miR-196b-5p減輕大鼠脊髓損傷后組織水腫和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化機(jī)制探討

孔俊東，李堅(jiān)，張強(qiáng)強(qiáng)，李剛，蔡家駿，范仲凱△

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后繼發(fā)性水腫是SCI的重要病理過程，通常在SCI后2 h出現(xiàn)，在3 d內(nèi)達(dá)到高峰［1-2］。水通道蛋白4（AQP4）是主要的選擇性水通道蛋白，主要表達(dá)于神經(jīng)元和血管周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突中，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)水腫的形成過程［3］。SCI后，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增生形成反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞（RA），表達(dá)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）并參與膠質(zhì)瘢痕的形成，阻礙SCI后脊髓修復(fù)過程［4］。既往研究發(fā)現(xiàn)，抑制SCI后AQP4的表達(dá)除能夠減輕脊髓水腫外，還能降低GFAP的表達(dá)，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化增生［5-6］。因此，脊髓水腫與星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增生之間可能存在一定的聯(lián)系，但具體機(jī)制尚不明確。微小RNA（miR）在多種生理病理活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用［7-8］。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-196b-5p可通過下調(diào)AQP4的表達(dá)抑制胃癌的進(jìn)展［9］，但鮮見在SCI領(lǐng)域中miR-196b-5p與AQP4關(guān)系的研究。本研究旨在探討miR-196b-5p對(duì)大鼠SCI后水腫和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增殖的影響，以期為SCI的治療尋求新方法、新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 成年雌性SPF級(jí)SD大鼠78只，體質(zhì)量180～220 g，由錦州醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SYXK（遼）2019-0007］提供。miR-196b-5p模擬物（agomiR-196b-5p）/miR-196b-5p陰 性 對(duì) 照（antagomiR-196b-5p）購自蘇州吉瑪生物科技有限公司，使用DEPC處理水溶解，濃度60 nmol/L。重組質(zhì)粒AQP4野生型/突變型（AQP4 WT/MUT）和miR-196b-5p模擬物/陰性對(duì)照（miR-196b-5p mimicis/mimicis control）由湖南普拉特澤公司構(gòu)建。PrimeScriptTMRT reagent with gDNA Eraser、TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ購自日本Takara公司；miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；兔源AQP4多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，兔源GFAP、SCI 4周的生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43（GAP-43）單克隆抗體，鼠源增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）單克隆抗體，HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗購自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；鼠源β-actin單克隆抗體購自美國(guó)Santa Cruz公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Western blot預(yù)制膠、超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒均購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 模型建立及分組18只成年雌性SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)（Sham）組及SCI 1、2、3、5及7 d組，每組3只。另外60只成年雌性SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為Sham組、SCI組、agomiR-196b-5p干預(yù)（miRNA）組和miR-196b-5p陰性對(duì)照（NC）組，每組15只，每組再使用隨機(jī)數(shù)字表法分為5個(gè)亞組，每個(gè)亞組3只。Sham組僅行椎板去除術(shù)，SCI組、miRNA組和NC組均采用改良后大鼠脊髓擠壓裝置誘導(dǎo)大鼠中度脊髓損傷，擠壓時(shí)大鼠出現(xiàn)后肢痙攣性顫動(dòng)和尾巴痙攣性擺動(dòng)，麻醉蘇醒后呈雙下肢弛緩性癱瘓視為造模成功［10］。在誘導(dǎo)SCI成功后，miRNA組和NC組使用微量注射器分別向大鼠鞘內(nèi)注射agomiR-196b-5p與antagomiR-196b-5p，20μL/d，連續(xù)3 d，Sham組和SCI組注射等量生理鹽水。大鼠出現(xiàn)擺尾反射，回抽出現(xiàn)腦脊液視為微量注射器插入髓鞘內(nèi)。2只大鼠造模后死亡，1只大鼠未成功誘導(dǎo)SCI被剔除并及時(shí)補(bǔ)齊相應(yīng)分組。術(shù)后每日腹腔注射青霉素8萬單位預(yù)防感染，連續(xù)3 d。人工協(xié)助大鼠排尿，早晚各1次，直至大鼠排尿反射恢復(fù)。所有動(dòng)物飼養(yǎng)溫度為（24±2）℃，濕度40%～50%，12 h/12 h光暗交替，食物、水分充足供應(yīng)。實(shí)驗(yàn)大鼠的模型操作和術(shù)后護(hù)理遵循中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和倫理委員會(huì)規(guī)定。

