菠蘿AcSOC1基因調(diào)控因子篩選

金順達，胡福初，王祥和，李玉靜，范鴻雁，羅志文，張治禮，陳 哲

菠蘿基因調(diào)控因子篩選

金順達1,2，胡福初2，王祥和2，李玉靜2，范鴻雁2，羅志文2，張治禮2*，陳 哲2*

1. 海南大學園藝學院，海南?？?570228；2. 海南省農(nóng)業(yè)科學院熱帶果樹研究所/海南省熱帶果樹生物學重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部?？跓釒Ч麡淇茖W觀測實驗站，海南?？?571100

菠蘿（）是我國熱區(qū)種植的主要經(jīng)濟作物之一，農(nóng)業(yè)種植上常通過施用乙烯利促其成花，但關(guān)于乙烯誘導菠蘿成花的分子機制與植物體內(nèi)已知的五大成花途徑之間關(guān)系尚不清楚。（）是一種開花整合因子，能夠整合多種成花信號，誘導植物成花。有實驗數(shù)據(jù)顯示，（XM_020238379.1）基因響應(yīng)乙烯誘導，在乙烯處理菠蘿后，表達量上升。為了深入了解在菠蘿成花中的作用及乙烯誘導菠蘿成花與五大成花途徑之間的關(guān)系，本研究以乙烯敏感品種‘臺農(nóng)4號’為材料，克隆啟動子，構(gòu)建pAbAi-pAcSOC1誘餌載體，利用酵母單雜技術(shù)，篩選候選調(diào)控因子，并用雙熒光素酶實驗進行驗證。結(jié)果顯示：共篩選出4個候選轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子∶（）（）（）（）只有與pAcSOC1存在互作關(guān)系。是一種開花抑制因子，乙烯能夠抑制菠蘿基因表達。因此推斷認為，乙烯誘導菠蘿成花，可能是通過抑制基因?qū)崿F(xiàn)的，即乙烯通過抑制的表達，從而降低了對表達的抑制作用，表達增強，加快了乙烯誘導成花的過程。

菠蘿；乙烯誘導；開花調(diào)控；調(diào)控因子

菠蘿又名鳳梨（），為鳳梨科鳳梨屬多年生草本植物，是一種典型的亞熱帶植物[1]。我國是菠蘿主要產(chǎn)地之一，種植面積和產(chǎn)量分別約占全球總量的7.2%和8.1%[2-3]。海南氣候溫潤，適合菠蘿種植，其產(chǎn)量約占全國產(chǎn)量的26.8%，已逐漸成為我國菠蘿主產(chǎn)區(qū)之一[4-5]。

開花是植物由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的重要標志之一，通常伴隨著植物形態(tài)及生理生化的變化，如生殖器官發(fā)生、果實發(fā)育、內(nèi)源激素變化等。菠蘿開花可分為自然開花和人工誘導開花兩大類[6]。自然開花，即菠蘿生長到合適狀態(tài)，經(jīng)過自然低溫誘導后自然成花。由于自然成花受到菠蘿生長狀態(tài)、氣候等環(huán)境因素影響較大，常常導致成花時間不一致，果實成熟時間和采收時間不一致，進而導致上市時間不確定等給種植戶造成困擾和經(jīng)濟損失。因此，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常常避開菠蘿自然成花季節(jié)，通過施用乙烯利或電石等誘導菠蘿提前成花[7-9]。植物開花受內(nèi)部因素（赤霉素等激素）和外部因素（水分、溫度、光照等環(huán)境因素）的調(diào)控[10]。遺傳學和分子生物學分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擬南芥開花的調(diào)控信號最終均匯集到少數(shù)幾個調(diào)控因子如（）（）等發(fā)揮作用。是重要的開花整合因子。前人研究發(fā)現(xiàn)，基因受（）、、、（SQUAMOSA promoter binding-like）、等基因直接或間接調(diào)控，整合來自光周期、溫度、激素、年齡途徑等的開花信號[11-12]。LIU等[13]在梨樹中分離并鑒定出2個同源基因和，在擬南芥中過表達可以促進擬南芥花期提前；SONG等[14]在藍莓中發(fā)現(xiàn)并鑒定了一個同源基因，超表達轉(zhuǎn)基因藍莓表現(xiàn)出早花現(xiàn)象。

