電針足三里、內(nèi)關(guān)穴抑制mTOR信號(hào)通路緩解大鼠腦缺血損傷作用的研究

張游，靳子言，尹亞龍，吳新貴

缺血性腦卒中作為一種世界范圍內(nèi)的高殘疾率和高死亡率的疾病，嚴(yán)重威脅著公眾健康［1］。缺血性腦卒中后腦局灶性血液循環(huán)障礙會(huì)導(dǎo)致炎癥、氧自由基的產(chǎn)生、興奮性毒性、自噬、壞死和凋亡等一系列病理改變，從而造成嚴(yán)重的神經(jīng)損傷［2］。自噬是受損、變性、衰老和失去功能的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物和細(xì)胞器自我降解的過(guò)程，在細(xì)胞代謝中起關(guān)鍵作用［3］。研究表明，適當(dāng)?shù)淖允杉せ羁梢酝ㄟ^(guò)降解受損蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)新生蛋白質(zhì)合成，抑制細(xì)胞凋亡、壞死，從而改善缺血性腦損傷［4］。近年來(lái)，雷帕霉素靶蛋白（mTOR）作為調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵因子，已成為治療缺血性卒中的新靶點(diǎn)［5］。抑制mTOR的磷酸化可誘導(dǎo)自噬反應(yīng)發(fā)生，從而改善腦缺血損傷，起到神經(jīng)保護(hù)作用［6］。電針（electroacupuncture，EA）是通過(guò)現(xiàn)代電子技術(shù)與中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的結(jié)合來(lái)進(jìn)行針灸治療，越來(lái)越多的證據(jù)表明其對(duì)缺血性腦卒中有療效［7］，但具體機(jī)制尚不明確。本研究旨在探討EA對(duì)缺血性卒中大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，并分析EA通過(guò)mTOR信號(hào)通路改善缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)功能障礙的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 鹽酸艾司氯胺酮注射液（江蘇恒瑞公司），鹽酸甲苯噻嗪（Sigma公司），異氟烷（深圳瑞沃德公司）；線栓（廣州佳靈公司，硅膠頭直徑0.36～0.37 mm），針灸針（Φ 0.25 mm×1.3 mm、Φ0.25 mm×2.5 mm，蘇州市華佗醫(yī)療用品有限公司），SDZ-Ⅱ型電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；2，3，5氯化三苯基四氮唑（TTC）粉末、蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（北京solarbio公司），尼式染液（武漢碧云天公司）；兔源抗AKT抗體、抗mTOR抗體、抗磷酸化mTOR（pmTOR）抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司），山羊抗兔二抗（Elabscience公司）；Trizol總RNA提取試劑盒，熒光定量PCR試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及LCB3、Beclin-1、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白X（Bax）、β-actin引物（武漢塞維爾生物科技有限公司）；全自動(dòng)冰凍研磨儀（廣州露卡公司），垂直電泳系統(tǒng)、熒光定量PCR儀（Bio-rad公司），正置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組SPF級(jí)健康雄性SD大鼠75只，8～9周齡，平均體質(zhì)量（280±50）g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（桂）2020-0003。SD大鼠由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房代養(yǎng)，規(guī)律攝水、攝食，環(huán)境溫度（24±4）℃，平均相對(duì)濕度55%，明暗交替12 h，實(shí)驗(yàn)方案得到廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)的許可。

將75只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)（Sham）組、大腦中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型3 d組、EA干預(yù)3 d組、MCAO模型7 d組、EA干預(yù)7 d組，每組15只。

1.3 造模方法MCAO大鼠模型采用Longa線栓法誘導(dǎo)制備。大鼠手術(shù)前禁食過(guò)夜（12～14 h），然后通過(guò)腹腔注射氯胺酮（60 mg/kg）+甲苯噻嗪（8 mg/kg）進(jìn)行麻醉；將大鼠仰臥固定，常規(guī)消毒后沿頸部正中線切開(kāi)，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）、頸外動(dòng)脈（ECA）。在距ICA分叉5 mm處插入線栓，沿ICA向上平行推進(jìn)致右側(cè)大腦中動(dòng)脈（MCA）血流阻斷，結(jié)扎ICA和CCA以固定線栓，止血、消毒后逐層縫合切口。術(shù)中及術(shù)后使用電熱毯維持大鼠肛溫在37℃。Sham組大鼠實(shí)施同樣的手術(shù)操作但不插入線栓和結(jié)扎血管。

