線蟲模型在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中的應(yīng)用

呂 婧，李 瑤，吳 珂（通信作者），龔靖媛，姚 健，袁欣蕾，賈 茹

（廣州南方學(xué)院云康醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院 廣東 廣州 510000）

神經(jīng)退行性疾?。╪eurodegenerative diseases, NDs）是以神經(jīng)元的功能和結(jié)構(gòu)漸進(jìn)性損害，甚至神經(jīng)元死亡，而導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)一系列功能障礙的一類疾病的統(tǒng)稱，包括阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease, AD）、帕金森?。≒arkinson’s disease, PD）、亨廷頓氏?。℉untington disease, HD）、肌萎縮側(cè)索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis, ALS）等，其中AD 和PD 分別為第1 和第2 大類神經(jīng)退行性疾病，主要發(fā)生于中、老年人群。世界范圍內(nèi)，NDs 發(fā)病率日益增多，隨著我國人口老齡化的加重，我國已成為NDs 發(fā)病人數(shù)最多、發(fā)病速度最快的國家。NDs 患者在晚期基本喪失自理能力，離不開家人的陪伴和照顧，對社會造成巨大影響和沉重負(fù)擔(dān)，但是現(xiàn)階段仍未開發(fā)出有針對性的藥物，已有的的藥物只能暫時減緩癥狀，不能治愈或阻止疾病進(jìn)展，且NDs 發(fā)病機(jī)制尚未明確。為了解NDs 研究的最新進(jìn)展，確定對中藥華桑相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究中所用的線蟲模型，本文對線蟲在NDs 實(shí)驗(yàn)研究中常用的模型進(jìn)行綜述。

1.線蟲模型在實(shí)驗(yàn)研究中的優(yōu)勢

1963 年，南非研究員SYDNEY BRENNER 首次將秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans, C. elegans）作為模式生物使用，至今已有50 余年的歷史，其優(yōu)秀的生物學(xué)特點(diǎn)和低廉的價格奠定了其作為研究神經(jīng)系統(tǒng)理想動物模型的地位。C.elegans 分雌雄同體和雄性2 種類型，可自體受精，也可雙性繁殖，通體透明，生存于土壤之中，以細(xì)菌為食，其結(jié)構(gòu)簡單、生命周期短，易于培養(yǎng)，包含多種與人類相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)，如乙酰膽堿、5-羥色胺、多巴胺、谷氨酸和神經(jīng)肽等，且其在神經(jīng)元中的合成、儲存和代謝等過程與哺乳動物具有高度相似性。C.elegans 也具有與大多數(shù)哺乳動物同源的離子通道基因。1998 年，線蟲的全基因組測序完成，成為第1 個完成全基因組測序的多細(xì)胞生物，推動了快速基因組學(xué)功能的研究，促進(jìn)了目前廣泛使用的突變體線蟲daf-2、daf-9、daf-16 等的出現(xiàn)。目前研究者主要將突變體線蟲與野生型N2 線蟲（可發(fā)生自體繁殖）進(jìn)行對照研究。通過線蟲模型，研究人員可以進(jìn)行細(xì)胞編程死亡和遺傳控制、同源異形基因群（Hox-c）、神經(jīng)生物學(xué)等研究。線蟲的研究熱點(diǎn)主要集中于可能導(dǎo)致疾病發(fā)生的幾種蛋白、基因模型，一般可以通過化學(xué)誘導(dǎo)或基因突變兩種方法獲取。

2.線蟲模型在AD 中的應(yīng)用

AD 是一種進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，常見臨床癥狀包括記憶障礙、失語、失認(rèn)、失用及性格行為改變等。由德國神經(jīng)學(xué)家ALOIS ALZHEIMER 于1906 年首次在科學(xué)會議上報道。時至今日，該疾病的發(fā)病原因和機(jī)制仍不清楚，當(dāng)前已做出的AD 發(fā)病機(jī)制猜想包括β-淀粉樣蛋白（β-amyloid, Aβ）級聯(lián)學(xué)說（胞外Aβ 的聚集形成老年斑）、tau 蛋白學(xué)說（tau 的過度磷酸化和錯誤折疊導(dǎo)致大腦神經(jīng)纖維纏結(jié)）、神經(jīng)膠質(zhì)的過度激活、突觸功能障礙、神經(jīng)炎癥、應(yīng)激及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的破壞等。