1.2.2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用TargetScan（https://www.targetscan.org）和miRDB（http://mirdb.org）數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)AQP4的上游調(diào)控基因，通過篩選發(fā)現(xiàn)miR-196b-5p是AQP4的上游調(diào)控基因。使用雙熒光素酶檢測(cè)報(bào)告檢測(cè)miR-196b-5p與AQP4之間的靶向關(guān)系。miR-196b-5p mimics與AQP4 WT或AQP4 MUT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，并以mimics control為對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h后，多功能酶標(biāo)儀分別檢測(cè)螢火蟲熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度和海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以兩熒光素酶相對(duì)熒光強(qiáng)度表示，重復(fù)3次。

1.2.3 RT-qPCR檢 測(cè)SCI后 脊 髓miR-196b-5p與AQP4mRNA表達(dá)Sham組及SCI后1、2、3、5及7 d組大鼠以損傷點(diǎn)為中心取長(zhǎng)度約為1 cm的脊髓組織，采用低溫勻漿儀勻漿30 s，Trizol試劑提取各樣本總RNA，檢測(cè)miR-196b-5p及AQP4在不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平。miR-196b-5p和AQP4分別使用第一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)cDNA模板。miRNA RT-qPCR反應(yīng)體系：2×miRcute Plus miRNA PreMix 10 μL，上、下游引物各0.4μL，cDNA 1μL，DEPC處理水8.6μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min；94℃變性20 s，60℃退火延伸34 s，40個(gè)循環(huán)。U6作為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參。miR-196b-5p及U6引物由廣州銳博生物公司合成（序列保密）。AQP4 RT-qPCR反應(yīng)體系：2×SYBR SuperMix Plus 10 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA 1μL，DEPC處理水5μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參。AQP4及GAPDH引物由武漢塞維爾公司合成，相對(duì)表達(dá)水平以2-ΔΔCt法計(jì)算，引物序列見表1。

1.2.4 干濕質(zhì)量法檢測(cè)脊髓組織含水量 術(shù)后3 d，收集大鼠以損傷點(diǎn)為中心的長(zhǎng)度為1 cm的新鮮脊髓組織，用高靈敏度分析天平（METFLERAE26）稱質(zhì)量（濕質(zhì)量），隨后放入80℃恒溫烘箱中烘干48 h，連續(xù)稱質(zhì)量直至質(zhì)量穩(wěn)定不再變化（干質(zhì)量），每個(gè)樣本連續(xù)測(cè)量3次，取平均值。按埃利奧特（Ellicot）公式計(jì)算組織含水量：含水量=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)AQP4、GFAP、PCNA和GAP-43表達(dá)水平 術(shù)后3 d，以損傷點(diǎn)為中心，取長(zhǎng)度約為1 cm的脊髓組織。加入適量的RIPA后依次經(jīng)過剪碎、組織破碎、細(xì)胞破碎、靜止30 min、4℃12 000 r/min離心20 min后取蛋白上清液，按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書步驟測(cè)定各樣本的蛋白濃度。每組蛋白上樣量30 μg，在室溫進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，1%BSA室溫封閉2 h，TBST洗膜后加入稀釋好的一抗AQP4（1∶1 000）、GFAP（1∶1 000）、PCNA（1∶1 000）、β-actin（1∶1 500）并于4℃冰箱孵育過夜，次日洗膜后，加入對(duì)應(yīng)二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。術(shù)后4周，以同樣方法取得脊髓組織并檢測(cè)GAP-43表達(dá)水平。

1.2.6 HE染色檢測(cè)大鼠脊髓空洞大小 術(shù)后4周取脊髓，脊髓縱向切片在去離子水中洗滌5 min，依次進(jìn)行二甲苯浸泡，梯度乙醇脫水，蘇木精染色2 min，伊紅染色15 s，中性樹膠封片。染色圖像使用Image J軟件測(cè)量空洞相對(duì)大小。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間的比較采用單因素方差分析，組間多重比較用Tukey檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-196b-5p可調(diào)控AQP4基因表達(dá) 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照質(zhì)粒比較，miR-196b-5p mimics與AQP4 3'-UTR野生型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞熒光素酶活性下降（P＜0.01）；而miR-196b-5p與AQP4 3'-UTR突變型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性與對(duì)照質(zhì)粒差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

