PM2.5通過TLR4破壞自噬流加重Raw264.7巨噬細胞炎癥反應(yīng)

黃秋陽，王偉，羅書，鄭文武，馮健，葉強，鄭舒展△

大氣污染是一個全球性的公共衛(wèi)生問題?？諝鈩恿W(xué)當量直徑小于2.5 μm的細顆粒物（fine particulate matter，PM2.5）是最復(fù)雜、最有害的大氣污染物，也是心血管疾病的主要誘因［1］。流行病學(xué)研究表明，PM2.5的質(zhì)量濃度每增加10μg/m3，心血管疾病的病死率則上升11%［2］。其機制可能與PM2.5加重炎癥反應(yīng)、促進動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）發(fā)展有關(guān)［3-4］。但PM2.5加重炎癥反應(yīng)的具體機制尚不完全清楚。自噬是一種細胞修復(fù)過程。研究發(fā)現(xiàn)，在粥樣斑塊形成過程中存在自噬激活，而進展期的不穩(wěn)定斑塊存在自噬降解受損［5］，可見AS的不同階段均有自噬參與。而AS的發(fā)生發(fā)展離不開巨噬細胞［6-7］，巨噬細胞是AS過程的主要效應(yīng)細胞。因此研究AS中巨噬細胞自噬是有必要的。已有研究發(fā)現(xiàn)PM2.5具有誘導(dǎo)肺泡上皮細胞［8］和血管內(nèi)皮細胞［9］自噬的作用。然而，關(guān)于自噬在PM2.5促進AS中的作用以及PM2.5對巨噬細胞自噬的影響的研究甚少。此外，有研究顯示PM2.5可直接進入循環(huán)系統(tǒng)，被巨噬細胞的Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）識別［3］。因此，本研究擬從自噬的角度探討PM2.5促進巨噬細胞炎癥反應(yīng)的具體機制，為防治AS提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑PM2.5樣本于2020年3—9月采集于四川省瀘州市茜草園藝路（由瀘州市環(huán)境監(jiān)測中心站提供）；Raw264.7細胞株購自上海中喬新舟生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖溶液（PBS，0.1 mol/L，pH=7.4）購自Biosharp Life Science公司；胎牛血清（FBS）、高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；細胞凍存液購自美國ScienCell研究實驗室；自噬抑制劑羥氯喹（HCQ）、TLR4抑制劑TAK-242、自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素（Rap）購自北京索萊寶科技有限公司；兔源抗GAPDH抗體購自英國Abcam公司；兔源抗TLR4、核苷酸結(jié)合域樣受體蛋白3（NLRP3）、微管相關(guān)輕鏈蛋白3（LC3）、p62抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；兔源抗溶酶體膜蛋白2（LAMP2）抗體購自Bioss Antibodies公司；抗組織蛋白酶B（CTSB）抗體購自美國Proteintech公司；HRP標記的山羊抗兔二抗、Western blot實驗主要試劑購自武漢ASPEN公司；白細胞介素（IL）-1β、IL-18、IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自武漢科鹿生物科技有限責(zé)任公司。透射電子顯微鏡購自美國FEI公司；Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；全自動酶標儀購自瑞士Tecan公司；共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5混懸液的制備 用無菌注射用水在超聲波洗滌器中溶解PM2.5，每次搖晃洗脫45 min，連續(xù)3次，取洗脫液，12 000 r/min離心10 min，將沉淀冷凍干燥得到PM2.5干粉。然后用PBS溶解PM2.5干粉，高溫蒸汽滅菌，定容100 mg/L，4℃冰箱冷藏，使用時稀釋至所需濃度。

1.2.2 細胞處理Raw264.7巨噬細胞在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁達90%后，用PBS洗滌2次。用一次性細胞刮輕輕將細胞刮離瓶底，1 000 r/min離心3 min，棄上清液。加入完全培養(yǎng)基并吹打混勻后傳代培養(yǎng)。

1.2.3 實驗分組 為檢測PM2.5對Raw264.7巨噬細胞活性的影響，設(shè)置PM2.5濃度梯度分別為0、25、50、75、100 mg/L；時間梯度分別為6、12、18、24、36、48 h，篩選最佳的作用濃度和時間。將傳代培養(yǎng)24 h后的細胞隨機分為以下6組進行處理：對照組（等體積PBS）、PM2.5組（PM2.550 mg/L）、Rap組（Rap 100μg/L）、HCQ組（HCQ 40 mg/L）、PM2.5+HCQ組（PM2.550 mg/L+HCQ 40 mg/L）和PM2.5+TAK-242組（PM2.550 mg/L+TAK-242 40μmol/L）。