2.1 Aβ 模型

家族性阿爾茨海默病患者腦組織細(xì)胞外過度產(chǎn)生的Aβ 可形成斑塊導(dǎo)致突觸功能障礙和神經(jīng)元破壞，繼而在大腦皮質(zhì)、海馬以及前腦等部位產(chǎn)生一系列病理改變，β 和γ 分泌酶可以降解β 淀粉樣前體蛋白（amyloid precurso protein, APP）形成Aβ，研究表明AD 主要是由于APP 基因突變導(dǎo)致Aβ 過度產(chǎn)生所致，然而腦組織Aβ 過度產(chǎn)生和異常沉積的發(fā)病機(jī)制不能完全解釋闡明AD 大部分散發(fā)病例。C.elegans 在試驗(yàn)過程中需轉(zhuǎn)入人類的APP 基因，但是由于其缺乏產(chǎn)生分泌物的基因，所以無法產(chǎn)生細(xì)胞外Aβ，只能建立Aβ 基因模型，觀察細(xì)胞內(nèi)Aβ 表達(dá)。METAXAS 等在此基礎(chǔ)之上，利用銅或鋅濃度失衡，觸發(fā)線蟲表達(dá)Aβ，為我們采用新的誘導(dǎo)條件進(jìn)行線蟲造模提供了理論基礎(chǔ)。LINK 等利用轉(zhuǎn)基因線蟲的DNA 微陣列分析表明，幾種與人類同源的應(yīng)激相關(guān)基因被上調(diào)，其中以Aβ 晶狀體蛋白基因（CRYAB）和腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白（TNFAIPI）基因這2 種為主，這些基因在去世的AD 患者腦中也被上調(diào)，說明即使C.elegans 是無脊椎動物，無法分泌Aβ，不能表現(xiàn)出與AD 相似的病理特征，我們也可以將C.elegans 細(xì)胞內(nèi)Aβ表達(dá)與AD病理相關(guān)聯(lián)。LACKIE等在C.elegans Aβ 錯誤折疊模型中，下調(diào)熱休克蛋白（Hsp）家族里的Hsp90 及其伴侶基因，導(dǎo)致Aβ 毒性增加。

2.2 tau 模型

在AD 治療中，以Aβ 為靶點(diǎn)研發(fā)的藥物均以失敗告終，因此，研究者開始越來越關(guān)注AD 患者另一典型病理變化—微管相關(guān)蛋白tau 異常過度磷酸化。tau 蛋白的過度磷酸化促進(jìn)tau 的過度聚集，繼而形成神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles, NFTs），具有神經(jīng)細(xì)胞毒性。ZANIER 等在創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injuries,TBI）試驗(yàn)中，利用C.elegans 作為生物傳感器來檢測TBI 產(chǎn)生tau 蛋白的致病作用，線蟲的運(yùn)動依賴有效的神經(jīng)肌肉傳遞，對淀粉樣蛋白的毒性異常敏感，通過對野生型和ptl-1（tau 蛋白同源蛋白）敲除線蟲的對比，證明tauTBI（創(chuàng)傷性腦損傷引起tau 蛋白異常形式）損害C.elegans 的運(yùn)動活動和突觸傳遞，并支持tauTBI 在TBI 的長期后果中的致病作用。BENBOW 等構(gòu)建了1 種轉(zhuǎn)基因C.elegans 模型，該模型同時表達(dá)人Aβ1-42 肽和tau 蛋白，通過引入tau 蛋白病理基因抑制因子，部分功能得到改觀，表明Aβ 和tau 在驅(qū)動AD 神經(jīng)元功能障礙中具有協(xié)同作用。隨著研究深入，線蟲模型也不再局限于原始的Aβ 與tau 模型，而是進(jìn)一步建立了雙轉(zhuǎn)基因模型，而該復(fù)合模型較上述單模型有明顯優(yōu)勢。

3.線蟲模型在PD 中的應(yīng)用

PD 是第2 大常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，于1817 年被英國醫(yī)生JAMES PARKINSON 首次報道提出，其以運(yùn)動障礙、靜止時手抖、肌強(qiáng)直和運(yùn)動遲緩為主要臨床表現(xiàn)，可伴有嗅覺障礙、睡眠障礙等，該病以中腦黑質(zhì)致密部多巴胺（dopamine, DA）能神經(jīng)元變性死亡缺失為主要病理改變?，F(xiàn)階段研究者認(rèn)為PD 發(fā)病機(jī)制是遺傳因素、環(huán)境因素以及人口老齡化共同作用的結(jié)果，同時線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激等在PD 的發(fā)病過程中扮演重要角色。

