火把花根多糖對運動疲勞小鼠AMPK/mTOR信號通路的影響

杜偉，吳思瀾，楊雪，陳慧，葉蘭△

運動疲勞是一種正常的、休息后可緩解的生理現(xiàn)象，表現(xiàn)為機體運動能力下降［1］。但部分人群運動疲勞后通過休息未能緩解，遷延6個月及以上成為慢性疲勞綜合征。研究顯示，荷蘭多達(dá)1/3的成年人可診斷為慢性疲勞綜合征［2］。我國慢性疲勞綜合征患病率為12.54%［3］。目前沒有應(yīng)對疲勞的公認(rèn)方案，藥物干預(yù)是重要的舉措之一［4］。因此，篩選并開發(fā)具有抗疲勞作用的藥物對于改善疲勞人群生活質(zhì)量具有現(xiàn)實意義。運動疲勞可激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳動物雷帕霉素蛋白（mTOR）信號通路，進(jìn)而調(diào)控糖代謝，增強機體運動能力［5-6］。既往研究表明，從黃芪、黃精、枸杞等常見中藥提取的多糖具有抗運動疲勞作用，機制包括改善葡萄糖代謝，降低運動代謝物堆積等［7］。AMPK/mTOR信號通路成為中藥多糖抗運動疲勞的潛在通路。近期有研究認(rèn)為，多糖中所含的單糖種類越豐富，其抗運動疲勞活性可能越強［8］?；鸢鸦ǜ嗵菑幕鸢鸦ㄋ幉奶崛～@得，具有單糖組成豐富的特征，目前有關(guān)火把花根多糖抗疲勞作用的相關(guān)研究較少。本研究基于AMPK/mTOR信號通路探究火把花根多糖抗運動疲勞的作用機制，為運動疲勞的治療提供更多的候選藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF級ICR雄性小鼠24只，體質(zhì)量18～22 g，購自斯貝福（北京）生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2019-0010。動物飼養(yǎng)于明暗交替（12 h/12 h），溫度20～26℃，濕度40%～70%環(huán)境中，自由攝取水和飼料。動物使用符合重慶市中藥研究院倫理要求。

1.1.2 火把花根多糖制備 火把花藥材為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物昆明山海棠干燥根，購自重慶市中藥研究院門診部。稱取火把花藥材粉碎，參照文獻(xiàn)［9］，以水提醇沉法獲取火把花根多糖（醇沉淀物），冷凍干燥，得黃褐色火把花根多糖樣品。經(jīng)苯酚-濃硫酸法檢測多糖含量為54%，經(jīng)親水作用色譜-蒸發(fā)光散射檢測法（HILIC-ELSD）分析火把花根多糖樣品由7種單糖聚合形成，單糖組成比例為甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖∶巖藻糖（1.9∶2.8∶17.0∶15.2∶35.2∶25.3∶2.6）?；鸢鸦ǜ嗵菢悠酚眉兓芙?，使質(zhì)量濃度為20 g/L，作為本研究的火把花根多糖受試液。

1.1.3 單糖混合物制備 參照火把花根多糖的單糖組成與溶解方法，制成質(zhì)量濃度為20 g/L的單糖混合物受試液。甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖和巖藻糖購自阿拉丁試劑有限公司；葡萄糖、半乳糖購自索萊寶生物科技有限公司。

1.1.4 試劑與儀器 三酰甘油（TG）和血糖（GLU）檢測試劑購自貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司；TRIzol試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司；病理糖原染色（PAS）試劑盒購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；疲勞轉(zhuǎn)棒儀購自成都泰盟科技有限公司；AU480全自動生化分析儀購自美國貝克曼庫爾特有限公司；Mias-2000病理圖象處理系統(tǒng)購自四川大學(xué)圖象處理國家研究所；CFX Connect Real-Time System購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 小鼠按隨機數(shù)字表法分為靜止對照組、疲勞對照組、疲勞+單糖組、疲勞+火把花根多糖組，每組6只。疲勞+火把花根多糖組給予火把花根多糖受試液，疲勞+單糖組給予單糖混合物受試液，靜止對照組和疲勞對照組給予純化水，各組均按20 mL/kg每日灌胃給藥1次，連續(xù)14 d。

