青蒿紫云膏治療日光疹的網(wǎng)絡(luò)薈萃分析與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

耿樹瓊，夏 偉，劉 慧，曹林森，羅奇彪，陳 婷，賀 娟△

（1.大理大學(xué)，云南 大理 671000；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二〇醫(yī)院，云南 昆明 650032）

紫外線輻射可破壞生物蛋白質(zhì)和脫氧核糖核酸（DNA），造成細(xì)胞損傷或死亡，導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)光損傷和光老化，并誘發(fā)日光疹、慢性光化性皮炎等光相關(guān)免疫性疾病[1］。目前，尚無治療日光疹的有效藥物[2-4］，常用的皮質(zhì)類激素軟膏藥品不良反應(yīng)較多，故僅可對癥治療[5］。經(jīng)典中醫(yī)辨證論治對日光疹的治療有相關(guān)論述，如清代名醫(yī)陳士鐸在《洞天奧旨》中描述：“日曬瘡，乃夏天酷烈之日曝而成者也……故止須消暑熱之藥，如青蒿一味飲之，外用末藥敷之即安?！盵6］臨床數(shù)據(jù)表明，以青蒿和紫草2種藥物為主要成分的復(fù)方制劑具有較好的日光疹治療效果[7-13］。其中，青蒿具有清熱、涼血退蒸、解暑祛風(fēng)、抗炎作用[14-15］，紫草具有涼血、活血、解毒透疹、抑菌作用[16-18］。在經(jīng)典古方基礎(chǔ)上研制的青蒿紫云膏為醫(yī)院制劑，由青蒿、紫草、白芷、冰片、當(dāng)歸等中藥組方，臨床療效較好。本研究中基于網(wǎng)絡(luò)薈萃分析和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探討了青蒿紫云膏治療日光疹的臨床療效和潛在作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)薈萃分析

文獻(xiàn)檢索：采用計(jì)算機(jī)檢索PubMed，Embase，The Cochrane Library，CNKI，VIP，WanFang，CBM等數(shù)據(jù)庫，以主題詞+自由詞形式檢索。中文檢索詞為“紫草”“青蒿”“日光疹”等；英文檢索詞為“Comfrey”“Symphytum officinale”“Artemisia annua”“Qinghao”“Sweet Wormwood”“Sweet Annie”“sunburn”“Solar dermatitis”等。檢索時(shí)限為自建庫起至2021年12月31日。

納入標(biāo)準(zhǔn)：國內(nèi)外公開發(fā)表的隨機(jī)對照試驗(yàn)；文種為中文、英文；確診為日光疹；治療方案為治療組以紫草/青蒿為君藥，單藥或聯(lián)用其他藥物，對照組給予（地）氯雷他定、馬來酸氯苯那敏（H1受體阻斷劑）和（羥）氯喹、煙酰胺、煙酸、維生素類制劑等；結(jié)局指標(biāo)為臨床痊愈率（皮疹或皮損全部消退，癥狀基本消失，積分值減少90%）。

排除標(biāo)準(zhǔn)：動(dòng)物研究；綜述、會議論文；設(shè)計(jì)不嚴(yán)謹(jǐn)，數(shù)據(jù)殘缺；重復(fù)發(fā)表文獻(xiàn)；存在混雜因素，如運(yùn)用其他藥物治療等。

文獻(xiàn)篩選及質(zhì)量評價(jià)：采用EndNote X 9.1軟件檢索文獻(xiàn)，由2名研究人員按納入、排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行文獻(xiàn)初篩與復(fù)篩，提取文獻(xiàn)題目、作者、發(fā)表年份及患者年齡、病程、治療療程、結(jié)局指標(biāo)等數(shù)據(jù)。采用Cochrane 5.1.0偏倚風(fēng)險(xiǎn)評估工具評價(jià)納入文獻(xiàn)的質(zhì)量。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析：采用R 4.1.2軟件與ADDIS 1.16軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)薈萃分析；根據(jù)貝葉斯原理，采用馬爾科夫鏈-蒙特卡羅法進(jìn)行先驗(yàn)評估，并處理數(shù)據(jù)。設(shè)置4條馬爾科夫鏈，迭代50 000次，退火20 000次，通過數(shù)據(jù)運(yùn)算與分析，得到不同干預(yù)措施間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖、Meta分析森林圖與概率排序圖。其中，循證結(jié)果是否具有顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)為OR值在95%置信區(qū)間（95%CI）內(nèi)是否與無效線相交，相交為顯著，不相交為不顯著。有效性排序中，Rank排序權(quán)重大于P值，結(jié)合兩者實(shí)施評估。