酵母單雜系統(tǒng)創(chuàng)立于1993年，目前已經(jīng)發(fā)展成為一種成熟的技術(shù)并被廣泛應(yīng)用于DNA與蛋白質(zhì)互作[15]、轉(zhuǎn)錄因子篩選的研究中[16-20]。前期已有研究數(shù)據(jù)顯示，施用乙烯利可上調(diào)菠蘿基因的表達。為深入了解在乙烯誘導菠蘿成花中的作用，本研究采用乙烯敏感型菠蘿品種‘臺農(nóng)4號’克隆啟動子序列，利用酵母單雜系統(tǒng)篩選上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，再通過雙分子熒光素酶實驗驗證篩選出的轉(zhuǎn)錄因子與pAcSOC1的互作關(guān)系。研究結(jié)果將為進一步闡明乙烯誘導菠蘿成花的分子基礎(chǔ)及其與已知植物成花途徑之間的關(guān)系、揭示菠蘿成花調(diào)控的分子機制提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及處理 ‘臺農(nóng)4號’菠蘿種植于海南省澄邁縣美亭村菠蘿大棚種植基地。大棚室內(nèi)溫度為25℃左右，濕度為70%～80%，其他環(huán)境條件均控制在菠蘿適宜生長環(huán)境范圍內(nèi)。選取株齡1 a、生長狀態(tài)基本一致、擁有30片左右成熟健康葉片（葉長約35 cm）的菠蘿植株作為催花處理對象。

催花處理：用80 mL的40%乙烯利300倍液灌心。

取樣及處理：催花處理后1、2、3、4、5、6、7、24 h分別取菠蘿植株莖尖（每個樣品均取自不同植株，3個生物學重復(fù)），液氮速凍后貯存于–80℃超低溫冰箱，備用。不催花的植株作為對照。

本氏煙草種植于RLD-1000E-4人工氣候箱中，光周期：光照16 h，黑暗8 h，溫度23～25℃。

1.1.2 菌株和載體 大腸桿菌DH5α感受態(tài)、農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)購自上海維地生物技術(shù)有限公司，酵母Y1HGold菌株由Clontech酵母試劑盒提供，pAbAi誘餌載體由Clontech酵母單雜試劑盒提供，雙熒光素酶載體pGreen II 62-SK、pGreen II 0800-LUC由海南大學夏薇老師饋贈。

1.1.3 主要試劑 SD缺素培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基購自北京酷來搏科技有限公司，高保真DNA聚合酶購自南京諾唯贊生物公司，dⅢ、Ⅰ限制性內(nèi)切酶購自NEB公司，T4連接酶購自莫納生物公司，TOPO連接試劑盒購自艾德萊生物公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技股份有限公司，MatchmakerTMGold Yeast One-Hybrid Library Screening System、Advantage 2 PCR Kit購自TaKaRa公司。引物合成及測序均由廣州天一輝遠公司完成。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 稱取等量的、催花處理后不同時間取樣的菠蘿莖尖組織樣品（包括對照植株），混合后RNA提取參照福記多酚多糖RNA提取試劑盒說明書進行。超微量分光光度計測定RNA濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳分析RNA完整性。

1.2.2 誘餌載體構(gòu)建及誘餌酵母轉(zhuǎn)化 根據(jù)Plant CARE預(yù)測的結(jié)果[21]，避開順式元件區(qū)，可將啟動子區(qū)域（–1800～0 bp）分為4部分，依次命名為pAbAi-AcSOC1-1、pAbAi-AcSOC1-2、pAbAi-AcSOC1-3和pAbAi-AcSOC1-4。根據(jù)啟動子序列和載體序列特征，設(shè)計包含dⅢ和Ⅰ酶切位點的引物（表1）。以‘臺農(nóng)4號’菠蘿植株葉片DNA為模板，利用pAbAi-AcSOC1-1F /pAbAi-AcSOC1-1R、pAbAi-AcSOC1-2F/pAbAi- AcSOC1-2R、pAbAi-AcSOC1-4F/pAbAi-AcSOC1- 4R和pAbAi-AcSOC1-4F/pAbAi-AcSOC1-4R引物進行擴增。PCR擴增產(chǎn)物和pAbAi載體進行雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化后，得到誘餌載體pAbAi- AcSOC1-1、pAbAi-AcSOC1-2、pAbAi-AcSOC1和pAbAi-AcSOC1-4。測序無誤后，提取質(zhì)粒，使用I單酶切，純化，轉(zhuǎn)化至酵母感受態(tài)Y1HGold中（方法參考維地Y1HGold轉(zhuǎn)化說明書）。

1.2.3 自激活驗證 從分別含有不同誘餌載體的誘餌菌株培養(yǎng)皿上挑取單菌落，分別轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)（30℃、250 r/min）至600為0.002時，吸取100 μL分別涂布在含有AbA抗生素的SD/-Ura固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)（設(shè)置0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 ng/mL等10個AbA濃度）。培養(yǎng)3～5 d后，根據(jù)不同抗生素濃度平板酵母菌落長勢，確定4種誘餌菌株的自激活強度。