1.2.2 一般狀況觀察 給藥期間每天觀察1次動物行為活動、腺體分泌、呼吸、排泄物等狀況；給藥第1、4、7、10、13天稱小鼠體質(zhì)量，記錄飼料和飲水的給予量，給藥第2、5、8、11、14天記錄飼料和飲水的剩余量，使用前1天給予量減去后1天剩余量計算攝食量和飲水量。

1.2.3 運動能力檢測 除靜止對照組外，其余各組小鼠均于給藥后1 h進(jìn)行運動能力檢測。檢測方法為疲勞轉(zhuǎn)棒與力竭游泳。（1）疲勞轉(zhuǎn)棒：采用文獻(xiàn)［10］的方法，分別在給藥第6、13天將各組小鼠置于轉(zhuǎn)棒疲勞儀上（15 r/min），先進(jìn)行小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練3次（每次2 min，間隔10 min），然后休息30min開始正式實驗，記錄小鼠運動性疲勞后從轉(zhuǎn)棒上跌落的時間，即小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒時間。（2）力竭游泳：采用文獻(xiàn)［11］的方法，小鼠分6次在給藥第14天完成力竭游泳，每次每組取1只小鼠，將其尾根部負(fù)荷5%體質(zhì)量鉛皮后置于同一游泳箱中（水深不少于30 cm，水溫25℃±1.0℃），當(dāng)小鼠力竭時會沉至水面下，小鼠沉至水面下7 s時，記錄每只小鼠游泳結(jié)束時間，即小鼠力竭游泳時間。

1.2.4 生化指標(biāo)檢測 小鼠力竭游泳后即眼眶取血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，采用AU480全自動生化分析儀檢測血清中TG和GLU濃度。

1.2.5 組織病理學(xué)檢查 小鼠力竭游泳取血后，安樂死處死小鼠，快速采集腓腸肌。左側(cè)腓腸肌經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、包埋、切片、貼片后制備石蠟病理切片。采用HE染色觀察左側(cè)腓腸肌病理變化；按照PAS試劑盒說明書操作，觀察左側(cè)腓腸肌糖原著色。

1.2.6 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測AMPK/mTOR信號通路與葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（GLUT-4）mRNA表達(dá) 取20 mg右側(cè)腓腸肌組織，加入TRIzol試劑提取總RNA，測定RNA濃度，并進(jìn)行擴增反應(yīng)。取1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20μL；反應(yīng)條件為37℃15 min，85℃5 s。PCR引物由南京金瑞斯生物科技公司合成，見表1。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)。通過檢測解鏈曲線來驗證引物的特異性。40個循環(huán)后分析熔解曲線及Ct值，每個樣本重復(fù)3次，取平均 值。采 用2-ΔΔCt法 計 算AMPK、mTOR、GLUT-4經(jīng) 內(nèi) 參GAPDH標(biāo)化后的相對表達(dá)量。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 火把花根多糖對小鼠一般狀況的影響 給藥期間未見各組小鼠行為活動、腺體分泌、呼吸、排泄物等異常。給藥第13天，與靜止對照組比較，疲勞+火把花根多糖組的體質(zhì)量減輕（P＜0.05）。余各時間點各組體質(zhì)量、攝食量、飲水量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2～4。

Tab.2 Comparison of body mass of mice at different time points between the four groups表2各組小鼠不同給藥時間體質(zhì)量的比較（n=6，g，±s）

Tab.2 Comparison of body mass of mice at different time points between the four groups表2各組小鼠不同給藥時間體質(zhì)量的比較（n=6，g，±s）

