circMTO1調(diào)控Wnt/β-catenin抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的機(jī)制研究

蘇亞靜，吳煥良，敬波，吳燦章

乳腺癌是常見的惡性腫瘤，也是全球女性因癌癥死亡的主要原因之一［1］。隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，乳腺癌患者的生存率已有了明顯的提升，但整體預(yù)后情況仍較差［2］。研究顯示，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者預(yù)后重要影響因素之一［3］。因此，確定乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛在分子機(jī)制對開發(fā)新的治療靶點非常重要。環(huán)狀RNA MTO1（circMTO1）是腫瘤相關(guān)環(huán)狀RNA之一。研究顯示，circMTO1在包括卵巢癌和腎細(xì)胞癌在內(nèi)的多種腫瘤中低表達(dá)，發(fā)揮著抑癌基因的作用［4-5］。Chen等［6］研究顯示，circMTO1在宮頸癌細(xì)胞系和腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，其可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲，增加化療耐藥性，并可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。因此，circMTO1在不同腫瘤中發(fā)揮的作用可能相反，但鮮見circMTO1與乳腺癌的相關(guān)研究。研究表明，circMTO1可通過降低Wnt/β-catenin、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）/母系DPP同源物以及表皮生長因子受體（EGFR）信號通路活性，抑制結(jié)直腸癌和膽囊癌的惡性進(jìn)展［7-8］。Wnt/β-catenin信號通路的激活可促進(jìn)乳腺癌的惡性進(jìn)展，抑制該通路活性有望成為抗腫瘤治療的新思路［9］。本研究旨在探討circMTO1與乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、HCC-70、MCF-7和人乳腺正常細(xì)胞系MCF-10A購自美國ATCC細(xì)胞庫；RPMI 1640培養(yǎng)基、Eagle培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素和胰酶購自美國Invitrogen公司；Trizol、SYBR Premix EX Taq試劑盒和實時熒光定量PCR（qPCR）實驗檢測試劑盒購自日本TAKARA試劑公司；氯仿、異丙醇和無水乙醇購自深圳中粵化學(xué)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Fermentas公司；circMTO1過表達(dá)和circMTO1敲減質(zhì)粒購自上海吉瑪基因技術(shù)有限公司；MTS試劑購自上海同仁化學(xué)技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Transwell小室購自北京Solarbio試劑公司；蘇木素和熒光素酶活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RIPA蛋白裂解液和BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒、Lip2000購自美國Thermo公司；PVDF膜購自美國Promega公司；Wnt3a、βcatenin、cMyc、Cyclin D1、基質(zhì)金屬蛋白酶7（MMP7）和GAPDH一抗、HRP偶聯(lián)的羊抗兔、羊抗鼠二抗購自英國Abcam公司。

1.2 臨床樣本 選取2018年9月—2020年6月于海南醫(yī)學(xué)院附屬儋州市人民醫(yī)院就診的102例浸潤性乳腺癌患者，收集患者的癌組織及癌旁組織，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2012年《乳腺腫瘤WHO分類》。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者術(shù)前未接受化療、放療、內(nèi)分泌或其他任何形式的治療；具備手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織和癌旁組織；具有完整的臨床病理資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他器官腫瘤；發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移?；颊呔炇鹬橥鈺?/p>

1.3 研究方法

1.3.1 qPCR檢測乳腺癌組織中circMTO1的相對表達(dá)水平 使用TRIzol試劑從乳腺癌組織中提取總RNA。采用紫外分光光度儀對RNA樣品進(jìn)行純度與濃度的檢測，光密度（OD）260/280為1.8～2.0。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒在70℃下孵育10 min，室溫下以1 000×g離心20 min，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。circMTO1引物：上游5'-GCATCGGAAAGGGACATTTA-3'，下游5'-AGCTCTCAGACCCCACACAG-3'；GAPDH引物：上游5'-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3'，下游5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'。反應(yīng)體系：SYBR Premix EX TaqTM（2×）12.5μL，PCR上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA模板2 μL，dH2O 9.5 μL。熱循環(huán)條件：45℃逆轉(zhuǎn)錄5 min，94℃30 s；94℃退火5 s、60℃延伸30 s，40個循環(huán)，每個樣品重復(fù)3次。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算circMTO1的相對表達(dá)水平。

1.3.2 乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染MDA-MB-231、HCC-70、MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)在含有100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中；MCF-10A細(xì)胞培養(yǎng)在含有20μg/L EGF、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素、10%胎牛血清的Eagle培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞均在37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每24 h更換1次新鮮培養(yǎng)基，并在細(xì)胞密度為90%時，采用胰酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代。