3.1 α-Syn 模型

α-Synuclein（α-Syn）包涵體形成是PD 的特征性病理變化，作為構(gòu)成大腦路易小體的最主要蛋白，α-Syn 在家族性和特發(fā)性PD 的發(fā)病中起著重要的作用。α-Syn 于腸道中產(chǎn)生，它們產(chǎn)生后從腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system, ENS）向中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system, CNS）逐漸擴(kuò)散，對大腦造成破壞，目前還不清楚這一過程在分子水平上是如何調(diào)控的。理論上，如果能夠清除腸道中的α-Syn 就可能改變帕金森病進(jìn)程，但是目前仍無特定藥物可產(chǎn)生理想效果。研究人員已就PD 建立了相應(yīng)的α-Syn 線蟲模型，在該線蟲模型身上表達(dá)α-Syn 后，施以不同腸道菌群并觀察其對α-Syn 表達(dá)的影響。AHN 等發(fā)現(xiàn)δ-分泌酶（天冬酰胺內(nèi)肽酶，AEP）切割N103 處的α-Syn 和N368 處的Tau，并介導(dǎo)它們的活化和從腸道到大腦的逆行傳播，觸發(fā)與路易小體和運(yùn)動功能障礙相關(guān)的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元丟失。α-Syn N103 和Tau N368 相互作用，在PD 患者的腸道和大腦中高度升高。查倩等使用魚藤酮誘導(dǎo)PD 線蟲模型，發(fā)現(xiàn)魚藤酮可致轉(zhuǎn)基因線蟲zcIs9;otIs181 線粒體損傷，破壞線粒體穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致線蟲死亡及多巴胺能神經(jīng)元功能的退化，使用多器官腫瘤綜合征（Von Hippel-Lindau, VHL）的抑制劑VH298，可以降低線蟲病死率，表明VH298 可以通過保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元，進(jìn)而有效改善PD 線蟲模型運(yùn)動行為的異常情況。

3.2 G2019S LRRK2 模型

在遲發(fā)性家族PD 中，LRRK2 基因突變是最常見的原因。目前研究表明，LRRK2 基因在多種細(xì)胞過程中的作用包括囊泡運(yùn)輸、內(nèi)吞作用、自噬等，但該基因的其他生物學(xué)功能仍有待進(jìn)一步闡明。在家族性PD 中，LRRK2突變主要通過激酶依賴性機(jī)制在誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷。LRRK2 突變中，G2 019 S 是最常見的，由于實(shí)驗(yàn)性哺乳動物模型成本高昂，而C.elegans 的價格低廉，且優(yōu)點(diǎn)突出，在研究遲發(fā)性家族PD 時，研究人員利用線蟲構(gòu)建了G2 019 S LRRK2 模型，采用該線蟲模型研究特定的生命調(diào)節(jié)途徑，通過核糖核酸干擾（RNA interference,RNAi）、構(gòu)建AGE-1 轉(zhuǎn)基因和采用RT-PCR 技術(shù)，證明了由LRRK2（G2 019 S）誘導(dǎo)的年齡依賴性神經(jīng)元損傷受不同的壽命延長途徑的廣泛調(diào)節(jié)，延長的壽命通常與多巴胺能神經(jīng)保護(hù)相關(guān)，調(diào)節(jié)壽命延長的多種遺傳途徑具有神經(jīng)保護(hù)作用。

4.展望

神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病始終是人們關(guān)注的熱門話題，而線蟲模型因其獨(dú)特的優(yōu)勢成為該類型疾病模式動物之一，隨著相關(guān)研究人員所建立的與線蟲相關(guān)模型的種類越來越多，神經(jīng)退行性疾病的研究會進(jìn)入更深層次，研究者可以在此基礎(chǔ)上進(jìn)行多方位、多靶點(diǎn)、多系統(tǒng)的研究，以確認(rèn)發(fā)病原因和機(jī)制，為特效藥物的開發(fā)打下基礎(chǔ)。相信在不久的將來，神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病能夠取得突破性進(jìn)展，減輕患者及家庭的痛苦和負(fù)擔(dān)。