＊P＜0.05；a與靜止對照組比較，P＜0.05。

組別靜止對照組疲勞對照組疲勞+單糖組疲勞+火把花根多糖組F第1天20.1±0.6 20.1±0.8 20.1±0.7 20.1±0.7 0.003第4天24.0±1.2 24.1±1.4 24.1±1.0 23.5±1.1 0.357第7天27.3±1.9 27.4±2.0 27.3±1.6 25.8±1.5 1.141第10天30.0±2.3 30.1±2.2 29.1±1.4 27.5±1.9 2.119第13天31.4±2.0 31.4±2.4 29.8±1.4 28.1±1.7a 4.192＊

Tab.3 Comparison of food intake of mice at different time points between the four groups表3各組小鼠不同給藥時間攝食量的比較（n=6，g，±s）

Tab.3 Comparison of food intake of mice at different time points between the four groups表3各組小鼠不同給藥時間攝食量的比較（n=6，g，±s）

均P＞0.05。

組別靜止對照組疲勞對照組疲勞+單糖組疲勞+火把花根多糖組F第1天9.50±1.25 9.37±0.70 9.40±1.04 9.50±0.95 0.014第4天12.00±0.90 11.73±0.70 12.33±0.91 12.50±0.89 0.483第7天12.42±0.80 12.77±0.91 12.60±0.79 12.37±1.12 0.115第10天12.67±0.78 12.73±0.74 12.68±1.12 12.50±1.48 0.026第13天12.00±0.82 12.17±0.35 11.80±0.66 12.03±0.60 0.174

Tab.4 Comparison of water consumption of mice at different time points between the four groups表4各組小鼠不同給藥時間飲水量的比較（n=6，g，±s）

Tab.4 Comparison of water consumption of mice at different time points between the four groups表4各組小鼠不同給藥時間飲水量的比較（n=6，g，±s）

均P＞0.05。

組別靜止對照組疲勞對照組疲勞+單糖組疲勞+火把花根多糖組F第1天11.6±0.6 11.7±0.9 12.0±0.7 12.1±0.2 0.354第4天14.8±0.8 15.2±0.4 15.2±0.4 14.8±0.9 0.313第7天16.1±0.6 15.9±0.4 16.2±0.7 15.8±0.5 0.297第10天14.9±0.9 15.0±0.2 15.0±0.7 14.9±0.9 0.015第13天13.3±0.7 13.1±0.4 13.2±0.9 13.4±0.3 0.173

2.2 火把花根多糖對小鼠運動能力的影響 與疲勞對照組比較，疲勞+火把花根多糖組在給藥第6天疲勞轉(zhuǎn)棒時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；在給藥第13天，疲勞轉(zhuǎn)棒時間顯著增加（P＜0.05）。在給藥第14天，疲勞+火把花根多糖組力竭游泳時間增加（P＜0.05）。疲勞+單糖組小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒時間和力竭游泳時間與疲勞對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表5。

Tab.5 Comparison of fatigue rotating rod and weightbearing swimming time of mice between the three groups表5各組小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒與力竭游泳時間的比較（min，±s）

Tab.5 Comparison of fatigue rotating rod and weightbearing swimming time of mice between the three groups表5各組小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒與力竭游泳時間的比較（min，±s）

＊＊P＜0.01；a與疲勞對照組比較，P＜0.05。

組別疲勞對照組疲勞+單糖組疲勞+火把花根多糖組F n 666疲勞轉(zhuǎn)棒時間第6天2.74±1.10 2.66±1.05 4.12±0.96 3.737第13天2.63±1.45 2.84±1.76 10.58±2.36a 34.268＊＊力竭游泳時間10.2±3.4 14.0±3.3 24.2±4.8a 20.512＊＊