1.4 模型成功標(biāo)準(zhǔn)MCAO大鼠模型評(píng)估參考Bederson 4分5級(jí)法［8］：0分，無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀；1分，左側(cè)肢體疼痛刺激后收縮現(xiàn)象消失，輕度神經(jīng)功能缺損；2分，向左傾倒或轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)功能缺損；3分，向病灶對(duì)側(cè)跌倒，提尾時(shí)左上肢屈曲抱胸，不能向前伸直，重度神經(jīng)功能缺損；4分，不能自行行走，意識(shí)水平下降。大鼠手術(shù)蘇醒后24 h內(nèi)選擇Bederson評(píng)分為1～3分的大鼠入組，剔除評(píng)分為0分、4分的SD大鼠。

1.5 干預(yù)方法 造模術(shù)后，EA干預(yù)組通過(guò)電子針療儀對(duì)雙側(cè)肢體的足三里（ST36）和內(nèi)關(guān)（PC6）穴進(jìn)行刺激。大鼠在EA治療前接受異氟烷氣體麻醉，隨后使用大鼠固定架固定，在雙側(cè)內(nèi)關(guān)和足三里穴位處插入直徑為0.25 mm的針灸針，深度分別為1 mm和2 mm。EA刺激參數(shù)為2 Hz的疏密波頻率和1 mA的強(qiáng)度，每日治療20 min。Sham組、MCAO模型組大鼠僅麻醉后固定，不進(jìn)行EA治療。

1.6 樣本采集MCAO術(shù)后3 d后對(duì)MCAO模型3 d組和EA干預(yù)3 d組取材，MCAO術(shù)后7 d后對(duì)Sham組、MCAO模型7 d組和EA干預(yù)7 d組取材。以10%水合氯醛（0.35 g/kg）腹腔注射麻醉處死大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法抽取大鼠：5只大鼠直接取出全腦，置于-20℃冰箱凍存，用于TTC染色；5只大鼠用生理鹽水和4%多聚甲醛行心臟灌注，見(jiàn)流出液體清亮后取梗死側(cè)大腦皮層，浸泡于4%多聚甲醛中過(guò)夜，常規(guī)石蠟包埋，并制成厚度為5μm的切片，用于HE染色和尼式染色；5只大鼠僅用生理鹽水行心臟灌注，見(jiàn)流出液體清亮后迅速取梗死側(cè)大腦皮層，置于-80℃冰箱保存，用于Western blot檢測(cè)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

1.7 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.7.1 Bederson評(píng)分 采用Bederson 4分5級(jí)法評(píng)價(jià)大鼠MCAO術(shù)后1、3、7 d神經(jīng)功能缺損程度，并記錄評(píng)分。

1.7.2 TTC染色測(cè)定腦梗死面積 取-20℃冰箱中凍存的全腦，將大腦從冠狀面均勻切成6個(gè)層面，切片厚度約2 mm，將切片放入2%TTC溶液中，37℃恒溫避光孵育30 min，置于4%多聚甲醛緩沖液過(guò)夜固定，然后拍照記錄。正常腦區(qū)為暗紅色，梗死區(qū)為白色，使用Image J軟件測(cè)量梗死面積百分比。

1.7.3 HE染色評(píng)估大腦皮層病理形態(tài)學(xué)情況 取1.6制好的切片，60℃烤片過(guò)夜，再通過(guò)二甲苯和乙醇溶液脫蠟和脫水，依次行蘇木精染色5 min、伊紅染色3 min，封片后拍照分析。

1.7.4 尼式染色評(píng)估大腦皮層神經(jīng)元損傷情況 取1.6制好的切片，烤片后放入二甲苯中浸泡3次，每次10 min，再通過(guò)梯度乙醇脫水（50%、70%、80%、90%和95%各5 min），浸入尼式染液30 min，用水快速?zèng)_洗后，乙醇遞增式脫水，二甲苯中浸泡3次，每次2 min，最后封片并顯微鏡拍照，隨機(jī)讀取3個(gè)視野，用Image J軟件分析完整神經(jīng)元陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。

