基于JAK2/STAT3信號(hào)通路探討香仁胃舒湯治療慢性非萎縮性胃炎大鼠機(jī)制

唐麗萍，曾于恒 ，王容容 ，柏正平

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長沙 410208；2.廈門市中醫(yī)院，福建 廈門 361015；3.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410006)

慢性非萎縮性胃炎(Chronic non-atrophic gastritis,CNAG)的發(fā)病率逐年攀升，當(dāng)其病情進(jìn)展至慢性萎縮性胃炎或胃潰瘍時(shí)，則可能發(fā)生癌變，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1-2]。CNAG患者可見胃黏膜充血水腫，伴有黏膜層大量漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤[3]。現(xiàn)如今臨床上仍未有理想的治療CNAG方法。中醫(yī)診治思想中的“未病先治，既病防變”在防止CNAG的發(fā)生發(fā)展有明顯的優(yōu)勢[4-5]。香仁胃舒湯由木香、砂仁、枳殼、厚樸等藥組成，諸藥合用，共宣疏肝、健脾、和胃之效。臨床上對(duì)CNAG患者用香仁胃舒湯治療取得一定成效，但其作用機(jī)制尚不明確[6]。有研究報(bào)道JAK2/STAT3信號(hào)通路在CNAG發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[7]。本研究將基于JAK2/STAT3信號(hào)通路探討香仁胃舒湯對(duì)CNAG大鼠的作用機(jī)制，以期為臨床治療CNAG提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)大鼠 選取SPF級(jí)SD雄性大鼠60只，體重約200 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-004。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 香仁胃舒湯由木香、砂仁、枳殼、厚樸、烏藥、萊菔子、雞內(nèi)金、黨參、白術(shù)、佛手、郁金、黃芩、蒲公英、白芍、沉香及炙甘草組成，購自亳州市方珍中藥飲片廠。奧美拉唑腸溶片購自江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司(國藥準(zhǔn)字H10890267)；水楊酸鈉(山東多聚化學(xué)有限公司)；氨水(濟(jì)南富浩化工有限公司)；脫氧膽酸鈉(山東科建化工有限公司)；蘇木素-伊紅(HE)試劑盒(上?？撇┤鹕锟萍加邢薰?；P-JAK2、JAK2、STAT3一抗(北京博奧森)，二抗(中杉金橋)；大鼠P-JAK2、JAK2、STAT3酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(上海研輝有限公司)；白細(xì)胞介素-8(IL-8)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)大鼠ELISA試劑盒(欣博盛生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Olympus CX23正置顯微鏡(濟(jì)南千司生物技術(shù)有限公司)；BECKMAN X-30R高速冷凍離心機(jī)(美國貝克曼)；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技有限公司)；BEP-300l電泳槽(濟(jì)南博坤科學(xué)儀器有限公司)；Tanon-n2500全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析儀(濟(jì)南千司生物技術(shù)有限公司)。

1.4 造模、分組與給藥

1.4.1 建立模型：以化學(xué)刺激聯(lián)合饑飽失常法構(gòu)建CNAG大鼠模型，大鼠每日飲用0.02%氨水溶液，聯(lián)合饑飽失常，即1 d禁止飲食，2 d過飽飲食；每周分別進(jìn)行2次、3次灌胃(20 mmol/L脫氧酸鈉溶液和2%水楊酸鈉混懸液)。于造模后30 d后隨機(jī)選取2只大鼠檢測胃黏膜組織病理學(xué)，以胃黏膜組織的病理變化判斷模型是否復(fù)制成功[8]。

1.4.2 分組與給藥：將造模成功后的40只存活大鼠隨機(jī)分為五組，分別為模型組、奧美拉唑組和香仁胃舒湯高、中、低劑量組，每組8只。另選取8只正常SD大鼠作為正常組。奧美拉唑組給予60 mg/kg奧美拉唑溶液3 ml灌胃，香仁胃舒湯高、中、低劑量組給予270、180、90 mg/kg香仁胃舒湯3 ml灌胃，1次/d，均連續(xù)灌胃4周。正常組和模型組提供等量0.9%氯化鈉溶液連續(xù)灌胃4周。用藥結(jié)束后麻醉大鼠，留取大鼠血清及胃黏膜組織觀察指標(biāo)。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 胃黏膜組織病理學(xué)變化及病理評(píng)分：取大鼠胃部組織，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，切片，用HE染色法分析其胃黏膜組織病理改變。分別將胃黏膜炎癥、炎癥變化、腸上皮化生、非典型增生及萎縮按無(0分)、輕度(1分)、中度(2分)、重度(3分)計(jì)分，將各個(gè)病理組織變化得分相加得到病理評(píng)分[9]，同時(shí)記錄胃體、胃竇黏膜組織病理評(píng)分。