1.2.4 細胞活性檢測 對數(shù)期細胞接種在96孔板中，根據(jù)設(shè)定的濃度梯度，加入等體積的PM2.5混懸液與巨噬細胞共同孵育24 h；另一孔板加入等體積的50 mg/L PM2.5懸浮液，按照上述時間梯度孵育不同時間。然后每孔加入10μL CCK-8溶液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，同時設(shè)置對照孔組（含細胞、CCK-8而無PM2.5）和空白孔組（不含細胞）。用酶標儀測量450 nm處光密度（OD）值，再根據(jù)以下公式計算各組細胞活性：細胞活性=（PM2.5組OD-空白孔組OD）/（對照孔組OD-空白孔組OD）×100%。

1.2.5 透射電子顯微鏡顯像 細胞離心后棄去培養(yǎng)液，加入電鏡固定液4℃固定3 h，PBS漂洗3次，每次15 min，用1%的鋨酸固定2 h，PBS漂洗3次，每次15 min，用乙醇進行梯度脫水（50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%），每次15 min，按照丙酮∶812包埋劑1∶1混合液滲透過夜，純812包埋劑滲透過夜。60℃聚合48 h進行包埋，用超薄切片機切成60～80 nm的超薄切片；2%醋酸鈾飽和水溶液、枸櫞酸鉛染液各染色15 min，切片置于室溫中干燥過夜。透射電子顯微鏡觀察，采集圖像并分析。

1.2.6 Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒轉(zhuǎn)染細胞 在96孔板中接種Raw264.7細胞并添加新鮮培養(yǎng)基。當每個孔中的細胞占孔板的50%時，更換新鮮培養(yǎng)基。將Ad-mCherry-GFPLC3B分別加入Rap組和PM2.5組。同時設(shè)置無病毒細胞孔作為對照。感染約24 h后，除去含有病毒的培養(yǎng)基，每孔加入新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后觀察細胞生長狀態(tài)和熒光蛋白表達情況。mCherry是一種單體紅色熒光蛋白，當它與綠色熒光蛋白（GFP）共標記LC3B時，GFP的綠色熒光被溶酶體的酸性環(huán)境淬滅，mCherry的紅色熒光保留。因此，mCherry-GFP-LC3B融合蛋白的表達可有效追蹤自噬過程。Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒感染細胞后，細胞中沒有自噬發(fā)生或只有低水平的自噬發(fā)生時，mCherry-GFP-LC3B在熒光顯微鏡下以主要以彌散黃色熒光（mCherry和GFP的聯(lián)合效應(yīng)）的形式存在于細胞質(zhì)中；當細胞中有較高水平自噬發(fā)生時，自噬小體形成，mCherry-GFP-LC3B在熒光顯微鏡下以黃色斑點的形式聚集在自噬體膜上；當自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體時，由于GFP部分綠色熒光被溶酶體的酸性環(huán)境淬滅而以紅色斑點的形式出現(xiàn)。

1.2.7 Western blot檢測炎癥及自噬相關(guān)蛋白表達 收集各組貼壁細胞和懸浮細胞后，用RIPA冰上裂解30 min，4℃、13 000×g離心5 min，收集上清液。BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉。加入稀釋的一抗：GAPDH抗體、TLR4抗體、NLRP3抗體、LC3抗體、p62抗體、LAMP2抗體、CTSB抗體，在4℃的水平振蕩器上緩慢搖動孵育過夜。然后加入稀釋的二抗，室溫孵育2 h。使用電化學(xué)發(fā)光溶液進行發(fā)光顯影，AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標條帶的OD值。

1.2.8 ELISA檢測炎性因子分泌 按照ELISA試劑盒說明書，先將標準品梯度稀釋后用于繪制標準曲線，再取細胞培養(yǎng)上清液，在4℃、3 500 r/min離心10 min后取上清液，適當稀釋后用于檢測IL-1β、IL-18、IL-10濃度，酶標儀檢測波長450 nm處OD值，并通過標準曲線回歸方程計算樣本細胞因子濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 28.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism 8進行繪圖。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey檢驗，2組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PM2.5對巨噬細胞活性的影響CCK-8檢測結(jié)果顯示，PM2.5分別為0、25、50、75、100 mg/L時，Raw264.7巨噬細胞的活性分別為100.0±1.6、86.8±3.2、74.5±1.9、59.7±2.4、45.9±2.6，PM2.5對Raw264.7巨噬細胞的活性影響具有濃度依賴性（F=231.916，P＜0.01）。濃度為50 mg/L PM2.5分別作用Raw264.7細胞6、12、18、24、36及48 h后，PM2.5暴露時間越長，巨噬細胞活性越低，見表1。后續(xù)選取最佳PM2.5濃度為50 mg/L，作用時間為24 h。

