基于PERK信號通路介導(dǎo)的細胞凋亡及杯狀細胞破壞探討芍藥湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的作用機制

吳志強，肖玉嬌，谷麗瑤，李 旭，張佩雯，王梨力，肖金銀，羅 敏

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis， UC)主要特點為腸道黏膜非特異性炎癥[1-3]，UC目前發(fā)病機制不明，主要與免疫功能異常、腸道環(huán)境失調(diào)、遺傳、感染、心理、飲食等因素有關(guān)[4]。研究發(fā)現(xiàn)[5]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)與腸黏膜屏障受損有關(guān)，腸黏膜屏障受損是UC發(fā)生的重要原因。研究表明，UC發(fā)病與PERK通路關(guān)系密切，PERK通路被激活后，促炎因子的分泌增加，炎性細胞聚集，發(fā)生炎癥反應(yīng)[6-7]。 另外，PERK 通路是誘導(dǎo)細胞凋亡的重要途徑[8]，通路激活后C/EBP 同源蛋白(C/EBP homolo-gous protein，CHOP)增加，促進細胞凋亡[9-10]。腸道上皮組織主要由杯狀細胞(Goblet cells，GC)構(gòu)成[11-12]。相關(guān)實驗研究顯示，當(dāng)發(fā)生ERS 時，PERK通路被激活，CHOP的表達增加，加速細胞凋亡，導(dǎo)致相應(yīng)的杯狀細胞形態(tài)改變，數(shù)量減少，腸屏障受損，導(dǎo)致腸道自發(fā)性炎癥[13]。前期實驗發(fā)現(xiàn)芍藥湯能抑制UC大鼠結(jié)腸PERK信號通路的激活，起到治療UC的作用。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進一步探討芍藥湯對UC中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK信號通路介導(dǎo)細胞凋亡及杯狀細胞破壞的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 來自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司84只SPF級SD大鼠，體重180～220 g，雄性，質(zhì)量合格證號：43072721102432363，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室。本實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準(LLBH-20210910001)。

1.2 實驗藥物 芍藥湯組方：芍藥30 g，當(dāng)歸、黃連、黃芩各15 g，檳榔、木香、炙甘草各6 g，大黃9 g，肉桂5 g。中藥配方顆粒由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥顆粒藥房提供。芍藥湯中劑量按成人用量的10倍計算，即9.2 g/kg(生藥量,下同)，藥物用蒸餾水配成920 g/L，療程14 d。柳氮磺吡啶片，0.25 g/片，批號22180510。片劑研粉后過100目篩，使用時按照0.3 g/kg蒸餾水沖兌灌胃，療程14 d。

1.3 主要試劑 PAS染色套裝(G1008)、二甲苯(100092683)、2,4,6-三硝基苯磺酸、水合氯醛、4%多聚甲醛(BS)、RNA提取液(G3013)、無水乙醇(10009218)、BSA(G5001)、蘇木素染色(G1004)。

1.4 主要儀器 脫色搖床(谷歌生物，TSY-B)；脫水機(意大利DIAPATH，Donatello)；包埋機(武漢俊杰，JB-P5)；凍臺(武漢俊杰，JB-L5)；組織攤片機(浙江科迪，KD-P)；顯微鏡(日本尼康，NIKON ECLIPSE E100)；研磨儀(低溫型 Servicebio，KZ-Ⅲ-FP)；熒光定量PCR儀(Bio-rad，CFX)；超凈工作臺(蘇凈安泰，SW-CJ-1FD)；掌上離心機(谷歌生物，D1008E)；病理切片機(上海徠卡，RM2016)。

1.5 實驗動物分組和UC大鼠模型的制備[14]將SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進行編號，隨機選取14只大鼠作為空白組。提前禁食24 h，將SD大鼠用10%水合氯醛按照0.3 ml/kg進行腹腔注射麻醉，麻醉完成后，空白組大鼠從肛門用灌胃針頭推入0.9%氯化鈉溶液4 ml/kg；其余SD大鼠用三硝基苯磺酸制作UC大鼠模型[15]，造模后正常飼養(yǎng)。造模4 d后，隨機抽取1只大鼠處死并解剖，距肛緣6～10 cm結(jié)腸處肉眼可見潰瘍面，病理檢查發(fā)現(xiàn)炎性改變及典型潰瘍面時，即造模成功。造模期間，死亡7只大鼠(包括處死1只)，解剖發(fā)現(xiàn)可能為炎癥刺激導(dǎo)致結(jié)腸粘連梗阻穿孔死亡。造模完成后，將余下大鼠隨機分為模型組12只、柳氮磺吡啶組13只、芍藥湯低劑量組12只、芍藥湯中劑量組13只、芍藥湯高劑量組13只。