1.2.4 cDNA文庫構(gòu)建及質(zhì)量檢測 以菠蘿莖尖組織混合樣品RNA為模板，參照SMART試劑盒、Advantage 2 PCR Kit提供的方法構(gòu)建不同催花時間菠蘿莖尖組織cDNA文庫[22]。文庫滴定濃度：將文庫菌株梯度稀釋100倍、1000倍、10 000倍，分別涂布在含有對應(yīng)AbA抗生素濃度的SD/-Ura平板上，30℃培養(yǎng)3～5 d后統(tǒng)計平板上菌落數(shù)目。文庫滴度計算參考楊成君等[23]的方法。重組率：根據(jù)pGADT7載體序列特征設(shè)計引物pGADT7F和pGADT7R（表1）。隨機挑取24個單菌落進行菌落PCR檢測，根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)分析擴增條帶大小，并計算重組率[24]。

表1 引物匯總

1.2.5 互作因子的篩選與點對點互作蛋白驗證 參考MatchmakerTMGold Yeast One-Hybrid Library Screening System方法，提取陽性克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌后測序；測序后，利用NCBI進行序列比對；去除冗余后將對應(yīng)序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對應(yīng)的誘餌酵母，涂布在SD/-Leu、SD/-Leu/AbA平板上，培養(yǎng)3～5 d觀察菌落生長狀態(tài)。

1.2.6 雙熒光素酶實驗 以pLUC-SOC1-F/pLUC- SOC1-R為引物，啟動子質(zhì)粒為模板，方法同1.2.2，構(gòu)建pLUC-SOC1重組載體。同理，以AcSVP1-F/AcSVP1-R、AcSVP2-F/AcSVP2-R為引物，以上述提取質(zhì)粒為模板，構(gòu)建雙熒光素酶表達載體p62-SK-AcSVP1和p62-SK-AcSVP2。測序驗證無誤后，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中（方法參考維地生物GV3101說明書）。28℃培養(yǎng)2～3 d后，挑取單菌落PCR鑒定無誤后，28℃，250 r/min搖菌過夜。菌液按照600的比值1∶9，將包含pLUC-SOC1載體的農(nóng)桿菌分別與包含p62-SK-AcSVP1、p62-SK-AcSVP2載體的農(nóng)桿菌混合。同時以pLUC-SOC1與pGreen II 62-SK混合菌液作為空白對照，農(nóng)桿菌侵染方法參考LI等[25]的方法。暗培養(yǎng)1 d，正常培養(yǎng)36 h后測定海腎和螢火蟲2種螢光素酶的活性（測定方法參考雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒），計算二者比值[26]。使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，利用Origin 2018繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量分析

利用福記多酚多糖RNA提取試劑盒提取RNA，使用超微量分光光度計檢測RNA純度，260280=1.91，260230=2.03。經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外線下能夠清楚地看到2條明亮的條帶，且無彌散，表明所提取的RNA質(zhì)量和完整型可滿足建庫要求。

2.2 誘餌載體的構(gòu)建

從生長3～4 d包含誘餌載體的酵母平板上挑取單克隆，使用誘餌載體特異性引物經(jīng)菌落PCR檢測，條帶大小與預(yù)期相符（圖1），表明誘餌酵母轉(zhuǎn)化成功。

M: DL2000 DNA marker; 1: pAbAi-SoC1-1; 2: pAbAi-SoC1-2; 3: pAbAi-soC1-3; 4: pAbAi-SOC1-4 decoy carrier.

2.3 誘餌酵母自激活驗證

將誘餌酵母菌涂布在SD/-Ura/AbA培養(yǎng)基上，pAbAi-AcSOC1-1、pAbAi-AcSOC1-2、pAbAi- AcSOC1-3、pAbAi-AcSOC1-4誘餌酵母分別在200、800、200、400 ng/mL的AbA的選擇壓力下，自激活得到抑制（圖2）。因此，選擇200、800、200、400 ng/mL的AbA濃度分別作為對應(yīng)誘餌酵母文庫篩庫壓力。

2.4 酵母單雜系統(tǒng)cDNA文庫量檢測

以提取獲得的‘臺農(nóng)4號’RNA為模板，利用SMART技術(shù)合成第一鏈cDNA，再經(jīng)LD-PCR技術(shù)獲得雙鏈dsDNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析，擴增得到的雙鏈dsDNA與陰性對照一致，滿足酵母單雜建庫要求。