1.5.2 血清P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β檢測：用ELISA測定大鼠血清P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β水平，取大鼠血清，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5.3 胃黏膜組織P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β表達(dá)：用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測大鼠胃黏膜組織P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β表達(dá)，按照BCA蛋白定量試劑盒對(duì)大鼠胃黏膜組織蛋白含量進(jìn)行測定，制備凝膠，每個(gè)孔上樣35 μg蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，在室溫條件下用5%脫脂奶粉密閉1 h，在4 ℃條件下孵育12 h一抗(濃度：JAK2和STAT3為1∶1000；P-JAK2、IL-8及IL-1β為1∶3000∶3000)，在室溫條件孵育二抗2 h，再加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)使條帶顯影。

2 結(jié) 果

2.1 香仁胃舒湯對(duì)CNAG大鼠胃黏膜組織病理學(xué)變化及病理評(píng)分影響 見表1。正常組大鼠胃黏膜組織形態(tài)正常，腺體結(jié)構(gòu)完整，分布少量炎性細(xì)胞。模型組大鼠胃黏膜組織邊界不完整，黏膜層可見明顯充血性水腫，伴有大量炎性細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤滲出；治療4周后，奧美拉唑組和香仁胃舒湯高劑量組大鼠胃黏膜組織形態(tài)基本正常，僅見少量炎性細(xì)胞滲出；香仁胃舒湯中劑量組大鼠胃黏膜組織邊界較為完整，伴有少量炎性細(xì)胞滲出；香仁胃舒湯低劑量組大鼠胃黏膜組織邊界較為完整，黏膜層可見輕度水腫，仍伴有較多炎性細(xì)胞滲出(圖1)。與正常組比較，模型組胃體及胃竇黏膜組織病理評(píng)分均升高(P<0.05)；與模型組比較，奧美拉唑組和香仁胃舒湯高、中、低劑量組評(píng)分均升高(P<0.05)；與奧美拉唑組比較，香仁胃舒湯中、低劑量組評(píng)分均升高(P<0.05)。

表1 各組大鼠胃黏膜組織病理評(píng)分比較(分)

A：正常組；B：模型組；C：奧美拉唑組；D：香仁胃舒湯低劑量組；E：香仁胃舒湯中劑量組；F：香仁胃舒湯高劑量組

2.2 香仁胃舒湯對(duì)大鼠血清P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β水平的影響 見表2。與正常組比較，模型組、奧美拉唑組和香仁胃舒湯各劑量組血清P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，奧美拉唑組和香仁胃舒湯各劑量組JAK2、STAT3、IL-1β水平均降低(P<0.05)；與奧美拉唑組比較，香仁胃舒湯中、低劑量組P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β水平均升高(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β水平比較

2.3 香仁胃舒湯對(duì)胃黏膜組織P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β蛋白表達(dá)水平的影響 見表3(圖2)。與正常組比較，模型組、奧美拉唑組和香仁胃舒湯高、中、低劑量組胃黏膜組織P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β蛋白表達(dá)較高(P<0.05)；與模型組比較，奧美拉唑組和香仁胃舒湯高、中、低劑量組胃黏膜組織P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β蛋白表達(dá)較低(P<0.05)；與奧美拉唑組比較，香仁胃舒湯中、低劑量組胃黏膜組織P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β蛋白表達(dá)較高(P<0.05)。