2.3 火把花根多糖對小鼠TG和GLU的影響 與靜止對照組比較，疲勞對照組、疲勞+單糖組、疲勞+火把花根多糖組小鼠血清中TG均上調(diào)（P＜0.05），但后3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與靜止對照組比較，疲勞對照組、疲勞+單糖組、疲勞+火把花根多糖組小鼠血清中GLU均降低（P＜0.05）；與疲勞對照組比較，疲勞+火把花根多糖組GLU降低（P＜0.05）。見表6。

Tab.6 Comparison of serum levels of TG and GLU between the four groups of mice表6各組小鼠血清TG和GLU比較（mmol/L，±s）

Tab.6 Comparison of serum levels of TG and GLU between the four groups of mice表6各組小鼠血清TG和GLU比較（mmol/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與靜止對照組比較，b與疲勞對照組比較，P＜0.05。

組別靜止對照組疲勞對照組疲勞+單糖組疲勞+火把花根多糖組F n6666 TG 0.67±0.11 1.08±0.36a 1.05±0.13a 1.06±0.15a 5.111＊＊GLU 6.33±1.52 3.35±1.11a 2.75±1.08a 1.40±0.40ab 21.405＊＊

2.4 火把花根多糖對小鼠組織病理學(xué)的影響HE染色顯示各組小鼠腓腸肌未見明顯異常。PAS染色可見疲勞對照組與疲勞+單糖組腓腸肌著色略深，而疲勞+火把花根多糖組著色最深。見圖1。

Fig.1 Pathological observation of gastrocnemius muscle in each group圖1各組小鼠腓腸肌病理觀察

2.5 火把花根多糖對AMPK/mTOR信號通路與GLUT-4的影響 與靜止對照組和疲勞對照組比較，疲勞+火把花根多糖組小鼠腓腸肌中AMPK、mTOR、GLUT-4 mRNA均上調(diào)（P＜0.05），見表7。

Tab.7 The relative expression levels of AMPK,mTOR and GLUT-4 mRNA in gastrocnemius muscle of mice after weight-bearing swimming in each group表7各組小鼠力竭游泳后腓腸肌AMPK、mTOR和GLUT-4 mRNA的比較 （n=6，±s）

Tab.7 The relative expression levels of AMPK,mTOR and GLUT-4 mRNA in gastrocnemius muscle of mice after weight-bearing swimming in each group表7各組小鼠力竭游泳后腓腸肌AMPK、mTOR和GLUT-4 mRNA的比較 （n=6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與靜止對照組比較，b與疲勞對照組比較，P＜0.05。

組別靜止對照組疲勞對照組疲勞+單糖組疲勞+火把花根多糖組F AMPK mRNA 1.13±0.59 1.34±0.57 1.51±0.51 2.20±0.82ab 3.181＊mTOR mRNA 1.18±0.62 1.14±0.90 1.57±0.87 2.62±0.95ab 4.007＊GLUT-4 mRNA 1.09±0.50 1.13±0.83 1.08±0.28 2.90±0.58ab 14.381＊＊

3 討論

運動性疲勞的研究從19世紀(jì)初開始，至今一直是運動醫(yī)學(xué)研究的熱點［12］。目前的研究表明，多種因素與運動能力相關(guān)，如體質(zhì)量增加、能量攝入不足、能源物質(zhì)耗竭均可能加速機體運動疲勞［13-14］。通常通過食物限制和力竭游泳產(chǎn)生的運動疲勞小鼠模型來評估藥物的抗疲勞作用［15］。

