沒(méi)食子水提取物對(duì)牙根面刮治保護(hù)作用的研究*

艾 林，李 愷，高 鵬，張若冰，張琳靜△

（1.中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)空軍第九八六醫(yī)院，陜西 西安 710054；2.陜西省藥品監(jiān)督管理局，陜西 西安 710065）

中草藥或天然藥物治療牙周炎是近年來(lái)口腔醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)，提取的部分化合物抗炎作用顯著，應(yīng)用前景廣闊[1］。沒(méi)食子為常用中藥材，來(lái)源于沒(méi)食子蜂科昆蟲(chóng)沒(méi)食子蜂的幼蟲(chóng)寄生于殼斗科植物沒(méi)食子樹(shù)幼枝上所產(chǎn)生的干燥蟲(chóng)癭[2］。沒(méi)食子性寒，味苦，具有固澀、收斂、燥濕、止血功效，具有抗炎生物活性的有效成分主要為鞣質(zhì)、沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸烷基酯等[3］。牙髓和牙周是一個(gè)連續(xù)的組織，局部治療、干預(yù)會(huì)產(chǎn)生整體效果。牙周治療中齦下器械治療會(huì)導(dǎo)致牙骨質(zhì)損傷，暴露牙本質(zhì)小管。牙周組織炎癥可通過(guò)暴露的牙本質(zhì)小管、側(cè)副根管，以及根尖孔影響牙髓組織。有研究表明，感染牙周組織和根管系統(tǒng)的微生物種群和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況高度相似，但牙周袋的菌群多樣性高于根管內(nèi)[4］，在牙周炎的牙髓樣本中可檢測(cè)到放線菌、牙齦卟啉單胞菌、密齒螺旋體等牙周病原體[5］。故牙周炎癥會(huì)影響牙髓活力，牙周病變的嚴(yán)重程度與牙髓的組織學(xué)變化呈正相關(guān)[6］。本研究中探討了沒(méi)食子水提取物處理根面對(duì)細(xì)菌在牙本質(zhì)小管滲透的影響，以及不同細(xì)菌混合物接種牙髓腔后牙髓細(xì)胞的反應(yīng)和細(xì)菌成分間的差異?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：ProTaper-Next型機(jī)用根管擴(kuò)大針（瑞士Dentsply Maillefer公司）；TF-11#型金剛砂車針（日本馬尼公司）；F2002-259型齒科金剛砂片（上海道邦公司）；Gracey器械（美國(guó)HuFriedy公司）；Bluephase NMLED型光固化燈（列支敦士登伊沃克拉-維瓦登特公司）；Westernblot熒光分析儀、PCR儀、酶標(biāo)儀、CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Bio-Rad公司）。

試藥：沒(méi)食子藥材（中國(guó)新疆奇康哈博維藥有限責(zé)任公司，批號(hào)20161112）；20%葡萄糖酸氯己定（中國(guó)上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)C832370；4%次氯酸鈉（NaOCl）溶液（批號(hào)239305），胎牛血清（批號(hào)12103C），四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒（批號(hào)M5655），胰蛋白酶（批號(hào)T2600000），DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)D0819），丙二醇甲醚醋酸酯（PMA，批號(hào)P1585），胰蛋白酶大豆瓊脂平板培養(yǎng)基（批號(hào)1.46069），Wilkins Chalgren厭氧瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)W1761），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)BCA1），Western蛋白質(zhì)印跡盒（批號(hào)Z742091），均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)BC-BPBS-09）；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)HB0108-4）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，美國(guó)Abcam公司，批號(hào)ab9485）；TaqMan試劑盒（賽默飛世爾科技＜中國(guó)＞有限公司，批號(hào)4331182）；三氧化礦物（批號(hào)為MTA），Tetric N-Ceram復(fù)合樹(shù)脂均購(gòu)自列支敦士登伊沃克拉-維瓦登特公司。