1.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

有效成分及靶點(diǎn)獲取：根據(jù)藥物代謝動(dòng)力學(xué)吸收-分布-代謝-排泄原理，在TCMSP數(shù)據(jù)庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中設(shè)置閾值，以類藥性（DL）≥0.18、口服生物利用度（OB）≥30%篩選藥物有效成分。通過Mol ID收集紫草、青蒿、白芷、冰片、當(dāng)歸有效成分的相關(guān)靶點(diǎn)，若未查詢到相關(guān)靶點(diǎn)，則檢索PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov），輸入有效成分的Cid/CAS號，獲得其Canonical SMILES分子式，并通過Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch）對有效成分（Probability＞0）進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測。將靶標(biāo)蛋白名通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）進(jìn)行規(guī)范校正。

疾病靶點(diǎn)獲?。阂浴皊olar dermatitis”“solar rash”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org）中進(jìn)行數(shù)據(jù)去重，獲得疾病靶點(diǎn)。

藥物-有效成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：采用Venny 2.1在線工具繪制韋恩圖，獲得藥物-疾病共有靶點(diǎn)，并建立屬性文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建藥物-有效成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)；采用Network Analyzer功能對青蒿紫云膏主要活性成分-疾病靶點(diǎn)進(jìn)行分析。

蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：將藥物-疾病共有靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，設(shè)置類別為“Multiple proteins”，物種為“Homo sapiens”，最高相互作用閾值為“High confidence（＞0.900）”，其余參數(shù)不變，得到PPI；分析結(jié)果以.tsv文本格式導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件，利用Network Analyzer插件功能對數(shù)據(jù)的度值進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，獲得藥物-疾病核心靶點(diǎn)。

富集分析：基于R 4.1.2軟件，采用ClusterProfiler、enrichplot、org.Hs.eg.db、ggplot2、GOplot生物信息軟件包，以P＜0.05和Q＜0.05為閾值，對前30條藥物-疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物功能富集分析與KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)薈萃分析結(jié)果

納入文獻(xiàn)基本信息：共檢索到文獻(xiàn)8 935篇，最終納入文獻(xiàn)7篇[7-13］，涉及629例日光疹患者。干預(yù)措施中，給藥方法與給藥劑量均符合藥品說明書要求，A為H1受體阻斷劑，B為H1受體阻斷劑+外用藥，C為H1受體阻斷劑+氯喹+煙酰胺，D為H1受體阻斷劑+（維生素E+維生素C+煙酰胺）+羥氯喹，E為以青蒿+紫草為君藥，F(xiàn)為以青蒿為君藥，G為以青蒿為君藥+外用藥。文獻(xiàn)篩選流程見圖1，納入文獻(xiàn)基本信息見表1。

表1 納入文獻(xiàn)的基本信息Tab.1 Basic information of the included studies

圖1 文獻(xiàn)篩選流程Fig.1 Flowchart of study screening

納入文獻(xiàn)質(zhì)量評價(jià)：7篇文獻(xiàn)中，2篇[7-8］為隨機(jī)數(shù)字分組，評價(jià)為“Low risk”；2篇[9-10］為隨機(jī)分組但未明確方式，評價(jià)為“Unclear risk”；1篇[11］按就診時(shí)間順序分組，評價(jià)為“High risk”；2篇[12-13］未提及分組方式，評價(jià)為“Unclear risk”。所有文獻(xiàn)均未提及盲法，且均有明確的結(jié)局指標(biāo)。詳見圖2。

圖2 納入文獻(xiàn)質(zhì)量評價(jià)Fig.2 Quality evaluation of included studies

有效性評價(jià)：7篇文獻(xiàn)均明確報(bào)道臨床痊愈數(shù)據(jù)，采用比值比（OR）法進(jìn)行合并效應(yīng)量網(wǎng)狀薈萃分析，潛在規(guī)模折減系數(shù)（PSRF）參數(shù)值越接近1.00，則收斂效能越好，一致性模型分析結(jié)果可信度越高。本研究中PSRF均為1.00，有效性概率由大至小排序?yàn)镋（Rank1P=0.45）＞D（Rank 1P=0.43）＞F（Rank 2P=0.31）＞C（Rank 4P=0.37）＞A（Rank 5P=0.44）＞G（Rank 6P=0.46）＞B（Rank 7P=0.75）；Meta分析森林圖顯示，各干預(yù)措施間有效性比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。詳見圖3、圖4和表2。

圖4 干預(yù)措施有效性Meta分析森林圖Fig.4 Meta-analysis forest plot of the effectiveness of interventions

表2 干預(yù)措施有效性概率排序Tab.2 Probability ranking of the effectiveness of different interventions

圖3 干預(yù)措施薈萃分析網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Meta-analysis network of interventions

