骨質(zhì)疏松hub基因篩選驗證及互作miRNA預測

張亦朦，張宇新△，田發(fā)明

骨質(zhì)疏松癥是以骨量下降和骨組織微結(jié)構(gòu)退化為特征的全身性骨骼疾病。成骨、破骨代謝平衡是維持骨穩(wěn)態(tài)的關鍵因素，隨著年齡增長，間充質(zhì)干細胞向成骨分化減少，引起骨質(zhì)疏松［1］。早期診斷和干預是防止骨質(zhì)疏松向椎體或髖關節(jié)骨折進展的關鍵。因而尋找敏感、特異的生物學標志物，明確其對間充質(zhì)干細胞分化、代謝的調(diào)控機制已成為老年性骨質(zhì)疏松癥診療亟待解決的問題。微小RNA（miRNA）是一類小片段的單鏈非編碼RNA［2］。已有研究證實miRNA廣泛參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和代謝等過程，與骨質(zhì)丟失等骨骼疾病密切相關［3］。但以往研究主要集中于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的miRNA表達譜分析和骨質(zhì)疏松與骨關節(jié)炎等疾病之間的分子機制。針對老年性骨質(zhì)疏松癥診斷標志物研究較少。此外，miRNA參與細胞分化調(diào)控過程的信號通路較復雜，具體調(diào)節(jié)機制尚未明確。本研究利用生物信息分析技術(shù)篩選與老年性骨質(zhì)疏松癥相關的hub基因，并研討核心miRNA參與細胞分化調(diào)控的分子機制，為老年性骨質(zhì)疏松癥診斷提供潛在的生物學標志物，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料 從GEO數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下載GLP570平臺的GSE35956基因芯片。該數(shù)據(jù)集包含5例健康者［男1例，女4例，平均年齡（57.6±8.5）歲］和5例骨質(zhì)疏松癥患者［均為女性，平均年齡（86.2±5.3）歲］的骨髓間充質(zhì)干細胞樣本。通過股骨頭置換術(shù)獲得股骨頭及骨髓，從中分離出骨髓間充質(zhì)干細胞。

1.2 實驗動物 選取SPF級3～4月齡（青年組）和18～20月齡（老年組）的C57BL/6小鼠各6只，2組均為雌性5只，雄性1只。實驗小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（京）：2020-0004，動物飼養(yǎng)于華北理工大學實驗中心動物房。

1.3 主要試劑與儀器 α-MEM培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司；10%胎牛血清購自上海李記生物科技有限公司；胰蛋白酶-EDTA購自北京索萊寶科技有限公司；青霉素-鏈霉素溶液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR（qPCR）試劑盒購自蘭杰柯科技有限公司；ARKTIK96定性PCR儀和PIKOREAL96實時熒光定量PCR儀購自美國Thermo Scientific公司。

1.4 差異表達基因篩選及富集分析 利用R語言（版本3.6.3）的Limma包對GEO數(shù)據(jù)庫下載的GSE35956基因芯片進行差異表達基因（differentially expressed genes，Degs）分析，差異表達的基因篩選條件為P＜0.05和|log2fold change|＞1.5，通過ggplot2包對差異表達的結(jié)果進行可視化處理，利用complexheatmap包繪制差異表達前20位的基因熱圖。利用DAVID 6.8（Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery 6.8）數(shù)據(jù)庫對得到的Degs進行基因本體（gene ontology，GO）富集和KEGG通路分析［4-5］，GO功能富集和KEGG通路分析均以P＜0.05作為篩選標準。

1.5 篩選hub基因 利用String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）［6］和Cytoscape軟件對差異基因進行網(wǎng)絡拓撲分析，并繪制PPI網(wǎng)絡圖，通過MCODE插件，以MCODE scores＞4，Max depth=100，node score cutoff=0.3和k-score=2為標準確定核心模塊。通過cytohubba內(nèi)的5種算法（degree、bottleneck、radiality centrality、stress centrality、closeness centrality）來篩選hub基因［7］，并對篩選出的核心模塊及hub基因進行富集分析。使用Targetscan數(shù)據(jù)庫對得到的hub基因進行miRNA互作分析，預測與hub基因相關的miRNA及其之間的關系［8］，并通過funrich數(shù)據(jù)庫（3.1.3版本）對獲得的miRNA進行GO和KEGG富集分析。

1.6 組織細胞培養(yǎng) 小鼠頸椎脫臼處死后，取雙側(cè)股骨、脛骨，眼科剪剪開兩端，用α-MEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素）沖洗髓腔，移液槍輕柔吹打至均勻。1 000 r/min離心5 min，棄上清液后加入培養(yǎng)液重懸細胞，細胞懸液鋪于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2加濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞生長至培養(yǎng)瓶壁80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化，制成細胞懸液后傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)至第1代細胞用于后續(xù)實驗。