圖2 誘餌酵母在SD/-Ura/AbA培養(yǎng)基自激活驗證

統(tǒng)計文庫稀釋后平板上長出的菌落數(shù)目，計算可得文庫滴度為3.21×107CFU/mL（圖3）；共檢測出24個陽性克隆，得到cDNA插入片段約1000 bp，重組率為100%（圖4）。表明此文庫可滿足酵母單雜篩庫要求。

A：100 μL文庫菌液；B：100 μL稀釋10倍的文庫菌液；C：100 μL稀釋100倍的文庫菌液。

M：DL5000 DNA marker；1～24：24個克隆的菌落PCR產(chǎn)物。

2.5 酵母單雜交初篩結(jié)果

從SD/-Ura/AbA平板上挑取陽性單克隆，測序去重后共得到4個單一序列，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫Blast比對后，依次為類基因（表2）。通過酵母單雜交點對點驗證這4種蛋白與AcSOC1啟動子的互作關(guān)系，結(jié)果表明，pGADT7-AP1、pGADT7-GHDP載體轉(zhuǎn)化進入誘餌酵母后，能夠在SD/-Leu培養(yǎng)基上生長，但不能在SD/-Leu/AbA平板上生長；pGADT7-SVP1、pGADT7-SVP2載體轉(zhuǎn)化進入誘餌酵母后，在2種培養(yǎng)基上均能生長（圖5）。表明與啟動子無互作關(guān)系，而與啟動子存在互作關(guān)系。

表2 酵母單雜初篩結(jié)果

2.6 雙熒光素酶驗證

為進一步探究菠蘿啟動子與的互作關(guān)系，本研究克隆了、基因（圖6），并構(gòu)建了含有pAcSOC1+螢火蟲螢光素酶報告基因+海腎螢光素酶報告基因的pGreen II 0800-LUC載體，以及62-SK-AcSVP1、62-SK-AcSVP2、0800-LUC-SOC1載體，分析其在煙草葉片中的瞬時表達情況，結(jié)果見圖7。與對照組相比，實驗組熒光信號強度顯著弱于對照組。這表明可與啟動子結(jié)合，并降低啟動子的活性。

1：10 μL菌液；0.1：10 μL菌液10倍稀釋；0.01：10 μL菌液100倍稀釋。

3 討論

菠蘿是我國熱區(qū)的經(jīng)濟作物之一，其開花時間直接決定其上市時間，進而影響菠蘿種植戶的經(jīng)濟收入。植物成花是一個復(fù)雜的系統(tǒng)，受外部環(huán)境和自身因素等多方面的調(diào)控，這些調(diào)控方式在植物體內(nèi)形成了一個精密而復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，但最終被整合到幾個關(guān)鍵的基因上，這些基因被稱為開花整合因子[11]?；蚴羌易逯械囊粏T，編碼一種轉(zhuǎn)錄因子。前人研究發(fā)現(xiàn)光照可影響mRNA的穩(wěn)定性，而是基因的上游調(diào)控因子，在光周期途徑中與形成二聚體，影響SOC1的表達[27]；春化途徑和自主途徑中的直接或形成阻遏復(fù)合體與啟動子結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄，調(diào)控開花[28-30]；在研究GA調(diào)控途徑中發(fā)現(xiàn)，DELLAs蛋白可與競爭NF-Y結(jié)合位點，進而影響SOC1的表觀遺傳活性。當GA存在時，DELLAs蛋白會被降解，表達量上調(diào)[31]；年齡途徑中microRNA隨著年齡的增加，表達量降低，對的抑制作用減弱?？膳c第一個內(nèi)含子結(jié)合上調(diào)其表達水平，促進開花。同時，對及其同源基因研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)控等花器官基因，影響植物花形態(tài)的發(fā)生[10]。總結(jié)前人的研究發(fā)現(xiàn)，廣泛參與成花的各種途徑之中，在開花調(diào)控中起著“承上啟下”的作用，是開花整合因子之一。通過前人的研究，的調(diào)控機制得到了一定的解釋，但是關(guān)于乙烯誘導菠蘿成花過程中的調(diào)控機制尚不清楚。因此，本研究利用酵母單雜交技術(shù)在乙烯處理的菠蘿中篩選調(diào)控因子。

圖6 AcSVP1與AcSVP2多序列比對

CK：pLUC-SOC1+pGreen II 62-SK；AcSVP1：pLUC-SOC1+p62-SK-AcSVP1；AcSVP2：pLUC-SOC1+p62-SK-AcSVP2；不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（P<0.05）。