安全性評價(jià)：藥品不良反應(yīng)治療組為輕度惡心，占2.70%（9/333）；對照組為胃腸道反應(yīng)、失眠多夢、肝功能異常、食欲不振、惡心、腹脹、手足麻木、視力模糊、全身不適，占14.19%（42/296）。結(jié)果顯示，以青蒿、紫草為君藥時(shí)，藥品不良反應(yīng)較輕。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

青蒿紫云膏有效成分及靶點(diǎn)：共獲得60個(gè)有效成分，1 335個(gè)靶點(diǎn)。詳見表3。

表3 青蒿紫云膏有效成分Tab.3 Active components of Qinghao Ziyun Ointment

疾病靶點(diǎn)：共獲得疾病靶點(diǎn)466個(gè)，藥物靶點(diǎn)454個(gè)，藥物與疾病共有靶點(diǎn)109個(gè)。

藥物-有效成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)：以度值作為衡量節(jié)點(diǎn)重要性的關(guān)鍵指標(biāo)，節(jié)點(diǎn)度值越大越具有多成分、多靶點(diǎn)、多對應(yīng)特性，表明該節(jié)點(diǎn)越重要，其代表的化合物或靶點(diǎn)越有可能在藥物治療疾病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。結(jié)果表明，積雪草酸（asiatic acid）、槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）等有效成分在疾病靶點(diǎn)中均具有關(guān)鍵作用。詳見圖5。

圖5 青蒿紫云膏治療日光疹的藥物-有效成分-疾病靶點(diǎn)Fig.5 Drug-active components-disease targets of Qinghao Ziyun Ointment in the treatment of solar dermatitis

PPI網(wǎng)絡(luò)：共109個(gè)節(jié)點(diǎn)、373條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為6.84（圖6）。其中，不同顏色表示不同靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)的大小表示度值的大小。經(jīng)計(jì)算，所有節(jié)點(diǎn)的度值中位數(shù)為6，選擇12＜度值＜35，得到85條邊、20個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，通過Cytoscape 3.8.2軟件對關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI進(jìn)行可視化分析（圖7）。其中，度值較大的靶點(diǎn)包括JUN、白細(xì)胞介素6（1L-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、MYC、細(xì)胞腫瘤抗原p53（TP53）等，為整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用的核心靶點(diǎn)。

圖6 青蒿紫云膏治療日光疹的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.6 PPI network of Qinghao Ziyun Ointment in the treatment of solar dermatitis

圖7 青蒿紫云膏治療日光疹的關(guān)鍵靶點(diǎn)可視化分析Fig.7 Visual analysis of key targets of Qinghao Ziyun Ointment in the treatment of solar dermatitis

GO生物功能富集分析和KEGG通路富集分析：分別選取細(xì)胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）、生物過程（biological process）中Q值排序前10的部分作圖。結(jié)果顯示，主要富集于輻射反應(yīng)（response to radiation）、對細(xì)胞外刺激的反應(yīng)（response to extracellular stimulus）、活性氧代謝過程（reactiveoxy-genspecies metabolic process）、老化（aging）等細(xì)胞組分及蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（proteinserine/threo-ninekinaseactivty）、細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokinerecep-torbinding）等生物過程。詳見圖8。運(yùn)行KEGG前30條通路顯示，青蒿紫云膏治療日光疹可通過影響白細(xì)胞介素17（IL-17）、TNF、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化（Lipidan datheroscierosis）、細(xì)胞衰老（Cellular senescence）等信號通路發(fā)揮作用。詳見圖9。

圖9 KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.9 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

3 討論

日光疹又稱日光性皮炎、日曬傷、紫外線紅斑等，是人體局部皮膚發(fā)生急性光毒或光過敏性反應(yīng)引起的常見皮膚病[19］。其臨床表現(xiàn)為日曬后暴露皮膚出現(xiàn)彌漫性紅斑，較重時(shí)可伴水腫/水皰、燒灼感、疼痛[20］。醫(yī)學(xué)中將日光疹分為陽毒襲表證和毒熱熾盛證，其發(fā)病機(jī)制為以陽熱毒邪侵入體表，蘊(yùn)郁肌膚，灼皮傷肌而致，毒熱夾暑濕或與內(nèi)濕搏結(jié)，浸淫肌膚所致，可口服或外用清熱解毒除濕之品治療[6］。同時(shí)，匡德芳等[21］、方一妙等[22］、喬宏等[23］的研究印證了中藥治療日光疹均以清涼除濕來克制致陽毒熱，以陰陽五行為理論，使人體達(dá)到陰陽調(diào)和而恢復(fù)。青蒿、紫草為涼性天然藥物，治療日光疹的療效較好[7-13］。