1.7.5 Western blot檢測(cè)AKT/mTOR通路蛋白表達(dá) 取凍存于-80℃冰箱中的梗死側(cè)大腦皮層組織，隨后置于蛋白裂解液中破碎勻漿，4℃、12 000×g離心30 min，收集上清液并在-80℃下凍存，通過(guò)BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組的蛋白濃度。將等量的蛋白質(zhì)（70μg）上樣至10%SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，放置于5%牛血清白蛋白溶液中37℃封閉1 h，4℃冰柜搖床孵育一抗過(guò)夜（12～14 h），使用的一抗為AKT（1∶1 000），mTOR（1∶1 000），p-mTOR（1∶1 000），β-actin（1∶1 000），第2天用TBST漂洗3次后，加入相對(duì)應(yīng)的山羊抗兔（1∶2 000）二抗，室溫孵育1 h，使用化學(xué)發(fā)光法（ECL）檢測(cè)條帶，照片通過(guò)Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，得出蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 取-80℃冰箱中的梗死側(cè)大腦皮層組織，隨后使用總RNA提取試劑盒提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。熱循環(huán)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃15 s，60℃30 s，循環(huán)40次。測(cè)得Ct值后，以2-ΔΔCt法計(jì)算每組樣品中mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

Tab.1 Primer sequences表1引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。符合方差齊性檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 與Sham組相比，MCAO模型組和EA干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分均升高（P＜0.05），MCAO模型制備成功；MCAO模型組和EA干預(yù)組在術(shù)后1 d和3 d的神經(jīng)功能缺損評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但術(shù)后7 d，EA干預(yù)組神經(jīng)功能缺損評(píng)分較MCAO模型組降低（P＜0.05），見(jiàn)表2。

Tab.2 Comparison of neurological deficit scores at different time points after ischemic brain injury between the three groups of rats表2各組大鼠腦缺血性損傷后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 （n=15，分，±s）

Tab.2 Comparison of neurological deficit scores at different time points after ischemic brain injury between the three groups of rats表2各組大鼠腦缺血性損傷后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 （n=15，分，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與MCAO模型組比較，P＜0.05。

組別Sham組MCAO模型組EA干預(yù)組F術(shù)后1 d 0.00±0.00 2.70±0.48a 2.80±0.42a 184.135＊＊術(shù)后3 d 0.00±0.00 2.50±0.52a 2.60±0.51a 119.571＊＊術(shù)后7 d 0.00±0.00 2.30±0.48a 1.60±0.51b 83.400＊＊

2.2 各組大鼠腦梗死體積的比較Sham組無(wú)明顯缺血改變，未見(jiàn)白色缺血梗死灶；MCAO模型組和EA組在術(shù)后3 d和7 d時(shí)出現(xiàn)了明顯的缺血梗死灶。EA干預(yù)3 d組和7 d組的腦梗死面積百分比均較相應(yīng)MCAO模型組明顯縮?。ň鵓＜0.05），見(jiàn)表3、圖1。

Tab.3 Comparison of percentage of cerebral infarction area and number of intact neurons between the five groups of rats表3各組大鼠腦梗死面積百分比及完整神經(jīng)元數(shù)量的比較（n=5，±s）

Tab.3 Comparison of percentage of cerebral infarction area and number of intact neurons between the five groups of rats表3各組大鼠腦梗死面積百分比及完整神經(jīng)元數(shù)量的比較（n=5，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與MCAO模型3 d組比較，c與MCAO模型7 d組比較，P＜0.05；表4、5同。