表3 各組大鼠胃黏膜組織P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

A：正常組；B：模型組；C：奧美拉唑組；D：香仁胃舒湯低劑量組；E：香仁胃舒湯中劑量組；F：香仁胃舒湯高劑量組

3 討 論

CNAG的病因病機(jī)復(fù)雜，尚未完全清楚其發(fā)病機(jī)制[10]。臨床上可見胃黏膜充血水腫，伴有黏膜層大量漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，治療效果不理想。中醫(yī)診治思想中的“未病先治，既病防變”在防止CNAG的發(fā)生發(fā)展有明顯的優(yōu)勢。中醫(yī)藥在治療CNAG方面有一定優(yōu)勢[11]。針對(duì)CNAG的發(fā)病絕大多數(shù)中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為：飲食不節(jié)、素體虛弱、外邪、情志不暢等可致臟腑功能紊亂[12]。其病機(jī)為脾胃受損致胃失和降，脾失健運(yùn)，脾胃納運(yùn)、升降的功能失調(diào)，氣機(jī)郁滯，日久可表現(xiàn)為“氣滯”“濕熱”“血瘀”等虛實(shí)夾雜病理征象，從而使病情逐步惡化[13]。“脾胃升降失調(diào)”為CNAG及其癌前病變的發(fā)病根本，“邪在胃脘、久釀成毒”是CNAG及其癌前病變發(fā)生發(fā)展的重要因素，“脾虛絡(luò)阻、虛實(shí)夾雜”為CNAG及其癌前病變的基本病機(jī)[14]。故脾失健運(yùn)是CNAG病機(jī)演變的關(guān)鍵所在。脾胃虛弱，肝氣不和，升降失調(diào)，治宜疏肝解郁，健脾和胃。香仁胃舒湯中黨參、白術(shù)健脾益氣；木香、砂仁、枳殼、厚樸等行氣解郁；白芍、烏藥行氣柔肝止痛；沉香行氣降逆；黃芩、蒲公英清熱解毒；炙甘草補(bǔ)脾和胃，調(diào)和諸藥。諸藥合用，一升一降共奏調(diào)節(jié)氣機(jī)之功，行氣和胃[15]。

本研究通過構(gòu)建大鼠模型，分別以不同劑量香仁胃舒湯給藥。結(jié)果顯示，香仁胃舒湯高劑量組能降低大鼠胃體及胃竇黏膜組織病理評(píng)分、血清P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β水平及胃黏膜組織P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β蛋白表達(dá)，起到調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡的作用。研究表明香仁胃舒湯可在一定程度上修復(fù)CNAG大鼠胃黏膜損傷，治療效果良好。JAKs是一類蛋白酪氨酸酶，JAK2是其家族中的一員。STAT3在較多癌癥中呈高表達(dá)。JAK2/STAT3信號(hào)通路可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡及免疫調(diào)節(jié)等，參與多種腸道炎性疾病及腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其抑制劑可有效減緩疾病的發(fā)展，具有良好的臨床療效[16]。IL-1β為趨化因子家族中的一種細(xì)胞因子，不僅有較強(qiáng)的抑酸作用，還能促進(jìn)IL-6的產(chǎn)生，是誘發(fā)CNAG的關(guān)鍵因素[17]。IL-8作為一種強(qiáng)力中性粒細(xì)胞趨化因子，IL-1β誘發(fā)的炎性細(xì)胞浸潤很有可能是通過誘導(dǎo)以IL-8為代表的趨化因子而產(chǎn)生的[18]。IL-8可通過激活和趨化中性粒細(xì)胞使機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步使胃黏膜組織受損[19]。在病理狀態(tài)下，大量IL-8、IL-1β與細(xì)胞膜上受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)JAK2大量聚集同時(shí)引起磷酸化，從而生成P-JAK2。P-JAK2通過激活細(xì)胞質(zhì)內(nèi)STAT3，使STAT3進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，繼而發(fā)生磷酸化，生成P-STAT3刺激下游信號(hào)因子，如IL-8、IL-1β等生成，介導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡，加重炎性細(xì)胞浸潤，加速炎癥發(fā)展[20]。

綜上所述，香仁胃舒湯對(duì)CNAG有一定的治療效果，能改善胃黏膜組織損傷程度，降低P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β水平。其機(jī)制可能與抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路開放有關(guān)。中藥復(fù)方湯劑是通過多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮治療作用，香仁胃舒湯所用藥味較多，故需在日后的研究中進(jìn)行中藥組分研究，明確香仁胃舒湯治療CNAG的具體機(jī)制。