1.2 樣本處理及分組

沒(méi)食子水提取物制備：用粉碎機(jī)將沒(méi)食子粉碎為粗粉，加水（質(zhì)量比1∶5）浸泡4 h，煎煮3次，分別過(guò)濾，每次1 h，合并煎液，濾過(guò)；真空干燥為浸膏，稱定質(zhì)量，分裝待用。實(shí)驗(yàn)組用浸膏與PBS混合制備，依據(jù)沒(méi)食子漱口液、西帕依固齦液的濃度調(diào)整溶液質(zhì)量濃度為10 mg/mL；氯己定溶液用蒸餾水調(diào)整質(zhì)量分?jǐn)?shù)至0.2%（質(zhì)量比）。

樣本處理及分組：選取2020年6月至2021年6月就診于中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)空軍第九八六醫(yī)院口腔科患者的55顆因正畸拔除的完整、無(wú)齲壞的前磨牙，牙齒在1%氯胺中放置7 d后置0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）中保存。使用ProTaper-Next型機(jī)用根管擴(kuò)大針進(jìn)行常規(guī)根管預(yù)備，根管長(zhǎng)度為距根尖孔1 mm處，最終預(yù)備至F2，使用MTA封閉根尖防止?jié)B漏，用NaOCl溶液沖洗根管。根管預(yù)備后將牙齒置生理鹽水中存放2個(gè)月，以去除殘留的NaOCl，每3 d更換1次生理鹽水。將40顆牙齒隨機(jī)分為生理鹽水組（生理鹽水處理）、生理鹽水+刮治組（生理鹽水+根面刮治處理）、氯己定+刮治組（氯己定+根面刮治處理）、沒(méi)食子+刮治組（沒(méi)食子水提取物+根面刮治處理）共4組，每組各10顆。使用無(wú)菌棉球填充牙髓腔，用復(fù)合樹(shù)脂材料光照固化充填，行根面刮治后的牙齒置實(shí)驗(yàn)溶液中浸泡3 d，然后將牙冠垂直插入含硅橡膠的空移液管尖盒中固化固定。實(shí)驗(yàn)前，樣本經(jīng)高溫（121℃）消毒20 min。所有操作由1名醫(yī)師獨(dú)立完成。本項(xiàng)研究已獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號(hào)為202003016）。

1.3 細(xì)菌對(duì)牙根的滲透性

將黏性放線菌（Actinomyces oris MG1）、鏈球菌（Streptococcus gordonii ATCC 10558）及牙齦卟啉單胞菌（Porphromones gingivalis ATCC 33277）菌株分別在含5%羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂培養(yǎng)板上培養(yǎng)24 h（37℃，黏性放線菌和牙齦卟啉單胞菌在厭氧條件下培養(yǎng)），將微生物置生理鹽水中。將鏈球菌分別與黏性放線菌和牙齦卟啉單胞菌懸濁液按細(xì)菌含量1∶1混合，置營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，加入牙齒樣本培養(yǎng)2周（37℃，5%CO2，飽和濕度）。在層流空氣柜中取出牙齒樣本，再次置營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中厭氧條件下（37℃，95%CO2，飽和濕度）培養(yǎng)2周。每周加入新培養(yǎng)的細(xì)菌，并檢查細(xì)菌生長(zhǎng)情況，每3 d更換1次營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

使用無(wú)菌金剛砂車針將牙齒縱向分為兩半，在距根面表面約1 mm處收集牙根牙本質(zhì)碎塊標(biāo)本。將碎片置含有100μL Wilkins Chalgren厭氧瓊脂培養(yǎng)基的Eppendorf管中，厭氧條件下培養(yǎng)7 d，記錄細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.4 牙髓細(xì)胞培養(yǎng)

將3顆實(shí)驗(yàn)牙在流水下使用金剛砂片沿縱軸方向磨出1 mm深的切溝，用75%乙醇消毒牙齒后劈開(kāi)牙齒，在嚴(yán)格無(wú)菌條件下完整取出牙髓組織。用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗牙髓組織3次，剪去根端1/3，將組織剪為1 mm3大小的碎塊，在CO2培養(yǎng)箱（20%FBS DMEM培養(yǎng)基，37℃，5%CO2，飽和濕度）中孵育過(guò)夜。每日用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)情況，當(dāng)組織塊貼壁后隔日半量換液。出現(xiàn)細(xì)胞融合后使用胰蛋白酶消化法（2%胰蛋白酶，0.2%EDTA）收集細(xì)胞，按1∶2傳代。取第5～7代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用無(wú)FBS細(xì)胞培養(yǎng)基將牙髓細(xì)胞以5×103個(gè)/cm2接種至12顆實(shí)驗(yàn)牙的髓腔中，MTA封閉開(kāi)髓孔。將12顆實(shí)驗(yàn)牙分為4組，各3顆，按1.2項(xiàng)下方法進(jìn)行根面處理，處理后將牙齒樣本置黏性放線菌/鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌/鏈球菌菌液中（37℃，5%CO2，飽和濕度）培養(yǎng)2周，再次置營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中厭氧條件下（37℃，95%CO2，飽和濕度）培養(yǎng)2周。每周加入新培養(yǎng)的細(xì)菌，并檢查細(xì)菌生長(zhǎng)情況，每3 d更換1次營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）與免疫分析