組別Sham組MCAO模型3 d組EA干預(yù)3 d組MCAO模型7 d組EA干預(yù)7 d組F腦梗死面積百分比（%）—68.32±5.78 52.91±0.47b 60.25±2.86 36.15±1.66c 84.053＊＊神經(jīng)元數(shù)量（個(gè)/視野）542.00±43.13 245.27±48.84a 356.13±82.28b 406.27±39.40a 500.87±36.23c 75.273＊＊

Fig.1 TTC staining of cerebral infarction area in each group圖1 TTC染色檢測(cè)各組腦梗死面積

2.3 各組大鼠大腦梗死區(qū)病理形態(tài)學(xué)變化Sham組大腦皮層局部結(jié)構(gòu)疏松，可見(jiàn)較多血管擴(kuò)張，周圍間隙變大，較多神經(jīng)元胞質(zhì)疏松，排列規(guī)則。MCAO模型3 d組和7 d組可見(jiàn)皮層大范圍結(jié)構(gòu)疏松，大片壞死；腦膜出現(xiàn)水腫，伴有少量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；較多神經(jīng)元壞死，胞核碎裂或溶解，胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，伴有較多膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)；少量血管擴(kuò)張，少量神經(jīng)元胞質(zhì)疏松，形狀不規(guī)則，排列紊亂。EA干預(yù)3 d組和7 d組可見(jiàn)壞死灶顯著減小，炎性浸潤(rùn)改善；腦膜出現(xiàn)水腫，伴有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；少量血管擴(kuò)張，周圍間隙變大，較多神經(jīng)元胞質(zhì)疏松，排列不規(guī)則，見(jiàn)圖2。

2.4 各組大鼠腦梗死區(qū)完整神經(jīng)元數(shù)量比較 與Sham組相比，MCAO模型組神經(jīng)元染色較淺，細(xì)胞排列較疏松，神經(jīng)元較少，MCAO模型3 d組和7 d組的完整神經(jīng)元數(shù)量較Sham組顯著減少（P＜0.05）；與MCAO模型組相比，EA干預(yù)組變性神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，EA干預(yù)3、7 d組的完整神經(jīng)元數(shù)量顯著高于對(duì)應(yīng)MCAO模型組（均P＜0.05），見(jiàn)表3、圖3。

2.5 各組大鼠大腦皮層AKT和mTOR蛋白磷酸化水平比較 與Sham組相比，MCAO模型3 d組的mTOR磷酸化水平（p-mTOR/t-mTOR）顯著降低，但MCAO模 型7 d組p-mTOR/t-mTOR較MCAO模 型3 d組顯著增加（均P＜0.05）；與MCAO模型7 d組相比，EA干預(yù)7 d組p-mTOR/t-mTOR顯著降低（P＜0.05）；各組AKT、t-mTOR表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4、圖4。

Fig.2 Comparison of pathomorphological changes of cortical areas on the infarct side of rats between the five groups(HE staining,×200)圖2各組大鼠梗死側(cè)大腦皮層區(qū)病理形態(tài)學(xué)比較（HE染色，×200）

Fig.3 Comparison of neuronal morphology in the cortical area of the infarct side of rats between the five groups(Nissl staining,×200)圖3各組大鼠梗死側(cè)大腦皮層區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)比較（尼式染色，×200）

2.6 各組大鼠大腦皮層LC3B、Beclin-1和Bax mRNA表達(dá)情況 與Sham組相比，MCAO模型3 d組和7 d組的LC3B和Beclin-1表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），EA干預(yù)7 d組的LC3B和Beclin-1表達(dá)水平顯著高于MCAO模型7 d組（P＜0.05）；MCAO模型7 d組的Bax表達(dá)水平顯著高于Sham組（P＜0.05），而與MCAO模型7 d組相比，EA干預(yù)7 d組Bax的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表5。

Tab.4 Comparison of relative expression levels of AKT,p-mTOR and t-mTOR proteins in rat brain tissues between the five groups表4各組大鼠腦組織AKT、p-mTOR和t-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 （n=5，±s）

Tab.4 Comparison of relative expression levels of AKT,p-mTOR and t-mTOR proteins in rat brain tissues between the five groups表4各組大鼠腦組織AKT、p-mTOR和t-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 （n=5，±s）