參 照1.3.1，采 用qPCR檢 測MDA-MB-231、HCC-70、MCF-7和MCF-10A細(xì)胞中circMTO1的相對表達(dá)量，并選取circMTO1表達(dá)量中等的乳腺癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染circMTO1過表達(dá)和circMTO1敲減質(zhì)粒。細(xì)胞生長狀態(tài)較好時，胰酶進(jìn)行消化并計數(shù)，以2×105個細(xì)胞接種至6孔板中，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，細(xì)胞分為NC組、oe-circMTO1組和sh-circMTO1組。采用Lip2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其中NC組細(xì)胞轉(zhuǎn)染5μg無關(guān)序列，oe-circMTO1組細(xì)胞轉(zhuǎn)染5μg circMTO1過表達(dá)質(zhì)粒，sh-circMTO1組細(xì)胞轉(zhuǎn)染5μg circMTO1敲減質(zhì)粒，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，參照1.3.1，采用qPCR檢測各組細(xì)胞circMTO1的相對表達(dá)量。

1.3.3 MTS實驗檢測各組細(xì)胞增殖能力 采用胰酶將轉(zhuǎn)染48 h的NC組、oe-circMTO1組和sh-circMTO1組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次后，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，將細(xì)胞調(diào)至1×104個/mL。取100μL細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每組設(shè)置6個復(fù)孔，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。在細(xì)胞貼壁的第0、24、48和72 h時更換新鮮培養(yǎng)基并加入20μL的MTS試劑，采用全波長自動掃描儀檢測490 nm處的OD值。

1.3.4 Transwell實驗檢測各組細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力 采用胰酶將轉(zhuǎn)染48 h的NC組、oe-circMTO1組和sh-circMTO1組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，無血清培養(yǎng)基洗3次后，加入無血清培養(yǎng)基，將 細(xì) 胞 調(diào) 至1×106個/mL。取100 μL細(xì) 胞 懸 液 接 種 于Transwell小室的上室中，下室中加入500μL添加10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，每組3個復(fù)孔，放置37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)12 h。無菌棉簽輕輕擦去上室表面細(xì)胞，PBS洗3次后采用5%戊二醛固定細(xì)胞10 min，蘇木素染色20 min，PBS洗3次，顯微鏡下計數(shù)各組穿膜的細(xì)胞數(shù)。

1.3.5 TOP/FOP熒光素酶實驗檢測各組細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路活性 細(xì)胞生長狀態(tài)較好時，胰酶進(jìn)行消化并計數(shù)，以2 000個細(xì)胞接種至96孔板，于37℃、5%CO2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，細(xì)胞分為NC組、oe-circMTO1組和shcircMTO1組。采用Lip2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，3組分別轉(zhuǎn)染1μg無關(guān)序列、1μg circMTO1過表達(dá)質(zhì)粒和5μg circMTO1敲減質(zhì)粒，并同時轉(zhuǎn)染1μg TOP/FOP質(zhì)粒，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用雙熒光素酶活性檢測試劑盒測定各組細(xì)胞中熒光素酶活性。

1.3.6 Western blot實驗檢測各組細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá) 將NC組、oe-circMTO1組和sh-circMTO1組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后采用預(yù)冷的PBS洗滌，加入含有1%蛋白酶抑制劑混合物的蛋白裂解液，在冰上裂解30 min。14 000 r/min離心30 min，裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞蛋白，采用BCA檢測試劑盒檢測蛋白濃度。取50μg蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并采用常規(guī)濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉膜后采用一抗Wnt3a（1∶500）、β-catenin（1∶1 000）、cMyc（1∶500）、Cyclin D1（1∶1 000）和MMP7（1∶1 000）4℃孵育過夜，采用羊抗鼠二抗（1∶10 000）37℃孵育1 h，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色。采用Image J軟件分析，以目的條帶蛋白的灰度值和內(nèi)參GAPDH蛋白的灰度值比值表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法；2組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circMTO1在乳腺癌組織中的相對表達(dá)量 與癌旁組織（1.04±0.35）相比，circMTO1在乳腺癌組織（0.87±0.29）中的相對表達(dá)水平降低（n=102，t=3.777，P＜0.05）。