1.6 給藥方法 芍藥湯高劑量組：按照含生藥量18.4 g/(kg·d)灌胃；芍藥湯中劑量組：按照含生藥量 9.2 g/(kg·d)灌胃；芍藥湯低劑量組：按照含生藥量4.6 g/(kg·d)灌胃；柳氮磺吡啶組：按照 0.3 g/(kg·d)灌胃；模型組和空白組：予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃。均1次/d，連續(xù)14 d。

1.7 取 材 末次給藥后，禁食24 h，脫頸椎法處死所有大鼠后解剖，取距肛門8 cm處結(jié)腸段，沿腸系膜緣剪開腸腔，觀察大鼠結(jié)腸組織并進行評分，取病變最明顯處組織樣品均分為兩份，一份浸入40 g/L的多聚甲醛固定液中，常規(guī)石蠟包埋、切片，用于免疫組化及PAS 染色；一份投入液氮中冷凍待 RT-PCR 檢測。

1.8 觀察指標

1.8.1 大鼠疾病活動指數(shù)(DAI)：在末次灌藥后，進行DAI評分。DAI評分=(體重下降分數(shù)+大便性狀分數(shù)+便血分數(shù))/3。標準如下，0 分：大便正常，無體重減輕；1 分：大便正常，大便隱血(-)，體重下降 1%～5%；2 分：大便較軟，大便隱血(+)，體重下降 5%～10%；3 分：大便較軟，大便隱血(+)，體重下降 10%～15%；4 分：稀便，肉眼血便，體重下降>15%[15]。

1.8.2 大鼠的結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(CMDI)：CMDI 評分標準為，0分：無潰瘍及充血；1分：無潰瘍，輕度黏膜充血；2分：無潰瘍，黏膜充血；3分：小潰瘍，直徑約0～1 cm；4分：潰瘍直徑約 1～2 cm，與周圍組織無粘連；5分：潰瘍直徑約 1～2 cm，與周圍組織粘連[16]。

1.8.3 大鼠結(jié)腸組織p-PERK的蛋白表達：免疫組化法檢測大鼠結(jié)腸組織p-PERK的蛋白表達水平。石蠟切片，脫蠟，進行抗原修復(fù)，然后放入3%過氧化氫溶液中孵育，繼續(xù)在脫色搖床上晃動洗滌，進行血清封閉，加一抗、二抗，置于PBS(pH7.4)在脫色搖床上晃動洗滌。滴加DAB顯色液，Harris蘇木素復(fù)染，脫水封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集。

1.8.4 大鼠結(jié)腸黏膜組織中CHOP水平：采用RT-PCR法檢測結(jié)腸黏膜組織中CHOP水平?？俁NA抽提方法為，取勻漿管，加入RNA提取液，取100 mg組織，加入到勻漿管中。研磨，離心，加入250 μl三氯甲烷離心，然后加入異丙醇離心，提取RNA。吸除液體，加入75%乙醇洗滌沉淀離心。將離心管置于超凈臺上吹干，加入15 μl無RNA酶的水溶解孵育，檢測RNA濃度及純度。按照逆轉(zhuǎn)錄程序設(shè)定進行逆轉(zhuǎn)錄。采用 2-k 值表示該基因的相對表達水平，A=CT(目的基因，待測樣本)-CT(內(nèi)標基因，待測樣本)，B=CT(目的基因，對照樣本)-CT(內(nèi)標基因，對照樣本)，k=A-B，表達倍數(shù)=2-k。

1.8.5 大鼠結(jié)腸黏膜組織中杯狀細胞數(shù)量：采用PAS染色法檢測大鼠結(jié)腸組織GC數(shù)量。依次將切片放入二甲苯及無水乙醇中，自來水洗，切片入PAS染色液B中染色，自來水洗，蒸餾水洗。然后PAS染色液A中染色，流水沖洗，PAS染色液C染，鹽酸水溶液分化，用自來水洗及氨水返藍。最后中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件，圖片用Image J及Graphpad Prism 8.0分析。對符合正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗的，以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析，不符合正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗的，以M(P25,P75)表示，采用非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallis)；P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠DAI、CMDI評分比較 見表1。與模型組比較，柳氮磺吡啶組和芍藥湯高、中、低劑量組DAI、CMDI評分均降低(P<0.05)；柳氮磺吡啶組與芍藥湯高、中、低劑量組DAI、CMDI評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠DAI、CMDI評分比較(分)

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織p-PERK、CHOP蛋白表達比較 見表2。與空白組比較，模型組、柳氮磺吡啶組和芍藥湯高、中、低劑量組p-PERK、CHOP蛋白表達均上升(P<0.05)；與模型組比較，柳氮磺吡啶組和芍藥湯高、中、低劑量組p-PERK、CHOP蛋白表達均下降(P<0.05)；與芍藥湯低劑量組比較，柳氮磺吡啶組和芍藥湯高、中劑量組p-PERK、CHOP蛋白表達均下降(P<0.05)；柳氮磺吡啶組和芍藥湯高、中劑量組p-PERK、CHOP蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。大鼠結(jié)腸組織p-PERK陽性表達見圖1。