組別Sham組MCAO模型3 d組EA干預(yù)3 d組MCAO模型7 d組EA干預(yù)7 d組F AKT 2.07±1.14 2.89±0.70 2.33±0.73 2.74±0.59 2.11±0.90 0.972 p-mTOR/t-mTOR 1.15±0.40 0.65±0.22a 0.69±0.30 1.49±0.40b 0.63±0.21c 7.015＊＊t-mTOR 0.87±0.32 1.40±0.26 1.10±0.33 1.02±0.93 0.97±0.32 2.470

Fig.4 Western blot analysis showed the expressions of AKT,p-mTOR and t-mTOR in the five groups圖4蛋白印跡分析顯示各組AKT、p-mTOR和t-mTOR蛋白的表達(dá)

Tab.5 Comparison of LC3B,Beclin-1 and Bax mRNA expressions in rat brain tissue at different time points between the five groups表5各組大鼠腦組織不同時(shí)間點(diǎn)LC3B、Beclin-1和Bax mRNA表達(dá)量比較 （n=5，±s）

Tab.5 Comparison of LC3B,Beclin-1 and Bax mRNA expressions in rat brain tissue at different time points between the five groups表5各組大鼠腦組織不同時(shí)間點(diǎn)LC3B、Beclin-1和Bax mRNA表達(dá)量比較 （n=5，±s）

組別Sham組MCAO模型3 d組EA干預(yù)3 d組MCAO模型7 d組EA干預(yù)7 d組F LC3B 1.00±0.00 0.21±0.00a 0.19±0.02 0.62±0.23a 1.68±0.09c 142.452＊＊Beclin-1 1.00±0.00 0.21±0.01a 0.16±0.00 0.17±0.01a 0.76±0.03c 2 229.827＊＊Bax 1.00±0.00 0.57±0.08a 0.53±0.06 1.58±0.21a 1.30±0.10c 78.799＊＊

3 討論

缺血性腦卒中是由缺血缺氧引起的局限性腦組織缺血性壞死或軟化的腦部血液循環(huán)障礙［1］。雖然溶栓和血管內(nèi)治療在臨床上的療效顯著，但其使用條件受限，必須在發(fā)病后數(shù)小時(shí)內(nèi)使用，恢復(fù)期不可使用，后期應(yīng)用組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）可能導(dǎo)致顱內(nèi)出血［9］。目前臨床上對(duì)缺血性腦損傷后的腦部恢復(fù)多采用物理療法，以促進(jìn)缺血性腦損傷后神經(jīng)再生、血管生成及功能恢復(fù)［10］。

EA作為中醫(yī)現(xiàn)代化的產(chǎn)物，已廣泛應(yīng)用于缺血性腦卒中的輔助治療，并被證明在腦梗死治療中具有抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)自噬和凋亡、促神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子釋放、促進(jìn)神經(jīng)和血管再生等作用［11］，可以有效地改善腦梗死患者的神經(jīng)功能缺損情況及預(yù)后。EA療法治療疾病的核心理念之一就是刺激身體特定部位可調(diào)節(jié)生理功能，并認(rèn)為其通過(guò)傳統(tǒng)經(jīng)絡(luò)發(fā)揮作用［12］，其中足三里［13］、內(nèi)關(guān)穴［14］為治療缺血性卒中常用的組合穴位。本研究首先探討EA干預(yù)對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能障礙的影響，發(fā)現(xiàn)EA干預(yù)7 d后Bederson評(píng)分顯著低于MCAO組；此外，EA治療后腦梗死面積明顯減少，梗死側(cè)大腦皮層神經(jīng)元損傷明顯減輕，EA治療對(duì)缺血性卒中具有神經(jīng)保護(hù)作用，與之前的研究結(jié)果一致［15］。Tian等［16］還發(fā)現(xiàn)，EA療法能起到鎮(zhèn)痛作用，還可抑制神經(jīng)元凋亡及異常星形細(xì)胞活化。針灸在臨床康復(fù)中的作用已得到廣泛認(rèn)可，但其作用機(jī)制尚不明確。