2.2 circMTO1相對表達(dá)量與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 不同年齡、腫瘤大小、組織分級以及雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人表皮生長因子受體-2（HER-2）陰、陽性表達(dá)乳腺癌患者的circMTO1相對表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期為Ⅲ期的乳腺癌患者組織中circMTO1的相對表達(dá)水平較低（P＜0.01），見表1。

Tab.1 Comparison of circMTO1 expression in the breast cancer tissue of patients with different clinical pathological parameters表1不同臨床病理參數(shù)患者乳腺癌組織中circMTO1表達(dá)量比較 （±s）

Tab.1 Comparison of circMTO1 expression in the breast cancer tissue of patients with different clinical pathological parameters表1不同臨床病理參數(shù)患者乳腺癌組織中circMTO1表達(dá)量比較 （±s）

＊＊P＜0.01。

臨床參數(shù)年齡（歲）≤60＞60腫瘤大?。╟m）≤2＞2組織分級Ⅰ-ⅡⅢ淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無TNM分期Ⅰ-ⅡⅢER陽性陰性PR陽性陰性HER-2陽性陰性n 72 30 43 59 38 64 58 44 42 60 32 70 35 67 61 41 circMTO1相對表達(dá)量0.89±0.33 0.82±0.24 0.93±0.34 0.83±0.24 0.91±032 0.85±0.27 0.78±0.26 0.99±0.35 1.00±0.34 0.78±0.25 0.84±0.26 0.88±0.30 0.81±0.26 0.90±0.31 0.84±0.27 0.92±0.31 t 1.051 1.172 1.012 3.478＊＊3.767＊＊0.650 1.468 1.382

2.3 circMTO1在乳腺癌細(xì)胞系中的相對表達(dá)水平circMTO1在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、HCC-70、MCF-7和人正常乳腺細(xì)胞系MCF-10A中的相對表達(dá)水平分別為0.86±0.07、3.27±0.45、2.29±0.42和5.48±0.73（n=3，F(xiàn)=49.327，P＜0.01），與正常乳腺細(xì)胞系MCF-10A相比，circMTO1在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)均降低（P＜0.05）。選取MCF-7細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.4 各組細(xì)胞中circMTO1的相對表達(dá)水平比較 與NC組相比，oe-circMTO1組細(xì)胞中circMTO1相對表達(dá)水平增加，穿膜細(xì)胞數(shù)和Wnt/β-catenin信號通路活性減弱（P＜0.05），sh-circMTO1組細(xì)胞中circMTO1相對表達(dá)水平降低，穿膜細(xì)胞數(shù)和Wnt/βcatenin信號通路活性增強(qiáng)（P＜0.05），見表2，圖1。

Tab.2 Comparison of relative expression level,metastasis and Wnt/β-catenin of catenin signaling pathway between the three groups of cells表2各組細(xì)胞中circMTO1相對表達(dá)水平、轉(zhuǎn)移情況和Wnt/β-catenin信號通路活性的比較 （±s）

Tab.2 Comparison of relative expression level,metastasis and Wnt/β-catenin of catenin signaling pathway between the three groups of cells表2各組細(xì)胞中circMTO1相對表達(dá)水平、轉(zhuǎn)移情況和Wnt/β-catenin信號通路活性的比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與oe-circMTO1組比較，P＜0.05。

組別NC組oe-circMTO1組sh-circMTO1組F n 333 circMTO1相對表達(dá)水平1.01±0.02 3.57±0.55a 0.41±0.11ab 80.472＊＊穿膜細(xì)胞數(shù)（個/視野）69.33±6.81 32.67±4.25a 98.33±5.34ab 104.829＊＊TOP/FOP熒光素酶活性0.97±0.03 0.49±0.03a 1.69±0.12ab 202.667＊＊

Fig.1 Effect of circMTO1 on breast cancer cell metastasis detected by Transwell experiment(Hematoxylin staining,×200)圖1 circMTO1對乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的Transwell實驗檢測結(jié)果（蘇木素染色，×200）

2.5 各組細(xì)胞增殖能力比較 與NC組相比，在48 h、72 h時，oe-circMTO1組MCF-7細(xì)胞增殖能力降低，sh-circMTO1組MCF-7細(xì)胞增殖能力增加（P＜0.05），見圖2。

Fig.2 MTS detection of the effect of circMTO1 on the proliferation of breast cancer cells in each group圖2 MTS檢測circMTO1對各組乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

2.6 各組Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 與NC組相比，oe-circMTO1組Wnt3a、βcatenin、cMyc、Cyclin D1和MMP7蛋白相對表達(dá)水平降低，而sh-circMTO1組各蛋白相對表達(dá)水平增加（均P＜0.05），見圖3、表3。