2.2 各組脊髓miR-196b-5p與AQP4 mRNA表達(dá)水平比較 與Sham組比較，SCI后各時(shí)間點(diǎn)miR-196b-5p相對(duì)表達(dá)水平降低（均P＜0.05）。與Sham組比較，SCI 1 d、2 d、3 d和5 d組AQP4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高（均P＜0.05）；與SCI 2 d組比較，SCI 1 d、3 d、5 d及7 d組AQP4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05），見表2。

Fig.1 Prediction and validation of the targeting relationship between AQP4 and miR-196b-5p圖1 AQP4與miR-196b-5p靶向關(guān)系的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

Tab.2 Expression levels of miR-196b-5p and AQP4 in groups of rats after SCI表2 SCI后各組大鼠miR-196b-5p與AQP4表達(dá)變化（n=3，±s）

Tab.2 Expression levels of miR-196b-5p and AQP4 in groups of rats after SCI表2 SCI后各組大鼠miR-196b-5p與AQP4表達(dá)變化（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與SCI 1 d組比較，c與SCI 2 d組比較，P＜0.05；表3、4同。

組別Sham組SCI 1 d組SCI 2 d組SCI 3 d組SCI 5 d組SCI 7 d組F miR-196b-5p 1.00±0.15 0.01±0.00a 0.02±0.00a 0.07±0.01a 0.11±0.02a 0.11±0.02a 119.063＊＊AQP4 mRNA 1.00±0.18 13.96±1.30a 25.61±2.04ab 16.15±0.78ac 10.79±1.49ac 3.84±0.64c 156.183＊＊

2.3 各組miR-196b-5p、AQP4及脊髓組織含水量比較 與Sham組比較，SCI組、miRNA組和NC組AQP4 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平、脊髓含水量增加，而SCI組及NC組miR-196b-5p相對(duì)表達(dá)水平降低（均P＜0.05）；與miRNA組比較，SCI組和NC組AQP4 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平、脊髓含水量增加，而miR-196b-5p表達(dá)水平降低（均P＜0.05）；SCI組與NC組各指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3、圖2A。

2.4 各組GFAP、PCNA及GAP-43蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 與Sham組比較，SCI組、miRNA組及NC組GFAP、PCNA和GAP-43蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高（均P＜0.05）；與SCI組及NC組比較，miRNA組GFAP、PCNA相對(duì)表達(dá)水平降低，GAP-43相對(duì)表達(dá)水平升高（均P＜0.05）；SCI組與NC組各蛋白相對(duì)表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2B、C，表4。

2.5 miR-196b-5p促 進(jìn)SCI后 脊 髓 修 復(fù)Sham組脊髓結(jié)構(gòu)完整，無損傷空洞，SCI組、miRNA組及NC組出現(xiàn)明顯脊髓空洞，見圖3。SCI組、miRNA組、NC組脊髓空洞相對(duì)面積分別為（1.00±0.04）、（0.49±0.03）及（1.00±0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=338.227，P＜0.05），miRNA組脊髓空洞面積小于SCI組和NC組（P＜0.05），SCI組及NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab.3 Changes of miR-196b-5p,AQP4 and water content after treatment in four groups of rats表3干預(yù)后各組大鼠miR-196b-5p、AQP4及脊髓含水量變化 （n=3，±s）

Tab.3 Changes of miR-196b-5p,AQP4 and water content after treatment in four groups of rats表3干預(yù)后各組大鼠miR-196b-5p、AQP4及脊髓含水量變化 （n=3，±s）

組別Sham組SCI組miRNA組NC組F miR-196b-5p 1.00±0.15 0.15±0.02a 0.86±0.03b 0.25±0.06ac 80.655＊＊AQP4 mRNA 1.00±0.31 24.12±2.26a 9.66±0.30ab 25.53±4.14ac 74.657＊＊AQP4 0.78±0.16 2.67±0.37a 1.86±0.26ab 2.68±0.30ac 30.444＊＊脊髓含水量（%）70.17±0.18 74.18±0.23a 72.31±0.17ab 74.38±0.20ac 299.531＊＊

Fig.2 Effects of AQP4,GFAP,PCNA and GAP-43 protein expression levels after SCI in four groups of rats圖2各組大鼠SCI后對(duì)AQP4、GFAP、PCNA及GAP-43蛋白表達(dá)水平的影響

Tab.4 Comparison of relative expression levels of GFAP,PCNA and GAP-43 protein between the four groups of rats表4各組大鼠GFAP、PCNA及GAP-43蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

Tab.4 Comparison of relative expression levels of GFAP,PCNA and GAP-43 protein between the four groups of rats表4各組大鼠GFAP、PCNA及GAP-43蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