1.7 qPCR驗證 收集老年組和青年組小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，PBS沖洗2遍，加入1 mL Trizol試劑提取總RNA，取1μL測定其濃度，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA后進行qPCR反應。引物序列見表1。反應體系為20μL，包含SYBR Green qPCR Mix 10μL、上下游引物（10μmol）各1μL、cDNA模板2μL和RNase free H2O 6μL。反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，40個循環(huán)。每個樣本重復3次。采用2-ΔΔCt法計算目的基因經(jīng)內(nèi)參GAPDH標化后的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用Graphpad Prism 9軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Degs篩選及富集分析 在骨質(zhì)疏松癥患者骨髓間充質(zhì)干細胞樣本中共篩選出1 081個Degs，其中982個表達上調(diào)，99個表達下調(diào)，見圖1。GO富集分析結(jié)果顯示，Degs參與了質(zhì)膜黏附分子介導的同型細胞黏附、神經(jīng)嵴細胞遷移、骨化等生物過程，Degs在鈣離子結(jié)合、神經(jīng)肽受體和主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex、MHC）Ⅱ類受體活性及細胞因子活性等分子功能中富集程度較高；Degs主要富集到細胞外空間、質(zhì)膜等細胞組分。KEGG通路分析表明，Degs主要集中在神經(jīng)活性配體-受體相互作用、Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子（janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT）信號通路和谷氨酸能突觸等通路中，這些通路跟骨質(zhì)疏松癥密切相關，見圖2。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

2.2 蛋白互作網(wǎng)絡構(gòu)建及hub基因篩選 將Degs導入String進行分析并利用Cytoscape構(gòu)建PPI網(wǎng)絡圖，得到586個節(jié)點和1 262條蛋白-蛋白互作線網(wǎng)絡。依據(jù)蛋白互作分析結(jié)果，通過5種算法篩選出8個hub基因：瘦素（Leptin，LEP）、淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶（lymphocyte-specific protein tyrosine kinase，LCK）、WT1轉(zhuǎn) 錄 因 子（WT1 transcription factor，WT1）、SRY-Box轉(zhuǎn) 錄 因 子10（SRY-box transcription factor 10，SOX10）、整合素β2（integrin subunit beta 2，ITGB2）、白蛋白（albumin，ALB）、膽囊收縮素（cholecystokinin，CCK）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白7（bone morphogenetic protein 7，BMP7）。利 用Targetscan數(shù)據(jù)庫鑒定出6個hub基因與105個預測miRNA存在互作關系（以2為閾值），其中，LEP、LCK、WT1、ITGB2、ALB和BMP7與105個miRNA存在調(diào)控關系，見圖3。

2.3 預測miRNA的富集分析結(jié)果6個hub基因相關的miRNA主要富集到信號轉(zhuǎn)導、細胞通訊等生物過程，在轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性和細胞質(zhì)分子功能和細胞組分中富集程度高。預測miRNA參與了蛋白多聚糖Syndecan介導的信號轉(zhuǎn)導、腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（TNFrelated apoptosis-inducing ligand、TRAIL）信號通路和酪氨酸激酶受體（receptor tyrosine kinases，erbb）信號網(wǎng)絡等代謝通路調(diào)控，見圖4。

Fig.1 The volcano plot and expression profiles of Degs圖1差異基因火山圖及表達水平分析

2.4 小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞原代提取和培養(yǎng)結(jié)果 小鼠原代細胞換液后，鏡下可見均勻鋪滿瓶底的細胞，4 d后可見細胞呈多級生長，鏡下可見散在高折射細胞為分裂期細胞，7 d后觀察約40%～50%細胞呈梭形多級生長，可見部分細胞聚集呈簇狀生長。10 d左右細胞融合率可達90%，可進行傳代培養(yǎng)，見圖5。

Fig.2 GO and KEGG annotations of Degs圖2差異基因的GO和KEGG富集分析

Fig.3 Key genes-miRNA interaction network diagram of differential genes圖3核心基因與miRNA互作網(wǎng)絡圖

Fig.4 GO and KEGG annotations of predicted miRNA圖4預測miRNA的GO和KEGG富集分析

Fig.5 The cultivation of bone marrow mesenchymal stem cells(×40)圖5小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)（×40）

2.5 2組小鼠hub基因的表達水平比較qPCR結(jié)果顯示，與青年組相比，老年組骨髓間充質(zhì)干細胞的BMP7、CCK、ITGB2、SOX10基 因 上 調(diào) 表 達（P＜0.01），見表2。

Tab.2 Comparison of expression levels of BMP7,CCK,ITGB2 and SOX10 genes between the two groups of mice表2 2組小鼠BMP7、CCK、ITGB2、SOX10基因表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of expression levels of BMP7,CCK,ITGB2 and SOX10 genes between the two groups of mice表2 2組小鼠BMP7、CCK、ITGB2、SOX10基因表達水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01。

組別青年組老年組t BMP7 1.00±0.00 4.24±0.31 23.373＊＊CCK 1.00±0.00 3.93±0.38 17.340＊＊ITGB2 1.00±0.00 2.08±0.25 9.650＊＊SOX10 1.00±0.00 2.92±0.46 9.257＊＊

