黃秋陽,王偉,羅書,鄭文武,馮健,葉強(qiáng),鄭舒展△
大氣污染是一個全球性的公共衛(wèi)生問題??諝鈩恿W(xué)當(dāng)量直徑小于2.5 μm的細(xì)顆粒物(fine particulate matter,PM2.5)是最復(fù)雜、最有害的大氣污染物,也是心血管疾病的主要誘因[1]。流行病學(xué)研究表明,PM2.5的質(zhì)量濃度每增加10μg/m3,心血管疾病的病死率則上升11%[2]。其機(jī)制可能與PM2.5加重炎癥反應(yīng)、促進(jìn)動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)發(fā)展有關(guān)[3-4]。但PM2.5加重炎癥反應(yīng)的具體機(jī)制尚不完全清楚。自噬是一種細(xì)胞修復(fù)過程。研究發(fā)現(xiàn),在粥樣斑塊形成過程中存在自噬激活,而進(jìn)展期的不穩(wěn)定斑塊存在自噬降解受損[5],可見AS的不同階段均有自噬參與。而AS的發(fā)生發(fā)展離不開巨噬細(xì)胞[6-7],巨噬細(xì)胞是AS過程的主要效應(yīng)細(xì)胞。因此研究AS中巨噬細(xì)胞自噬是有必要的。已有研究發(fā)現(xiàn)PM2.5具有誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞[8]和血管內(nèi)皮細(xì)胞[9]自噬的作用。然而,關(guān)于自噬在PM2.5促進(jìn)AS中的作用以及PM2.5對巨噬細(xì)胞自噬的影響的研究甚少。此外,有研究顯示PM2.5可直接進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng),被巨噬細(xì)胞的Toll樣受體4(Toll like receptor 4,TLR4)識別[3]。因此,本研究擬從自噬的角度探討PM2.5促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的具體機(jī)制,為防治AS提供新的理論基礎(chǔ)。
1.1 主要材料與試劑PM2.5樣本于2020年3—9月采集于四川省瀘州市茜草園藝路(由瀘州市環(huán)境監(jiān)測中心站提供);Raw264.7細(xì)胞株購自上海中喬新舟生物科技有限公司;磷酸鹽緩沖溶液(PBS,0.1 mol/L,pH=7.4)購自Biosharp Life Science公司;胎牛血清(FBS)、高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;細(xì)胞凍存液購自美國ScienCell研究實(shí)驗(yàn)室;自噬抑制劑羥氯喹(HCQ)、TLR4抑制劑TAK-242、自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(Rap)購自北京索萊寶科技有限公司;兔源抗GAPDH抗體購自英國Abcam公司;兔源抗TLR4、核苷酸結(jié)合域樣受體蛋白3(NLRP3)、微管相關(guān)輕鏈蛋白3(LC3)、p62抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;兔源抗溶酶體膜蛋白2(LAMP2)抗體購自Bioss Antibodies公司;抗組織蛋白酶B(CTSB)抗體購自美國Proteintech公司;HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗、Western blot實(shí)驗(yàn)主要試劑購自武漢ASPEN公司;白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-18、IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自武漢科鹿生物科技有限責(zé)任公司。透射電子顯微鏡購自美國FEI公司;Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;全自動酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan公司;共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。
1.2 方法
1.2.1 PM2.5混懸液的制備 用無菌注射用水在超聲波洗滌器中溶解PM2.5,每次搖晃洗脫45 min,連續(xù)3次,取洗脫液,12 000 r/min離心10 min,將沉淀冷凍干燥得到PM2.5干粉。然后用PBS溶解PM2.5干粉,高溫蒸汽滅菌,定容100 mg/L,4℃冰箱冷藏,使用時稀釋至所需濃度。
1.2.2 細(xì)胞處理Raw264.7巨噬細(xì)胞在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁達(dá)90%后,用PBS洗滌2次。用一次性細(xì)胞刮輕輕將細(xì)胞刮離瓶底,1 000 r/min離心3 min,棄上清液。加入完全培養(yǎng)基并吹打混勻后傳代培養(yǎng)。