為了研究清楚基因在菠蘿中的調(diào)控機制，本研究利用酵母單雜交技術(shù)，對上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子篩選，成功篩選出2個轉(zhuǎn)錄因子。通過對及其同源基因[32][33]等研究發(fā)現(xiàn)，是一種開花抑制因子[34]，主要在春化途徑、赤霉素途徑、自主途徑等開花調(diào)控途徑中發(fā)揮作用，整合來自植物體內(nèi)和外界環(huán)境的調(diào)控信號，抑制等開花整合因子的表達，維持植物處于營養(yǎng)生長的狀態(tài)。LI等[35]研究發(fā)現(xiàn)響應(yīng)溫度信號，與形成復(fù)合物抑制下游開花基因表達，調(diào)控植物成花；在GA途徑中，通過抑制的表達，降低植物體內(nèi)GA含量；陳嬌等[36]研究表明是上游調(diào)控基因，在成花過程中抑制，從而延遲開花。可與春化途徑中的相互作用形成阻遏復(fù)合體，直接結(jié)合到啟動子上，抑制其轉(zhuǎn)錄。除此之外，LEE等[37]研究表明參與染色質(zhì)的表觀遺傳修飾，使染色質(zhì)處于不活躍的狀態(tài)。李玉靜等[38]在乙烯誘導菠蘿成花研究中，發(fā)現(xiàn)乙烯處理后表達水平下降，菠蘿成花加速。

本研究還分析了、對啟動子活性的影響。結(jié)果表明，對啟動子活性有明顯的抑制作用，初步推斷，在菠蘿中可與基因啟動子結(jié)合，并抑制其活性。乙烯處理菠蘿后，表達量下降，其對啟動子的抑制作用降低，啟動子活性增強，表達量上升，作用于下游成花基因，促進菠蘿成花。

本研究通過酵母單雜交技術(shù)，篩選出的2個上游轉(zhuǎn)錄因子，并利用雙熒光素酶技術(shù)驗證了其對于啟動子的作用。該結(jié)果對在菠蘿成花過程中的作用和地位研究提供了新的思路和線索，為進一步闡明乙烯誘導菠蘿分子機理奠定了基礎(chǔ)。但由于是一種開花整合因子，受多種途徑的調(diào)控，因此本研究結(jié)果只是基因眾多調(diào)控途徑中的一部分，如需全面了解基因在菠蘿成花中的作用仍需更多的實驗數(shù)據(jù)來闡述。

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Screening of the PotentialRegulators in Pineapple

JIN Shunda1,2, HU Fuchu2, WANG Xianghe2, LI Yujing2, FAN Hongyan2, LUO Zhiwen2, ZHANG Zhili2*, CHEN Zhe2*

1. Institute of Horticulture, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China; 2. Institute of Tropical Fruit Trees, Hainan Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Tropical Fruit Tree Biology of Hainan Province / Investigation Station of Tropical Fruit Trees, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Haikou, Hainan 571100, China

Pineapple () is one of the main crops grown in the tropics in China, and the application of ethphon often promotes its flowering. However, the molecular mechanism of ethylene-induced pineapple flower formation and the five known flower formation pathways in plants. The relationship between them is unclear.() is a flowering integrator that can integrate various flowering signals to induce plant flowering. Experimental data showed that the() gene responded to ethylene induction, and the expression ofincreased after ethylene treatment of pineapple. To further understand the role ofin pineapple flower formation and the relationship between ethylene-induced pineapple flower formation and five major flower formation pathways, this study used ethylene-sensitive cultivar ‘Tainong No. 4’ as material, cloned thepromoter, and constructed pAbAi-pAcSOC1. The bait vector, using yeast single-hybrid technology, screenedcandidate regulators and verified it with dual luciferase experiments. The results showed that 4 candidate transcriptional regulators ofwere screened:(),(),(),(), and only,interacted with pAcSOC1.is a flowering inhibitor, and ethylene can inhibit the expression of thegene in pineapple. Therefore, it is inferred that ethylene-induced pineapple flower formation may be achieved by inhibiting thegene. That is, ethylene reduces the inhibitory effect ofon the expression ofby inhibiting the expression of, and the presentation ofis enhanced, which accelerates the process of ethylene-induced flower formation.

pineapple; ethylene induction; flowering regulation;regulatory factor

S668.3

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.10.002

2022-02-28；

2022-03-17

國家自然科學基金項目（No. 31960589）；海南省重大科技計劃項目（No. ZDKJ2021014）。

金順達（1996—），男，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學。*通信作者（Corresponding author）：張治禮（ZHANG Zhili），E-mail：zzl_haas@163.com；陳 哲（CHEN Zhe），E-mail：214032886@qq.com。