表2 各組大鼠結(jié)腸組織p-PERK、CHOP蛋白表達比較

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織p-PERK陽性表達(免疫組化染色，×200)

2.3 各組大鼠結(jié)腸組織杯狀細胞數(shù)量比較 見表3(圖2)。與空白組比較，模型組、柳氮磺吡啶組和芍藥湯高、中、低劑量組杯狀細胞數(shù)量均下降(P<0.05)；與模型組比較，柳氮磺吡啶組和芍藥湯高、中、低劑量組杯狀細胞數(shù)量均明顯增加(P<0.05)；與芍藥湯低劑量組比較，柳氮磺吡啶組和芍藥湯高、中劑量組杯狀細胞數(shù)量均增加(P<0.05)；柳氮磺吡啶組和芍藥湯高、中劑量組杯狀細胞數(shù)量比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

表3 各組大鼠結(jié)腸組織杯狀細胞數(shù)量比較(個)

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織杯狀細胞(PAS染色，×200)

3 討 論

前期研究發(fā)現(xiàn)，UC大鼠PERK信號通路被激活，大鼠結(jié)腸組織中p-PERK蛋白和p-PERK mRNA，p-eIF2a蛋白和p-eIF2a mRNA均增高[17]，引起核因子-κB(NF-κB)炎性通路激活，刺激促炎因子的分泌，引發(fā)UC。同時研究發(fā)現(xiàn)，PERK通路是誘導(dǎo)細胞凋亡的重要途徑[18]。腸道上皮組織是人體最活躍的自我更新組織，其中 GC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)發(fā)達，是腸黏液屏障的重要組成部分。當(dāng)UC發(fā)生時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激，PERK信號通路激活，增加CHOP的表達，誘導(dǎo)細胞凋亡，使GC數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)被破壞，腸黏膜屏障損傷。西醫(yī)治療UC的藥物主要有激素、水楊酸類、免疫抑制劑、生物制劑、抗菌藥物等，還有其他新興治療如微生態(tài)制劑、糞菌移植等。臨床實踐中，長期的藥物治療不僅使耐藥性大大增加，而且不良反應(yīng)較多，病情易復(fù)發(fā)，價格昂貴，難以作為患者的長期選擇[19]。

UC在中醫(yī)無明確病名，根據(jù)癥狀可將其歸于“久痢”“腸澼”范疇。UC多因外感時邪、飲食不節(jié)、情志內(nèi)傷、素體肝腎不足所致，病位在腸，涉及脾、肝、腎、肺諸臟[20]。芍藥湯出自《素問病機氣宜保命集》，可清熱燥濕、調(diào)氣和血，方中以黃連、黃芩為君，清熱瀉火祛濕。重用芍藥和營養(yǎng)血，行血則便膿自愈，配以當(dāng)歸養(yǎng)血止血。檳榔、木香調(diào)氣則后重自除。大黃苦寒沉降，通因通用，使?jié)駸犭S大便而下。肉桂辛熱溫通，助歸、芍行血和營，為佐助。炙甘草調(diào)和諸藥，緩急止痛。諸藥合用，共奏清熱燥濕、調(diào)和氣血之效，使便膿自愈。

在本次研究中，柳氮磺吡啶組和芍藥湯高、中、低劑量組大鼠DAI、CMDI評分較模型組降低，說明柳氮磺吡啶及芍藥湯均能減輕UC大鼠的癥狀。與模型組比較，柳氮磺吡啶組和芍藥湯高、中、低劑量組p-PERK、CHOP蛋白表達均降低，芍藥湯低劑量組p-PERK、CHOP蛋白表達降低程度相較于柳氮磺吡啶組、芍藥湯中劑量組及芍藥湯高劑量組小，說明柳氮磺吡啶及芍藥湯不同劑量組均能減少p-PERK、CHOP蛋白表達，但芍藥湯低劑量組抑制作用較低，這可能是芍藥湯藥物濃度的影響。與模型組比較，柳氮磺吡啶組和芍藥湯高、中、低劑量組杯狀細胞數(shù)量均上升，芍藥湯低劑量組杯狀細胞數(shù)量相較于柳氮磺吡啶組、芍藥湯中劑量組及芍藥湯高劑量組小。柳氮磺吡啶及芍藥湯不同劑量組均能使杯狀細胞數(shù)量增加，但芍藥湯低劑量組作用較差，從而猜測芍藥湯可能是通過控制PERK信號通路被激活，減少CHOP表達，抑制杯狀細胞凋亡，從而改善UC大鼠的癥狀和體征，這可能是芍藥湯治療UC的作用機制。