1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 為檢測PM2.5對Raw264.7巨噬細(xì)胞活性的影響,設(shè)置PM2.5濃度梯度分別為0、25、50、75、100 mg/L;時間梯度分別為6、12、18、24、36、48 h,篩選最佳的作用濃度和時間。將傳代培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞隨機(jī)分為以下6組進(jìn)行處理:對照組(等體積PBS)、PM2.5組(PM2.550 mg/L)、Rap組(Rap 100μg/L)、HCQ組(HCQ 40 mg/L)、PM2.5+HCQ組(PM2.550 mg/L+HCQ 40 mg/L)和PM2.5+TAK-242組(PM2.550 mg/L+TAK-242 40μmol/L)。
1.2.4 細(xì)胞活性檢測 對數(shù)期細(xì)胞接種在96孔板中,根據(jù)設(shè)定的濃度梯度,加入等體積的PM2.5混懸液與巨噬細(xì)胞共同孵育24 h;另一孔板加入等體積的50 mg/L PM2.5懸浮液,按照上述時間梯度孵育不同時間。然后每孔加入10μL CCK-8溶液,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h,同時設(shè)置對照孔組(含細(xì)胞、CCK-8而無PM2.5)和空白孔組(不含細(xì)胞)。用酶標(biāo)儀測量450 nm處光密度(OD)值,再根據(jù)以下公式計(jì)算各組細(xì)胞活性:細(xì)胞活性=(PM2.5組OD-空白孔組OD)/(對照孔組OD-空白孔組OD)×100%。
1.2.5 透射電子顯微鏡顯像 細(xì)胞離心后棄去培養(yǎng)液,加入電鏡固定液4℃固定3 h,PBS漂洗3次,每次15 min,用1%的鋨酸固定2 h,PBS漂洗3次,每次15 min,用乙醇進(jìn)行梯度脫水(50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%),每次15 min,按照丙酮∶812包埋劑1∶1混合液滲透過夜,純812包埋劑滲透過夜。60℃聚合48 h進(jìn)行包埋,用超薄切片機(jī)切成60~80 nm的超薄切片;2%醋酸鈾飽和水溶液、枸櫞酸鉛染液各染色15 min,切片置于室溫中干燥過夜。透射電子顯微鏡觀察,采集圖像并分析。
1.2.6 Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞 在96孔板中接種Raw264.7細(xì)胞并添加新鮮培養(yǎng)基。當(dāng)每個孔中的細(xì)胞占孔板的50%時,更換新鮮培養(yǎng)基。將Ad-mCherry-GFPLC3B分別加入Rap組和PM2.5組。同時設(shè)置無病毒細(xì)胞孔作為對照。感染約24 h后,除去含有病毒的培養(yǎng)基,每孔加入新鮮的完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)胞生長狀態(tài)和熒光蛋白表達(dá)情況。mCherry是一種單體紅色熒光蛋白,當(dāng)它與綠色熒光蛋白(GFP)共標(biāo)記LC3B時,GFP的綠色熒光被溶酶體的酸性環(huán)境淬滅,mCherry的紅色熒光保留。因此,mCherry-GFP-LC3B融合蛋白的表達(dá)可有效追蹤自噬過程。Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒感染細(xì)胞后,細(xì)胞中沒有自噬發(fā)生或只有低水平的自噬發(fā)生時,mCherry-GFP-LC3B在熒光顯微鏡下以主要以彌散黃色熒光(mCherry和GFP的聯(lián)合效應(yīng))的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中;當(dāng)細(xì)胞中有較高水平自噬發(fā)生時,自噬小體形成,mCherry-GFP-LC3B在熒光顯微鏡下以黃色斑點(diǎn)的形式聚集在自噬體膜上;當(dāng)自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體時,由于GFP部分綠色熒光被溶酶體的酸性環(huán)境淬滅而以紅色斑點(diǎn)的形式出現(xiàn)。
