo)。制川烏毒性較大，煎煮后由毒性較高的雙酯型生物堿水解成毒性較低的單酯型生物堿[15］。苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿是制川烏中的單酯型生物堿，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等作用[16-17］。芍藥苷具有抗炎、增強(qiáng)免疫力、抗氧化等藥理作用[18］。桂皮醛具有抗腫瘤、抗糖尿病、抗炎等藥理作用[19］。甘草苷具有抗凋亡、抗炎、降糖、調(diào)脂等藥理作用[20］。甘草酸單銨鹽具有良好的抗炎與抗腫瘤等藥理作用[21］。本研究中并未評(píng)價(jià)烏頭桂枝湯在基礎(chǔ)研究中的其他活性物質(zhì)，所選評(píng)價(jià)指標(biāo)不能全面優(yōu)選提取工藝。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

芍藥苷、桂皮醛、甘草苷、甘草酸單銨鹽、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰烏頭原堿的混合對(duì)照品溶液在200～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，檢測(cè)波長(zhǎng)為各有效成分的最大吸收波長(zhǎng)，可確保檢測(cè)方法的正確性。

3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

正交試驗(yàn)利用“均勻分散”挑選在考察范圍內(nèi)的少量試驗(yàn)點(diǎn)，以及應(yīng)用“整齊可比”更方便分析試驗(yàn)結(jié)果，找出最佳制備工藝。為了保證試驗(yàn)結(jié)果的“整齊可比”，需要較多的試驗(yàn)點(diǎn)。運(yùn)用正交試驗(yàn)[22-23］優(yōu)化烏頭桂枝湯提取工藝，考察浸泡時(shí)間、提取時(shí)間、加水量三因素三水平。在烏頭桂枝湯的優(yōu)化工藝中，需兼顧多個(gè)有效成分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，具有復(fù)雜性和難度性。

3.4 信息熵賦權(quán)法

Hi是不確定性和無(wú)序性的一種量度，熵權(quán)法以Hi為理論依據(jù)，對(duì)多種指標(biāo)評(píng)價(jià)賦權(quán)，得出綜合評(píng)分，可作為多指標(biāo)數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)的理論依據(jù)[24］。在藥物多個(gè)效應(yīng)評(píng)價(jià)的試驗(yàn)中，將多個(gè)效應(yīng)評(píng)價(jià)指標(biāo)通過(guò)信息熵理論進(jìn)行客觀賦權(quán)，建立綜合效應(yīng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合效應(yīng)評(píng)價(jià)指標(biāo)可清晰反映藥物劑量對(duì)多個(gè)效應(yīng)評(píng)價(jià)指標(biāo)的整體影響，避免各個(gè)效應(yīng)評(píng)價(jià)指標(biāo)的互相影響，提升了試驗(yàn)多評(píng)價(jià)指標(biāo)數(shù)據(jù)處理的科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性[25］。

3.5 評(píng)價(jià)指標(biāo)處理

中藥湯劑成分復(fù)雜，有效成分較多，本研究中通過(guò)查閱文獻(xiàn)和藥典確定湯劑中多個(gè)有效成分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，Wi是湯劑優(yōu)選工藝多指標(biāo)評(píng)價(jià)的關(guān)鍵。采用信息熵賦權(quán)法計(jì)算各指標(biāo)含量的Wi，將多項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)轉(zhuǎn)換成單一評(píng)價(jià)指標(biāo)。但單純使用客觀賦權(quán)法也有一定局限性，可能會(huì)造成中藥復(fù)方的主要成分權(quán)重過(guò)低或次要成分權(quán)重過(guò)高。故在實(shí)際操作中還應(yīng)根據(jù)具體研究確定是否和主觀賦權(quán)法聯(lián)用。