培養(yǎng)后取出牙髓細(xì)胞，Trizol法提取總核糖核酸（RNA）。設(shè)計(jì)白細(xì)胞介素8（IL-8）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）的引物序列，使用TaqMan試劑盒進(jìn)行RT-PCR。在反應(yīng)過(guò)程中自動(dòng)繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算以GAPDH為對(duì)照的相關(guān)基因表達(dá)水平[表達(dá)水平=（各實(shí)驗(yàn)組目的基因表達(dá)量/實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參表達(dá)量）/（GAPDH基因表達(dá)量/GAPDH內(nèi)參表達(dá)量）］。所有檢測(cè)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA），組內(nèi)比較采用Bonferroni分析，使用Fisher精確檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 混合培養(yǎng)菌株的滲透性

2種細(xì)菌混合物（黏性放線菌/鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌/鏈球菌）都能滲透入牙本質(zhì)。根面刮治可顯著增加細(xì)菌的滲透性（P＜0.05），沒(méi)食子提取物對(duì)刮治后的根面具有顯著的保護(hù)作用（P＜0.05）；而氯己定溶液具有一定的保護(hù)作用，但作用不顯著（P＞0.05）。沒(méi)食子+刮治組中菌群的滲透性顯著降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖1。

圖1 混合培養(yǎng)菌株的滲透性Note：Compared with those in the normal saline group，aP＜0.05；Compared with those in the normal saline+scaling group，bP＜0.05；Compared with those in the chlorhexidine+scaling group，cP＜0.05；Compared with those in the Actinomyces oris/Streptococcus gordonii，dP＜0.05（for Fig.1-2）.Fig.1 Permeability of mix-cultured strains

2.2 炎性介質(zhì)mRNA的表達(dá)

炎性介質(zhì)mRNA檢測(cè)結(jié)果顯示，各刮治組與生理鹽水組相比，IL-8，MCP-1，MMP-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均顯著更高（P＜0.05），詳見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)，沒(méi)食子可顯著降低刮治后IL-8，MCP-1，MMP-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平（P＜0.05）；但沒(méi)食子與氯己定相比，差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 炎性介質(zhì)mRNA的相對(duì)表達(dá)水平A.IL-8 B.MCP-1 C.MMP-3Fig.2 Relative expression levels of inflammatory mediator mRNA

3 討論

氯己定溶液被廣泛用于口腔菌群的控制，但其對(duì)黏膜有一定毒性作用[7］，故選取中草藥或天然藥物治療牙周炎是口腔醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。沒(méi)食子具有顯著的臨床藥用特性，其水提取物已被證明具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗菌活性，其有效成分主要為水提取物中的沒(méi)食子鞣質(zhì)、沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸烷基酯等，可用于制作漱口水[7］。本研究中自行制備沒(méi)食子水提取物，并充分考慮稀釋水提取物的濃度及吞咽后口腔中可能的稀釋度，評(píng)估其對(duì)根面刮治牙本質(zhì)小管細(xì)菌滲透性的影響。