Fig.3 Effects of circMTO1 on proteins related to Wnt/β-catenin signaling pathway in breast cancer cells圖3 circMTO1對乳腺癌細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的影響

Tab.3 Comparison of Wnt/β-catenin signaling pathwayrelated protein expressions between the three groups of cells表3各組細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平的比較 （n=3，±s）

Tab.3 Comparison of Wnt/β-catenin signaling pathwayrelated protein expressions between the three groups of cells表3各組細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平的比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與oe-circMTO1組比較，P＜0.05。

組別NC組oe-circMTO1組sh-circMTO1組F cMyc 0.52±0.02 0.17±0.02a 1.47±0.20ab 99.816＊＊Cyclin D1 0.64±0.05 0.28±0.02a 1.89±0.11ab 428.420＊＊MMP7 0.45±0.06 0.33±0.03a 1.97±0.18ab 203.837＊＊組別NC組oe-circMTO1組sh-circMTO1組F Wnt3a 0.42±0.04 0.15±0.02a 1.02±0.09ab 176.703＊＊β-catenin 0.48±0.05 0.19±0.03a 1.56±0.18ab 131.036＊＊

3 討論

乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，涉及多種調(diào)節(jié)因子和信號途徑。circRNA是新近發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA，為一個連續(xù)的共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)。circRNA在細(xì)胞功能調(diào)節(jié)、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展和心臟病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［10］。越來越多的證據(jù)表明，circRNA可作為腫瘤抑制基因或致癌基因，并參與調(diào)節(jié)各種腫瘤的惡性生物學(xué)行為，包括細(xì)胞的分化、增殖、轉(zhuǎn)移和化學(xué)敏感性等［11］。乳腺癌中異常表達(dá)的circRNA也被逐漸發(fā)現(xiàn)，有望作為乳腺癌診斷、治療及預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物［12］。

circMTO1最 初 由Han等［13］在 肝 細(xì) 胞 癌 環(huán) 狀RNA的表達(dá)譜中發(fā)現(xiàn)，circMTO1在肝細(xì)胞癌組織中呈異常低表達(dá)，且circMTO1低表達(dá)患者的預(yù)后較差。本研究結(jié)果顯示，circMTO1在乳腺癌組織中表達(dá)較癌旁組織顯著下調(diào)，且circMTO1低表達(dá)與乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期為Ⅲ期有關(guān)，表明circMTO1可能抑制乳腺癌的惡性進(jìn)展，提示circMTO1在乳腺癌中發(fā)揮著抑癌因子的作用，這與其在肝癌中發(fā)揮的作用一致［13］。與正常乳腺細(xì)胞系相比，circMTO1在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)降低，這與在組織中的檢測水平一致。circMTO1在卵巢癌和腎細(xì)胞癌中也發(fā)揮著抑癌因子的作用［4-5］。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)circMTO1具有抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力，敲減circMTO1后則可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，提示circMTO1可抑制乳腺癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展。

目前，circMTO1在乳腺癌中的作用機(jī)制尚不完全清楚。相關(guān)研究顯示，在結(jié)直腸癌中，circMTO1通過抑制Wnt/β-catenin信號通路活性，從而降低癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力［7］。Wnt/β-catenin信號通路可調(diào)控腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡和化療耐藥等多種生物學(xué)過程［14］。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)circMTO1顯著抑制乳腺癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路的活性，敲減circMTO1后乳腺癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路的活性增加，提示circMTO1可抑制乳腺癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路的活性。在正常生理狀態(tài)下，β-catenin破壞復(fù)合體抑制βcatenin蛋白的積累，Wnt/β-catenin信號通路處于失活狀態(tài)，在腫瘤細(xì)胞中，Wnt配體存在時，β-catenin破壞復(fù)合體被降解，β-catenin蛋白積累并異位至核內(nèi)，促使Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因激活，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能［15-16］。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)circMTO1顯著抑制乳腺癌細(xì)胞中Wnt/βcatenin信號通路下游增殖蛋白cMyc、Cyclin D1和下游轉(zhuǎn)移蛋白MMP7的表達(dá)，敲減circMTO1則反之，表明circMTO1通過抑制Wnt/β-catenin信號通路活性，從而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，circMTO1在乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)降低，且circMTO1具有抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力，抑制Wnt/β-catenin信號通路活性可能是其重要的作用機(jī)制之一。circMTO1具有作為乳腺癌治療分子靶標(biāo)的潛力。