自噬是機(jī)體內(nèi)普遍存在的一種細(xì)胞調(diào)控機(jī)制，機(jī)體可以通過(guò)自噬降解受損、變性、衰老和失去功能的細(xì)胞、細(xì)胞器和變性蛋白質(zhì)與核酸等生物大分子［17］。自噬在生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中比較活躍，對(duì)神經(jīng)元尤其重要。由于神經(jīng)元結(jié)構(gòu)復(fù)雜，代謝需求較大，因此，自噬系統(tǒng)在神經(jīng)元合成代謝和分解代謝中扮演了重要角色［18］。有研究表明mTOR在多種中樞神經(jīng)損傷模型中起重要作用［19］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，mTOR在調(diào)節(jié)自噬過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，通過(guò)抑制mTOR的表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬［20］。

mTOR為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其催化亞單位為mTORC1和mTORC2。mTORC1通過(guò)正向調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)合成代謝過(guò)程和負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)分解代謝過(guò)程而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；mTORC2通過(guò)調(diào)節(jié)其他下游的蛋白激酶和細(xì)胞骨架元素，影響細(xì)胞的生存、代謝和結(jié)構(gòu)［18］。其中，mTORC1在誘導(dǎo)自噬過(guò)程中起著核心作用［21］，通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)元自噬來(lái)改善腦缺血損傷［22］。正常情況下，mTORC1作為自噬抑制劑存在于機(jī)體中，一旦細(xì)胞出現(xiàn)缺血、缺氧癥狀，mTORC1就會(huì)失去活性，從而促進(jìn)自噬［23］。Beclin-1是mTOR下游分子，可促進(jìn)LC3-Ⅰ酯化形成LC3-Ⅱ，并在自噬溶酶體的形成中起重要作用［24］。在缺血性腦卒中患者的腦組織中，抑制mTOR磷酸化可以促進(jìn)自噬，降低興奮性毒性所致的損傷［25］，并顯著提高自噬相關(guān)因子Beclin-1和LC3B的表達(dá)［4］。注射組胺H3受體的拮抗劑可抑制大腦梗死區(qū)mTOR磷酸化并誘導(dǎo)自噬發(fā)生，在腦缺血損傷后起到保護(hù)作用［6］。在本研究中，與Sham組相比，MCAO模型7 d組的自噬相關(guān)因子Beclin-1、LC3B表達(dá)顯著降低，EA干預(yù)可逆轉(zhuǎn)MCAO模型組的變化，EA干預(yù)7 d組的mTOR磷酸化水平顯著降低，Beclin-1、LC3B表達(dá)顯著增加，提示EA治療可能通過(guò)抑制mTOR激活自噬改善缺血性腦損傷。

缺血性腦卒中后，腦梗死核心區(qū)神經(jīng)元迅速壞死、凋亡，造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷［26］，而適度的自噬可通過(guò)抑制凋亡反應(yīng)緩解腦損傷［27］。其中，凋亡途徑主要由Bax的鈣依賴性激活啟動(dòng)，并通過(guò)激活下游的caspase-3介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［28］。研究表明，在腦缺血再灌注模型大鼠中，沙芬酰胺能顯著促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3B的表達(dá)，抑制凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax、caspase-3表達(dá)，沙芬酰胺可能通過(guò)抗凋亡、誘導(dǎo)自噬等途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［29］。本研究結(jié)果顯示，MCAO模型7 d組的促凋亡因子Bax表達(dá)水平顯著高于Sham組，EA干預(yù)7 d組的Bax表達(dá)水平顯著低于MCAO模型7 d組，且趨勢(shì)與上述研究結(jié)果一致，提示EA治療可能通過(guò)抑制凋亡因子誘導(dǎo)自噬反應(yīng)。

綜上所述，EA刺激內(nèi)關(guān)、足三里可明顯改善缺血性卒中大鼠運(yùn)動(dòng)功能，改善繼發(fā)性腦損傷及神經(jīng)元壞死，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)自噬，抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。