1.2.7 Western blot檢測炎癥及自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 收集各組貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞后,用RIPA冰上裂解30 min,4℃、13 000×g離心5 min,收集上清液。BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜,用5%脫脂牛奶封閉。加入稀釋的一抗:GAPDH抗體、TLR4抗體、NLRP3抗體、LC3抗體、p62抗體、LAMP2抗體、CTSB抗體,在4℃的水平振蕩器上緩慢搖動孵育過夜。然后加入稀釋的二抗,室溫孵育2 h。使用電化學(xué)發(fā)光溶液進(jìn)行發(fā)光顯影,AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的OD值。
1.2.8 ELISA檢測炎性因子分泌 按照ELISA試劑盒說明書,先將標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋后用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,再取細(xì)胞培養(yǎng)上清液,在4℃、3 500 r/min離心10 min后取上清液,適當(dāng)稀釋后用于檢測IL-1β、IL-18、IL-10濃度,酶標(biāo)儀檢測波長450 nm處OD值,并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣本細(xì)胞因子濃度。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 28.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,GraphPad Prism 8進(jìn)行繪圖。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用Tukey檢驗(yàn),2組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 PM2.5對巨噬細(xì)胞活性的影響CCK-8檢測結(jié)果顯示,PM2.5分別為0、25、50、75、100 mg/L時,Raw264.7巨噬細(xì)胞的活性分別為100.0±1.6、86.8±3.2、74.5±1.9、59.7±2.4、45.9±2.6,PM2.5對Raw264.7巨噬細(xì)胞的活性影響具有濃度依賴性(F=231.916,P<0.01)。濃度為50 mg/L PM2.5分別作用Raw264.7細(xì)胞6、12、18、24、36及48 h后,PM2.5暴露時間越長,巨噬細(xì)胞活性越低,見表1。后續(xù)選取最佳PM2.5濃度為50 mg/L,作用時間為24 h。
Tab.1 Comparison of the effect of PM2.5 on macrophage activity at different times between the two groups表1 2組不同時間PM2.5對巨噬細(xì)胞活性影響的比較(n=3,%,±s)
Tab.1 Comparison of the effect of PM2.5 on macrophage activity at different times between the two groups表1 2組不同時間PM2.5對巨噬細(xì)胞活性影響的比較(n=3,%,±s)
*P<0.05。
組別對照組PM2.5組t 0 h 100.0±1.1 100.0±1.6 0.292 6 h 99.0±1.2 91.0±2.0 1.345*12 h 101.0±1.1 82.3±3.2 3.363*18 h 100.0±1.4 67.0±2.4 4.178*24 h 100.0±1.3 52.0±2.3 4.765*48 h 100.0±1.2 41.0±2.8 5.193*
2.2 PM2.5對巨噬細(xì)胞自噬的影響 與對照組相比,PM2.5組除可見自噬空泡(綠圈)外,還可見較多雙膜自噬小體(紅圈),其間可見未消化的胞漿成分及細(xì)胞器,而自噬溶酶體(藍(lán)圈)較少見。見圖1。
Fig.1 Observation of autophagy structure under transmission electron microscope(×8 000)圖1透射電鏡下觀察自噬結(jié)構(gòu)(×8 000)
2.3 熒光顯微鏡下PM2.5對巨噬細(xì)胞自噬流的影響Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)果顯示,Merge后對照組細(xì)胞質(zhì)中主要表現(xiàn)為黃色彌散熒光,Rap組中部分綠色熒光淬滅,Merge后黃色點(diǎn)狀熒光少于紅色點(diǎn)狀熒光;而PM2.5組綠色熒光淬滅不明顯,Merge后黃色熒光點(diǎn)多于紅色熒光點(diǎn),見圖2。PM2.5組黃紅熒光比值(9.39±2.20)高于對照組(7.16±0.91)和Rap組(1.71±0.39,n=3,F(xiàn)=23.784,P<0.01)。