細(xì)菌及其毒素可通過(guò)牙本質(zhì)小管擴(kuò)散傳播，大多數(shù)細(xì)菌位于牙本質(zhì)小管外部300μm[8］。單個(gè)物種的滲透模式不同于細(xì)菌共培養(yǎng)，細(xì)菌對(duì)牙本質(zhì)小管的滲透取決于細(xì)菌種類和生物膜的復(fù)雜性，細(xì)菌的共培養(yǎng)更接近牙周病的體內(nèi)情況[9］，故本研究中選擇2種細(xì)菌共培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)2周牙齒與菌群的共培養(yǎng)，使細(xì)菌擴(kuò)散到牙本質(zhì)小管中。結(jié)果顯示，根面刮治后，不同菌群處理后的根部牙本質(zhì)中都觀察到了細(xì)菌，生理鹽水組細(xì)菌的滲透性更強(qiáng)。本研究中選取的牙齒標(biāo)本均來(lái)源于青少年，牙本質(zhì)小管較粗，更可能促進(jìn)細(xì)菌的傳播。本研究結(jié)果顯示，牙本質(zhì)黏性放線菌/鏈球菌的滲透性比牙齦卟啉單胞菌/鏈球菌更強(qiáng)，但牙齦的滲透性差異不顯著，這種細(xì)菌共聚集的相互作用可能在牙周牙髓聯(lián)合病變的病因中起作用。

IL-8和MCP-1都是重要的炎性趨化細(xì)胞因子[10］。MMP-3在牙髓感染中具有抗炎作用[11］，其表達(dá)也可能通過(guò)白細(xì)胞介素1（IL-1）介導(dǎo)[12］。本研究結(jié)果顯示，沒(méi)食子+刮治組炎性介質(zhì)IL-8，MCP-1，MMP-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平顯著低于生理鹽水+刮治組，但與金標(biāo)準(zhǔn)氯己定+刮治組無(wú)顯著差異，這種效應(yīng)可能與沒(méi)食子的保護(hù)作用有關(guān)。將菌斑應(yīng)用于牙本質(zhì)易引起牙髓炎癥，而封閉暴露的牙本質(zhì)對(duì)牙髓有保護(hù)作用[13］。其他各組無(wú)顯著差異，推測(cè)可能因?yàn)楦婊騻?cè)副根管的滲漏掩蓋了組間可能存在的差異；健康的牙髓是一個(gè)由全層細(xì)胞組成的復(fù)雜組織，存在各種防御機(jī)制，以防止細(xì)菌毒素或細(xì)菌的可能滲透，而本研究中將牙髓細(xì)胞在生物膜中培養(yǎng)2周后才被植入牙髓室，與體內(nèi)情況不同。而且因?yàn)樯硌浪璧慕M織壓力，牙本質(zhì)小管液向外流動(dòng)，故本研究的臨床意義需慎重對(duì)待，并需進(jìn)一步研究。

20世紀(jì)，牙周病牙根表面的牙骨質(zhì)被認(rèn)為含有細(xì)菌和其內(nèi)毒素，需去除感染區(qū)“牙骨質(zhì)”，實(shí)現(xiàn)牙周愈合[14］。研究表明，過(guò)度去除牙骨質(zhì)并不是實(shí)現(xiàn)牙周健康的必要條件，其愈合過(guò)程相似[15］。本研究中對(duì)于根面刮治后暴露于細(xì)菌生物膜時(shí)牙髓細(xì)胞的反應(yīng)提供了新的結(jié)論，即嚴(yán)重牙周病時(shí)，根面刮治會(huì)破壞牙根表面的保護(hù)性鈣化層，會(huì)使口腔致病菌侵入牙本質(zhì)小管中，其毒力因子會(huì)影響牙髓細(xì)胞。本研究結(jié)果表明，根面刮治組細(xì)菌穿透牙本質(zhì)的情況更明顯，而沒(méi)食子水提取物對(duì)于刮治后的根面具有顯著的保護(hù)作用，這是因?yàn)闆](méi)食子水提取物均有顯著的抗炎、抗菌作用。

綜上所述，根面刮治去除牙骨質(zhì)，可促使細(xì)菌及其毒素從牙周袋滲透到牙本質(zhì)小管系統(tǒng)，而沒(méi)食子水提取物具有抗菌、抗生物膜活性，可降低細(xì)菌的滲透力，具有保護(hù)活髓牙牙髓細(xì)胞的潛力，表明其治療牙周炎的潛力。本研究結(jié)果可對(duì)中草藥的進(jìn)一步探索提供方向，未來(lái)的研究需要在更復(fù)雜的生物膜和體內(nèi)環(huán)境下評(píng)估沒(méi)食子的作用。