3 討論

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，骨質(zhì)疏松癥已成為常見疾病之一，患病率隨著年齡的增長而增加。目前，關于骨質(zhì)疏松癥基因組學、表觀遺傳學等分子機制研究已成熱點。miRNA是細胞和組織衰老過程的調(diào)節(jié)因子，其表達水平與心血管疾病、阿爾茨海默病等老年疾病密切相關［9］。本研究在健康者、骨質(zhì)疏松癥患者及不同月齡小鼠中均鑒定到差異miRNA，表明miRNA在老年性骨質(zhì)疏松癥的診療和預后領域具有潛在價值。

GO和KEGG富集分析可以深入解析關鍵基因的調(diào)控功能和代謝通路。Rachner等［10］發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥患者miRNA靶基因主要參與蛋白域特異性結(jié)合、酶結(jié)合、細胞連接、蛋白質(zhì)定位和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運等過程。本研究發(fā)現(xiàn)，Degs主要參與黏附分子介導的同型細胞黏附、鈣離子結(jié)合等功能，定位于細胞外空間、質(zhì)膜等位置；黏附分子介導的信號可以影響細胞的生長、分化及細胞功能。同時，KEGG通路分析結(jié)果表明，叉頭框蛋白O（fork-head box protein O，F(xiàn)OXO）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等信號通路同樣受到靶基因調(diào)控，推測JAK-STAT、MAPK等信號通路失調(diào)可能是骨細胞分化失衡的重要原因，可能在骨老化過程中發(fā)揮作用。hub基因可能由于改變表達水平來影響間充質(zhì)干細胞之間黏附信號，進而影響間充質(zhì)干細胞的增殖、向成骨分化和凋亡。

LEP是一種由白色脂肪細胞分泌的蛋白質(zhì)，在循環(huán)中可以和大腦中瘦素受體結(jié)合。目前LEP既可直接作用于骨髓間充質(zhì)干細胞，促進其向成骨細胞分化［11］，還可以通過影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)下的神經(jīng)肽Y和Y2受體調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)［12］。Bai等［13］通過KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)LEP在神經(jīng)活性配體-受體相互作用、JAK-STAT信號通路等通路中均有富集，其中JAKSTAT信號通路可以通過調(diào)節(jié)核因子-κB受體激活因 子 配 體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）破骨細胞的分化成熟而影響骨穩(wěn)態(tài)。LCK編碼的蛋白質(zhì)屬于蛋白酪氨酸激酶Scr家族，該家族的蛋白具有細胞轉(zhuǎn)化和細胞內(nèi)的信號傳遞的功能［14-15］。非受體酪氨酸激酶可以通過影響RANK來調(diào)節(jié)破骨細胞的分化，還可以與整合素αvβ3結(jié)合來影響細胞骨架的生成［16］。另有研究表明，ITGB2參與細胞表面黏附通路，是介導成骨細胞和破骨細胞前體接觸及黏附的重要分子［17］，主要調(diào)節(jié)骨髓基質(zhì)細胞和破骨前體細胞的黏附［18］。相關研究顯示ITGB2基因缺失的小鼠體現(xiàn)出成骨缺陷［19］。本研究中qPCR驗證結(jié)果也支持上述觀點。

BMP7編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族的分泌配體，通過影響Runt相關的轉(zhuǎn)錄因子2（runt related transcription factor2，Runx2）來調(diào)節(jié)干細胞的成骨分化［20］。有研究發(fā)現(xiàn)，BMP7可以增加成骨活性，促進骨折愈合，并且在骨折模型骨折端的骨組織中發(fā)現(xiàn)BMP7的表達量增加［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，老年組BMP7 mRNA表達量高于青年組，推測可能由于反饋性調(diào)節(jié)導致老年組中BMP7表達升高。SOX10屬于SOX轉(zhuǎn)錄因子家族之一，與胚胎發(fā)育、神經(jīng)嵴分化和周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關，具有誘導脂肪來源的干細胞向軟骨細胞方向分化的功能［22］，并且可通過促進神經(jīng)嵴細胞成骨分化來參與骨損傷后的修復［23］。ALB是代謝、血漿滲透壓的編碼蛋白［24］。WT1是一種抑癌基因，在骨髓異常增生綜合征患者中呈高表達，WT1可能通過調(diào)控細胞周期來調(diào)控髓系細胞的分化和發(fā)育［25］。目前還沒有直接證據(jù)證明ALB、WT1基因與骨質(zhì)疏松有直接關系，相關分子機制還需進一步研究。

綜上所述，本研究通過GEO芯片對骨質(zhì)疏松癥的各種基因進行篩選，找出6個hub基因，并預測相關的miRNA，為減低骨質(zhì)疏松癥的功能障礙的研究提供了全新的視角。本研究篩選出的hub基因和miRNA有可能成為骨質(zhì)疏松癥的早期診斷標志物和重要靶點，為骨質(zhì)疏松癥的診斷和治療提供新的目標點和研究方向。本研究結(jié)果對骨質(zhì)疏松癥后續(xù)的試驗研究提供了理論依據(jù)。