2.4 PM2.5對巨噬細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響Western blot結(jié)果表明,與對照組相比,PM2.5組自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、CTSB表達(dá)上調(diào),而LAMP2表達(dá)下調(diào)(P<0.05),見圖3。
Fig.2 Changes of autophagy in Raw264.7 cells transfected with Ad-mCherry-GFP-LC3B圖2 Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒轉(zhuǎn)染后Raw264.7細(xì)胞內(nèi)自噬情況的變化
Fig.3 Western blot detection of LAMP2,LC3,CTSB,p62 protein expression in each group圖3 Western blot檢測各組LC3、CTSB、p62、LAMP2蛋白表達(dá)
2.5 PM2.5及自噬對巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響HCQ組LC3Ⅱ/Ⅰ、p62表達(dá)高于對照組(P<0.05),且NLRP3、IL-1β、IL-18表達(dá)增加,IL-10表達(dá)下降(P<0.05)。而PM2.5抑制自噬的同時,也可促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3表達(dá)和IL-1β、IL-18的分泌,抑制IL-10分泌(P<0.05)。當(dāng)HCQ和PM2.5共同作用于巨噬細(xì)胞后,NLRP3、IL-1β、IL-18的增加和IL-10的下降較其他3組都更為顯著(P<0.05)。見表2、圖4。
2.6 PM2.5通過TLR4影響巨噬細(xì)胞自噬和炎癥反應(yīng) 相較于對照組,PM2.5組TLR4表達(dá)增高(P<0.05)。而在抑制TLR4后,相較于PM2.5組,PM2.5+TAK-242組LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、CTSB等自噬相關(guān)蛋白表達(dá)降低,LAMP2表達(dá)增加,并且NLRP3炎性小體和促炎因子IL-1β、IL-18分泌也有減少,抗炎因子IL-10表達(dá)增加(P<0.05),見表3、圖5。
Tab.2 Comparison of expressions of inflammatory factor levels between the four groups表2各組炎性因子表達(dá)水平比較(n=3,ng/L,±s)
Tab.2 Comparison of expressions of inflammatory factor levels between the four groups表2各組炎性因子表達(dá)水平比較(n=3,ng/L,±s)
**P<0.01;a與對照組比較,b與PM2.5組比較,c與HCQ組比較,P<0.05。
組別對照組PM2.5組HCQ組PM2.5+HCQ組F IL-1β 25.47±8.70 156.79±13.77a 124.09±11.46a 205.55±29.13abc 55.819**IL-18 25.32±5.79 129.71±9.75a 106.57±9.13a 218.54±11.56abc 217.096**IL-10 45.59±7.55 24.31±3.82a 19.32±3.40a 7.24±2.52abc 61.207**
Tab.3 Comparison of inflammatory factor levels after inhibition of TLR4 between the three groups表3抑制TLR4后各組炎癥因子水平比較(n=3,ng/L,±s)
Tab.3 Comparison of inflammatory factor levels after inhibition of TLR4 between the three groups表3抑制TLR4后各組炎癥因子水平比較(n=3,ng/L,±s)
**P<0.01;a與對照組比較,b與PM2.5組比較,P<0.05。
組別對照組PM2.5組PM2.5+TAK-242組F IL-1β 25.54±8.70 157.19±11.84a 74.54±6.47ab 129.037**IL-18 24.99±5.81 130.21±9.65a 72.56±7.53ab 132.806**IL-10 46.11±7.56 23.10±4.12a 86.92±10.13ab 52.373**
Fig.4 Western blot detection of expression levels of autophagy and NLRP3 protein圖4 Western blot檢測自噬蛋白、NLRP3蛋白表達(dá)