組別Sham組SCI組miRNA組NC組F GFAP 1.00±0.12 1.99±0.21a 1.48±0.01ab 1.88±0.11ac 34.792＊＊PCNA 1.00±0.18 16.95±1.42a 11.29±1.02ab 16.18±0.91ac 164.079＊＊GAP-43 1.00±0.03 1.72±0.16a 2.78±0.06ab 1.81±0.04ac 194.353＊＊

3 討論

MiRNA廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)［11］。大量研究表明，多種miRNA與SCI后繼發(fā)性損傷有關(guān)，如通過鞘內(nèi)注射miR-125a-5p可以有效保護(hù)SCI后大鼠血-脊髓屏障功能并促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)［12］；miR-29b可以減弱缺血誘導(dǎo)的血腦屏障破壞和腦水腫形成，減少缺血后梗死體積［13］；miR-126可以影響新血管形成，從而促進(jìn)大鼠脊髓損傷后脊髓組織和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)［14］。miRNA一般通過與靶基因3'-UTR區(qū)結(jié)合而沉默靶基因［15］。本研究通過TargetScan和miRDB數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，AQP4 3'-UTR區(qū)與miR-196b-5p存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，并通過雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證了AQP4與miR-196b-5p之間的靶向關(guān)系。通過RT-qPCR發(fā)現(xiàn)，SCI后miR-196b-5p表達(dá)下降而AQP4表達(dá)升高，表明miR-196b-5p可能能夠抑制AQP4的表達(dá)，這與Li等［9］的研究相符。

Fig.3 Results of spinal cord repair after SCI in four groups of rats(HE,×50)圖3各組大鼠SCI后脊髓損傷修復(fù)結(jié)果（HE，×50）

SCI后繼發(fā)性水腫可迅速引起髓鞘內(nèi)壓力增大，局部組織缺血壞死，加劇神經(jīng)元的損傷和運(yùn)動(dòng)功能的喪失［16-17］。AQP4參與血-脊髓屏障及中樞神經(jīng)系統(tǒng)水腫的形成，是SCI誘導(dǎo)水腫的主要參與者，抑制AQP4的表達(dá)能有效降低SCI后脊髓水腫程度［3］。另有研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的miR-196b-5p同樣能抑制GFAP與PCNA的表達(dá)，這表明過表達(dá)的miR-196b-5p不僅能夠減輕脊髓水腫，還能抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化增生［18］。本研究亦證實(shí)，過表達(dá)的miR-196b-5p能在基因和蛋白水平抑制AQP4的表達(dá)，并降低脊髓含水量。星形膠質(zhì)細(xì)胞活化形成RA參與膠質(zhì)瘢痕的形成，通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)刺激炎癥細(xì)胞因子和具有神經(jīng)毒性的活性氧等物質(zhì)產(chǎn)生和釋放，阻礙神經(jīng)元軸突延伸和神經(jīng)修復(fù)，因此，抑制膠質(zhì)瘢痕的形成對(duì)SCI的恢復(fù)具有重要意義［19-20］。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)的miR-196b-5p能上調(diào)神經(jīng)元軸突再生的標(biāo)志蛋白GAP-43的表達(dá)并減小脊髓空洞的面積，這表明過表達(dá)的miR-196b-5p能夠促進(jìn)SCI后脊髓組織修復(fù)和神經(jīng)元軸突再生。AQP4參與SCI后定位于星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性水腫，并通過抑制細(xì)胞色素氧化酶5A（cytochrome coxidase，COX5A）的表達(dá)，而影響星形膠質(zhì)細(xì)胞能量代謝［21］。因此，筆者推測(cè)AQP4可能是通過介導(dǎo)能量代謝的方式使星形膠質(zhì)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)，促使其向RA轉(zhuǎn)變并增殖，形成膠質(zhì)瘢痕組織，阻礙神經(jīng)元的再生。

綜上所述，過表達(dá)的miR-196b-5p可通過靶向抑制AQP4的表達(dá)，減輕SCI后脊髓水腫和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化增生，減少膠質(zhì)瘢痕的形成，促進(jìn)SCI后神經(jīng)元再生和組織修復(fù)，提示miR-196b-5p治療SCI有較大潛力。然而，對(duì)于AQP4與星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的聯(lián)系，miRNA在臨床工作中如何應(yīng)用，其治療的有效性、安全性等問題還有待進(jìn)一步研究。