本研究中共納入7項(xiàng)研究[7-13］，涉及629例患者，采用網(wǎng)狀薈萃分析理論將青蒿、紫草治療日光疹的多個(gè)治療方案進(jìn)行對比分析，結(jié)果顯示，以干預(yù)措施E治療日光疹有效性排名第1的概率最高（0.45），其療效與干預(yù)措施D相當(dāng)；青蒿作為君藥單獨(dú)使用與H1受體阻斷劑療效相似；外用藥如燒傷膏、硼酸濕敷并未顯示確切的療效，與未使用外用藥干預(yù)相比無顯著差異。故青蒿聯(lián)合紫草治療日光疹療效較好，且作為天然成分藥物，其安全性較高，可為日光疹的治療奠定基礎(chǔ)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，青蒿紫云膏中含有60個(gè)有效成分，其中關(guān)鍵成分為積雪草酸、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、槲皮素等。前4種成分均具有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化作用[24-27］；山柰酚與木犀草素作為天然的黃酮類化合物，還具有抗衰老、抑制細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)免疫功能等作用[28-30］；β-谷甾醇在組織修復(fù)方面作用顯著[31］；槲皮素為植物雌激素，具有抗缺氧、抗氧化應(yīng)激損傷、神經(jīng)元細(xì)胞保護(hù)作用[32-33］。上述成分可在日光疹致皮膚損傷方面起到較好的修復(fù)作用。

核心靶點(diǎn)分析中，度值較高的靶點(diǎn)MAPK1和IL-6與炎性反應(yīng)密切相關(guān)。其中，MAPK1受miR-129-5p負(fù)調(diào)控，發(fā)揮抑制炎性反應(yīng)作用[34］；IL-6可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生及分裂，抑制機(jī)體瀑布式炎性級聯(lián)反應(yīng)，有助于促進(jìn)損傷皮膚的修復(fù)[35-36］。JUN，MYC，TP53均與細(xì)胞增殖相關(guān)，JUN在腫瘤轉(zhuǎn)化及逆轉(zhuǎn)中起關(guān)鍵作用[37］；MYC在輻射作用下可被激活轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗?，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生癌變[38-39］，與TP53共同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[40］。日光疹與藥物有效成分共有核心靶點(diǎn)分析表明，皮膚在強(qiáng)光或紫外線等輻射下出現(xiàn)損傷，除與炎癥相關(guān)外，還可進(jìn)一步引發(fā)癌變。青蒿紫云膏有效成分主要針對上述靶點(diǎn)發(fā)揮治療與預(yù)防癌變的作用。

藥物-疾病共有靶點(diǎn)通過GO生物功能富集分析主要定位于細(xì)胞組分中的膜筏、膜微區(qū)，得到絲氨酸/蘇氨酸激酶、細(xì)胞因子受體、微管結(jié)合蛋白激酶等基因產(chǎn)物，參與輻射反應(yīng)、對細(xì)胞外刺激的反應(yīng)、活性氧代謝、老化等生物過程。GO生物功能富集分析表明，藥物-疾病共有靶點(diǎn)可能通過抑制輻射、活性氧、細(xì)胞衰老等抑制和治療日光疹。KEGG通路富集主要涉及TNF、IL-17、細(xì)胞衰老、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化等通路，其中脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17、TNF通路與炎癥息息相關(guān)[41］。機(jī)體受紫外線或強(qiáng)光照射而致皮損，促使機(jī)體多種炎性介質(zhì)釋放，加重炎性反應(yīng)[42-43］；細(xì)胞衰老是DNA損傷、活性氧累積的細(xì)胞反應(yīng)，表現(xiàn)為細(xì)胞周期停滯及炎性介質(zhì)分泌[44-45］。紫外線照射使細(xì)胞內(nèi)活性氧水平降低，導(dǎo)致皮膚纖維細(xì)胞損傷[46］，進(jìn)而造成皮膚衰老和細(xì)胞受損，產(chǎn)生炎性介質(zhì)，激發(fā)急、慢性炎性反應(yīng)[42-43］。上述機(jī)制表明，青蒿紫云膏有效成分主要通過抑制炎性反應(yīng)、抗細(xì)胞衰老等通路而起到抑制和治療日光疹的作用。

本研究存在一定缺陷，納入研究[7-13］未闡述盲法，可能出現(xiàn)選擇性偏倚風(fēng)險(xiǎn)；共涉及629例患者，為不同地區(qū)單個(gè)體的獨(dú)立研究，無多中心研究，可能與該藥物為中成藥相關(guān)。后續(xù)將增加樣本量，加強(qiáng)藥物臨床療效證據(jù)的研究。