Tab.1 Comparison of the effect of PM2.5 on macrophage activity at different times between the two groups表1 2組不同時間PM2.5對巨噬細胞活性影響的比較（n=3，%，±s）

Tab.1 Comparison of the effect of PM2.5 on macrophage activity at different times between the two groups表1 2組不同時間PM2.5對巨噬細胞活性影響的比較（n=3，%，±s）

＊P＜0.05。

組別對照組PM2.5組t 0 h 100.0±1.1 100.0±1.6 0.292 6 h 99.0±1.2 91.0±2.0 1.345＊12 h 101.0±1.1 82.3±3.2 3.363＊18 h 100.0±1.4 67.0±2.4 4.178＊24 h 100.0±1.3 52.0±2.3 4.765＊48 h 100.0±1.2 41.0±2.8 5.193＊

2.2 PM2.5對巨噬細胞自噬的影響 與對照組相比，PM2.5組除可見自噬空泡（綠圈）外，還可見較多雙膜自噬小體（紅圈），其間可見未消化的胞漿成分及細胞器，而自噬溶酶體（藍圈）較少見。見圖1。

Fig.1 Observation of autophagy structure under transmission electron microscope(×8 000)圖1透射電鏡下觀察自噬結(jié)構(gòu)（×8 000）

2.3 熒光顯微鏡下PM2.5對巨噬細胞自噬流的影響Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒轉(zhuǎn)染細胞結(jié)果顯示，Merge后對照組細胞質(zhì)中主要表現(xiàn)為黃色彌散熒光，Rap組中部分綠色熒光淬滅，Merge后黃色點狀熒光少于紅色點狀熒光；而PM2.5組綠色熒光淬滅不明顯，Merge后黃色熒光點多于紅色熒光點，見圖2。PM2.5組黃紅熒光比值（9.39±2.20）高于對照組（7.16±0.91）和Rap組（1.71±0.39，n=3，F(xiàn)=23.784，P＜0.01）。

2.4 PM2.5對巨噬細胞自噬相關(guān)蛋白的影響Western blot結(jié)果表明，與對照組相比，PM2.5組自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、CTSB表達上調(diào)，而LAMP2表達下調(diào)（P＜0.05），見圖3。

Fig.2 Changes of autophagy in Raw264.7 cells transfected with Ad-mCherry-GFP-LC3B圖2 Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒轉(zhuǎn)染后Raw264.7細胞內(nèi)自噬情況的變化

Fig.3 Western blot detection of LAMP2,LC3,CTSB,p62 protein expression in each group圖3 Western blot檢測各組LC3、CTSB、p62、LAMP2蛋白表達

2.5 PM2.5及自噬對巨噬細胞炎癥反應(yīng)的影響HCQ組LC3Ⅱ/Ⅰ、p62表達高于對照組（P＜0.05），且NLRP3、IL-1β、IL-18表達增加，IL-10表達下降（P＜0.05）。而PM2.5抑制自噬的同時，也可促進巨噬細胞內(nèi)NLRP3表達和IL-1β、IL-18的分泌，抑制IL-10分泌（P＜0.05）。當HCQ和PM2.5共同作用于巨噬細胞后，NLRP3、IL-1β、IL-18的增加和IL-10的下降較其他3組都更為顯著（P＜0.05）。見表2、圖4。

2.6 PM2.5通過TLR4影響巨噬細胞自噬和炎癥反應(yīng) 相較于對照組，PM2.5組TLR4表達增高（P＜0.05）。而在抑制TLR4后，相較于PM2.5組，PM2.5+TAK-242組LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、CTSB等自噬相關(guān)蛋白表達降低，LAMP2表達增加，并且NLRP3炎性小體和促炎因子IL-1β、IL-18分泌也有減少，抗炎因子IL-10表達增加（P＜0.05），見表3、圖5。

Tab.2 Comparison of expressions of inflammatory factor levels between the four groups表2各組炎性因子表達水平比較（n=3，ng/L，±s）

Tab.2 Comparison of expressions of inflammatory factor levels between the four groups表2各組炎性因子表達水平比較（n=3，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與PM2.5組比較，c與HCQ組比較，P＜0.05。

組別對照組PM2.5組HCQ組PM2.5+HCQ組F IL-1β 25.47±8.70 156.79±13.77a 124.09±11.46a 205.55±29.13abc 55.819＊＊IL-18 25.32±5.79 129.71±9.75a 106.57±9.13a 218.54±11.56abc 217.096＊＊IL-10 45.59±7.55 24.31±3.82a 19.32±3.40a 7.24±2.52abc 61.207＊＊