Fig.5 After inhibiting TLR4,the expression of autophagy and inflammation-related proteins detected by Western blot assay圖5抑制TLR4后Western blot檢測各組自噬和炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)
一些流行病學(xué)研究證據(jù)表明,PM2.5可增加心血管病的發(fā)病率和死亡率,人們長期暴露在PM2.5環(huán)境中,心血管疾病病死率可升高22%[10-11]。Gold等[12]研究發(fā)現(xiàn),短期暴露于大量PM2.5中所導(dǎo)致的心血管疾病死亡率(69%)高于由其導(dǎo)致的呼吸系統(tǒng)疾病死亡率(28%)。而AS作為心血管疾病的病理基礎(chǔ),發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。研究表明,除已知的高血壓、糖尿病、血脂異常、吸煙等因素外,PM2.5也是導(dǎo)致AS發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,并可影響粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性[3]。但是PM2.5對AS的影響機(jī)制有待進(jìn)一步完善?,F(xiàn)有研究表明PM2.5致AS作用與其致炎效應(yīng)有關(guān)[4,13-14]。巨噬細(xì)胞是AS的主要炎癥細(xì)胞,且巨噬細(xì)胞的自噬能力與AS斑塊的穩(wěn)定性呈正相關(guān)[15]。因此,本實(shí)驗(yàn)從自噬的角度,以Raw264.7巨噬細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象,從細(xì)胞及分子水平探討PM2.5加重炎癥反應(yīng)的機(jī)制,為AS的防治提供新的理論基礎(chǔ)。
3.1 PM2.5對巨噬細(xì)胞自噬的影響 自噬是細(xì)胞在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子的高度保守過程,主要過程包括吞噬泡-雙膜自噬體-自噬溶酶體。自噬雙層膜形成到自噬溶酶體降解的整個動態(tài)過程稱為自噬流(通量)。LC3和p62被廣泛用于自噬的基礎(chǔ)研究。自噬形成時,LC3Ⅰ(胞漿型)向LC3Ⅱ(膜型)轉(zhuǎn)化,LC3Ⅱ/Ⅰ的比值可反映自噬小體形成的數(shù)量和自噬水平。自噬溶酶體形成障礙時,p62降解受阻而堆積,因此細(xì)胞內(nèi)p62表達(dá)水平與自噬活性呈負(fù)相關(guān)。LAMP作為溶酶體膜的主要構(gòu)成蛋白,可反映自噬小體與溶酶體的融合。有研究認(rèn)為LAMP2缺失可阻礙自噬體與溶酶體的融合[16]。CTSB作為溶酶體的標(biāo)志性酶蛋白,可反映溶酶體水解功能。既往研究表明,PM2.5可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[17-18],但是缺少PM2.5對自噬過程影響機(jī)制的研究。本實(shí)驗(yàn)以Raw264.7巨噬細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象,探討空氣污染物PM2.5對巨噬細(xì)胞自噬的影響機(jī)制。結(jié)果顯示,PM2.5對Raw264.7巨噬細(xì)胞的活性影響具有濃度和時間依賴性。且PM2.5刺激后的Raw264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多的自噬空泡及自噬小體,提示PM2.5可能誘發(fā)了巨噬細(xì)胞自噬的保護(hù)機(jī)制,但其中自噬溶酶體較少見,同時使用Ad-mCherry-GFP-LC3B轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后,Rap組的綠色熒光淬滅較PM2.5組明顯,Merge后PM2.5組黃紅熒光比值高于對照組和Rap組,進(jìn)而提示PM2.5雖然觸發(fā)了巨噬細(xì)胞自噬,但下游自噬小體與溶酶體融合障礙,自噬流異常。Western blot結(jié)果也提示反映自噬水平的LC3Ⅱ/Ⅰ、p62以及反映溶酶體功能的CTSB表達(dá)增高,但是反映自噬小體與溶酶體結(jié)合的LAMP2表達(dá)下降。進(jìn)一步說明PM2.5誘發(fā)巨噬細(xì)胞自噬,但阻斷了自噬小體與溶酶體的融合。以上結(jié)果表明PM2.5對巨噬細(xì)胞自噬的影響機(jī)制是通過阻斷自噬小體與溶酶體的融合,從而使自噬通量下游阻斷,自噬流不完整,從而導(dǎo)致自噬功能障礙來實(shí)現(xiàn)的。