本研究未采取食物限制措施，所有小鼠均可自由攝取食物和飲水。小鼠攝食和飲水?dāng)?shù)據(jù)表明，火把花根多糖對小鼠攝食和飲水無影響，排除了小鼠能量攝入差異的可能?，F(xiàn)有的研究支持多糖類化合物通過調(diào)控糖脂代謝而降低小鼠體質(zhì)量［16］。筆者認(rèn)為疲勞+火把花根多糖組小鼠體質(zhì)量的降低屬火把花根多糖藥理效應(yīng)。除力竭游泳實驗外，本研究還設(shè)計了小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒實驗。力竭游泳實驗方法與抑郁癥模型制備時采用的強迫游泳實驗類似，多次力竭游泳可能引起小鼠精神紊亂［17］，而未見疲勞轉(zhuǎn)棒實驗引起小鼠精神紊亂的報道，所以力竭游泳實驗在抗疲勞研究中通常被設(shè)計至實驗觀察終點作單次觀察?；鸢鸦ǜ嗵墙o藥第6天未見疲勞轉(zhuǎn)棒時間的顯著變化，而在給藥第13天可見疲勞轉(zhuǎn)棒時間較疲勞對照組顯著增加，表明火把花根多糖發(fā)揮抗疲勞作用需要一個持續(xù)的用藥周期。在給藥第14天，觀察到疲勞+火把花根多糖組力竭游泳時間顯著增加，進(jìn)一步證實了火把花根多糖抗疲勞的作用。

既往對多糖的認(rèn)識，涉及抗運動疲勞、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等功效［18］。機體運動時需要消耗大量的能源物質(zhì)，如糖類、脂肪和蛋白質(zhì)［19］。因此，多糖抗疲勞的研究廣泛集中于探討其對能量代謝的調(diào)節(jié)作用。本研究檢測了血清TG、GLU，PAS染色觀察了腓腸肌糖原的著色。TG是與脂肪代謝密切相關(guān)的指標(biāo)，GLU、糖原是糖代謝的重要指標(biāo)。研究結(jié)果顯示，火把花根多糖對血清TG無調(diào)控作用，而對血清GLU和PAS染色糖原的調(diào)控明顯，表明火把花根多糖調(diào)節(jié)糖代謝是發(fā)揮抗疲勞作用的重要途徑。

基于AMPK信號通路闡釋藥物抗疲勞機制是現(xiàn)行的主流趨勢，研究普遍認(rèn)為AMPK對能量變化較為敏感，在急性運動中，骨骼肌收縮誘發(fā)AMPK信號通路激活以適應(yīng)運動引起的全身代謝反應(yīng)，從而維持能量平衡［6，20］。大部分觀點認(rèn)為AMPK通路一旦被激活，會增加細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)如葡萄糖的攝取，刺激分解代謝，抑制合成代謝，從而以負(fù)反饋的方式重建能量平衡，與腺苷三磷酸（ATP）消耗有關(guān)；小部分觀點則認(rèn)為肌肉AMPK通路激活后維持細(xì)胞能量平衡并不一定會消耗ATP［21］。mTOR是生長因子和營養(yǎng)信號的整合器，整合上游的信號（如AMPK）進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長［22］。GLUT-4跨膜轉(zhuǎn)運葡萄糖，在AMPK激活后扮演“搬運工”角色，促進(jìn)能量平衡［23］。在本研究中，疲勞+火把花根多糖組小鼠AMPK、mTOR、GLUT-4與疲勞對照組比較顯著上調(diào)，可見火把花根多糖抗疲勞機制可能與調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號通路有關(guān)。

多糖為大分子化合物，由10個以上單糖通過苷鍵聚合形成，無法直接入血。有研究認(rèn)為多糖通常在機體內(nèi)被降解為寡糖或單糖實現(xiàn)對機體的作用［16］。因此本研究按照火把花根多糖的單糖組成設(shè)置了疲勞+單糖組。與疲勞對照組比較，疲勞+單糖組小鼠各指標(biāo)均未見顯著差異，表明單糖混合物不能發(fā)揮顯著抗疲勞作用，說明火把花根多糖抗疲勞作用可能與多種單糖的苷鍵聚合相關(guān)。而具體的苷鍵聚合特征有待進(jìn)一步闡明。

綜上，火把花根多糖具有抗運動疲勞作用，其機制可能與調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號通路調(diào)控的糖代謝有關(guān)。