Tab.3 Comparison of inflammatory factor levels after inhibition of TLR4 between the three groups表3抑制TLR4后各組炎癥因子水平比較（n=3，ng/L，±s）

Tab.3 Comparison of inflammatory factor levels after inhibition of TLR4 between the three groups表3抑制TLR4后各組炎癥因子水平比較（n=3，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與PM2.5組比較，P＜0.05。

組別對照組PM2.5組PM2.5+TAK-242組F IL-1β 25.54±8.70 157.19±11.84a 74.54±6.47ab 129.037＊＊IL-18 24.99±5.81 130.21±9.65a 72.56±7.53ab 132.806＊＊IL-10 46.11±7.56 23.10±4.12a 86.92±10.13ab 52.373＊＊

Fig.4 Western blot detection of expression levels of autophagy and NLRP3 protein圖4 Western blot檢測自噬蛋白、NLRP3蛋白表達

Fig.5 After inhibiting TLR4,the expression of autophagy and inflammation-related proteins detected by Western blot assay圖5抑制TLR4后Western blot檢測各組自噬和炎癥相關(guān)蛋白表達

3 討論

一些流行病學(xué)研究證據(jù)表明，PM2.5可增加心血管病的發(fā)病率和死亡率，人們長期暴露在PM2.5環(huán)境中，心血管疾病病死率可升高22%［10-11］。Gold等［12］研究發(fā)現(xiàn)，短期暴露于大量PM2.5中所導(dǎo)致的心血管疾病死亡率（69%）高于由其導(dǎo)致的呼吸系統(tǒng)疾病死亡率（28%）。而AS作為心血管疾病的病理基礎(chǔ)，發(fā)病機制至今尚未完全闡明。研究表明，除已知的高血壓、糖尿病、血脂異常、吸煙等因素外，PM2.5也是導(dǎo)致AS發(fā)生的獨立危險因素，并可影響粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性［3］。但是PM2.5對AS的影響機制有待進一步完善?，F(xiàn)有研究表明PM2.5致AS作用與其致炎效應(yīng)有關(guān)［4,13-14］。巨噬細胞是AS的主要炎癥細胞，且巨噬細胞的自噬能力與AS斑塊的穩(wěn)定性呈正相關(guān)［15］。因此，本實驗從自噬的角度，以Raw264.7巨噬細胞為實驗對象，從細胞及分子水平探討PM2.5加重炎癥反應(yīng)的機制，為AS的防治提供新的理論基礎(chǔ)。

3.1 PM2.5對巨噬細胞自噬的影響 自噬是細胞在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子的高度保守過程，主要過程包括吞噬泡-雙膜自噬體-自噬溶酶體。自噬雙層膜形成到自噬溶酶體降解的整個動態(tài)過程稱為自噬流（通量）。LC3和p62被廣泛用于自噬的基礎(chǔ)研究。自噬形成時，LC3Ⅰ（胞漿型）向LC3Ⅱ（膜型）轉(zhuǎn)化，LC3Ⅱ/Ⅰ的比值可反映自噬小體形成的數(shù)量和自噬水平。自噬溶酶體形成障礙時，p62降解受阻而堆積，因此細胞內(nèi)p62表達水平與自噬活性呈負相關(guān)。LAMP作為溶酶體膜的主要構(gòu)成蛋白，可反映自噬小體與溶酶體的融合。有研究認為LAMP2缺失可阻礙自噬體與溶酶體的融合［16］。CTSB作為溶酶體的標志性酶蛋白，可反映溶酶體水解功能。既往研究表明，PM2.5可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生［17-18］，但是缺少PM2.5對自噬過程影響機制的研究。本實驗以Raw264.7巨噬細胞為實驗對象，探討空氣污染物PM2.5對巨噬細胞自噬的影響機制。結(jié)果顯示，PM2.5對Raw264.7巨噬細胞的活性影響具有濃度和時間依賴性。且PM2.5刺激后的Raw264.7巨噬細胞內(nèi)出現(xiàn)較多的自噬空泡及自噬小體，提示PM2.5可能誘發(fā)了巨噬細胞自噬的保護機制，但其中自噬溶酶體較少見，同時使用Ad-mCherry-GFP-LC3B轉(zhuǎn)染巨噬細胞后，Rap組的綠色熒光淬滅較PM2.5組明顯，Merge后PM2.5組黃紅熒光比值高于對照組和Rap組，進而提示PM2.5雖然觸發(fā)了巨噬細胞自噬，但下游自噬小體與溶酶體融合障礙，自噬流異常。Western blot結(jié)果也提示反映自噬水平的LC3Ⅱ/Ⅰ、p62以及反映溶酶體功能的CTSB表達增高，但是反映自噬小體與溶酶體結(jié)合的LAMP2表達下降。進一步說明PM2.5誘發(fā)巨噬細胞自噬，但阻斷了自噬小體與溶酶體的融合。以上結(jié)果表明PM2.5對巨噬細胞自噬的影響機制是通過阻斷自噬小體與溶酶體的融合，從而使自噬通量下游阻斷，自噬流不完整，從而導(dǎo)致自噬功能障礙來實現(xiàn)的。