3.2 PM2.5影響下巨噬細(xì)胞自噬與炎癥的相互作用NLRP3可在AS的病變中檢出,抑制NLRP3可以抑制泡沫細(xì)胞的形成,其活化可造成粥樣斑塊的不穩(wěn)定[19]。有研究發(fā)現(xiàn)Toll樣受體(TLRs)與AS的形成密切相關(guān)[20],而PM2.5可通過TLR4/MyD88/NFκB通路激活NLRP3炎癥小體,促進(jìn)泡沫細(xì)胞的產(chǎn)生和易損斑塊的形成,從而促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展[3]。既往研究表明,自噬和炎性小體均參與了AS的發(fā)生發(fā)展[3,17]。炎性小體與自噬存在相互調(diào)節(jié)作用,自噬功能障礙可導(dǎo)致NLRP3炎性小體的激活,是炎性小體的重要調(diào)節(jié)器[21]。同時,炎性小體也可在自噬啟動、LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化等方面調(diào)節(jié)自噬[22-23]。但目前尚無對PM2.5影響下巨噬細(xì)胞自噬與炎癥相互影響的相關(guān)研究。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組相比,PM2.5組TLR4、NLRP3和促炎因子IL-1β、IL-18表達(dá)增加,IL-10表達(dá)下降。這與現(xiàn)有的研究結(jié)果基本一致[24],表明PM2.5可增加巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。但PM2.5增加炎癥反應(yīng)的具體機(jī)制不完全明確。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示,與對照組相比,PM2.5組和HCQ組的NLRP3、IL-1β和IL-18表達(dá)均增加,IL-10表達(dá)下降,提示PM2.5在抑制自噬的同時促進(jìn)炎性小體和促炎因子的表達(dá)、抑制抗炎因子的表達(dá);表明PM2.5加重巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)與其抑制自噬有關(guān)。進(jìn)一步表明PM2.5作為致病因素進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后,影響巨噬細(xì)胞活性并誘發(fā)炎癥反應(yīng),從而促發(fā)機(jī)體產(chǎn)生自噬這一保護(hù)機(jī)制,但阻斷了下游自噬小體和溶酶體融合,從而影響巨噬細(xì)胞自噬通量及自噬功能,使包括炎性小體在內(nèi)的自噬內(nèi)容物降解受阻,進(jìn)而加重巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。同時,與對照組、PM2.5組和HCQ組相比,PM2.5+HCQ組的NLRP3、IL-1β和IL-18的增加及IL-10的下降更顯著,提示PM2.5和HCQ對巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的促進(jìn)作用有疊加效應(yīng),暴露于PM2.5后進(jìn)一步抑制自噬可加重巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。且PM2.5組TLR4表達(dá)高于對照組;而與PM2.5組比較,PM2.5+TAK-242組TLR4、NLRP3、IL-1β及IL-18表達(dá)均下降,IL-10表達(dá)增加,而自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、CTSB表達(dá)也降低,LAMP2表達(dá)增加,表明抑制TLR4后PM2.5對自噬的抑制作用減弱,提示PM2.5抑制自噬的機(jī)制可能是由TLR4介導(dǎo)的。
綜上,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PM2.5可降低Raw264.7巨噬細(xì)胞活性,并具有濃度和時間依賴性;PM2.5進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后可觸發(fā)炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生自噬,但阻礙自噬小體與溶酶體融合,破壞自噬通量,從而使自噬內(nèi)容物降解受阻,進(jìn)而促進(jìn)炎性小體活化和促炎因子的表達(dá),誘發(fā)加重炎癥反應(yīng),且該過程可能由TLR4所介導(dǎo)。由此,筆者推測PM2.5抑制自噬、加重巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)可能是AS的發(fā)病機(jī)制之一,誘導(dǎo)自噬可能削弱PM2.5的致炎效應(yīng)而對AS起保護(hù)作用。