3.2 PM2.5影響下巨噬細胞自噬與炎癥的相互作用NLRP3可在AS的病變中檢出，抑制NLRP3可以抑制泡沫細胞的形成，其活化可造成粥樣斑塊的不穩(wěn)定［19］。有研究發(fā)現(xiàn)Toll樣受體（TLRs）與AS的形成密切相關(guān)［20］，而PM2.5可通過TLR4/MyD88/NFκB通路激活NLRP3炎癥小體，促進泡沫細胞的產(chǎn)生和易損斑塊的形成，從而促進AS的發(fā)生發(fā)展［3］。既往研究表明，自噬和炎性小體均參與了AS的發(fā)生發(fā)展［3,17］。炎性小體與自噬存在相互調(diào)節(jié)作用，自噬功能障礙可導(dǎo)致NLRP3炎性小體的激活，是炎性小體的重要調(diào)節(jié)器［21］。同時，炎性小體也可在自噬啟動、LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化等方面調(diào)節(jié)自噬［22-23］。但目前尚無對PM2.5影響下巨噬細胞自噬與炎癥相互影響的相關(guān)研究。

本實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，PM2.5組TLR4、NLRP3和促炎因子IL-1β、IL-18表達增加，IL-10表達下降。這與現(xiàn)有的研究結(jié)果基本一致［24］，表明PM2.5可增加巨噬細胞炎癥反應(yīng)。但PM2.5增加炎癥反應(yīng)的具體機制不完全明確。本實驗結(jié)果還顯示，與對照組相比，PM2.5組和HCQ組的NLRP3、IL-1β和IL-18表達均增加，IL-10表達下降，提示PM2.5在抑制自噬的同時促進炎性小體和促炎因子的表達、抑制抗炎因子的表達；表明PM2.5加重巨噬細胞炎癥反應(yīng)與其抑制自噬有關(guān)。進一步表明PM2.5作為致病因素進入循環(huán)系統(tǒng)后，影響巨噬細胞活性并誘發(fā)炎癥反應(yīng)，從而促發(fā)機體產(chǎn)生自噬這一保護機制，但阻斷了下游自噬小體和溶酶體融合，從而影響巨噬細胞自噬通量及自噬功能，使包括炎性小體在內(nèi)的自噬內(nèi)容物降解受阻，進而加重巨噬細胞炎癥反應(yīng)。同時，與對照組、PM2.5組和HCQ組相比，PM2.5+HCQ組的NLRP3、IL-1β和IL-18的增加及IL-10的下降更顯著，提示PM2.5和HCQ對巨噬細胞炎癥反應(yīng)的促進作用有疊加效應(yīng)，暴露于PM2.5后進一步抑制自噬可加重巨噬細胞炎癥反應(yīng)。且PM2.5組TLR4表達高于對照組；而與PM2.5組比較，PM2.5+TAK-242組TLR4、NLRP3、IL-1β及IL-18表達均下降，IL-10表達增加，而自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、CTSB表達也降低，LAMP2表達增加，表明抑制TLR4后PM2.5對自噬的抑制作用減弱，提示PM2.5抑制自噬的機制可能是由TLR4介導(dǎo)的。

綜上，本實驗結(jié)果表明，PM2.5可降低Raw264.7巨噬細胞活性，并具有濃度和時間依賴性；PM2.5進入循環(huán)系統(tǒng)后可觸發(fā)炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)巨噬細胞發(fā)生自噬，但阻礙自噬小體與溶酶體融合，破壞自噬通量，從而使自噬內(nèi)容物降解受阻，進而促進炎性小體活化和促炎因子的表達，誘發(fā)加重炎癥反應(yīng)，且該過程可能由TLR4所介導(dǎo)。由此，筆者推測PM2.5抑制自噬、加重巨噬細胞炎癥反應(yīng)可能是AS的發(fā)病機制之一，誘導(dǎo)自噬可能削弱PM2.5的致炎效應(yīng)而對AS起保護作用。