橡膠樹蛋白激酶HbBIN2基因的克隆、蛋白表達(dá)純化及酶活分析

郭 靖，袁紅梅

橡膠樹蛋白激酶基因的克隆、蛋白表達(dá)純化及酶活分析

郭 靖，袁紅梅*

海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院/海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口 570228

橡膠樹是天然橡膠的唯一材料來源。寒害是橡膠樹面臨的主要自然災(zāi)害之一，嚴(yán)重限制了橡膠樹的生長(zhǎng)發(fā)育和種植區(qū)域分布，克隆和鑒定橡膠樹低溫應(yīng)答基因尤為重要。蛋白激酶BIN2（brassinosteroid insensitive 2）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在調(diào)控植物應(yīng)對(duì)低溫脅迫中發(fā)揮重要作用，但橡膠樹蛋白激酶HbBIN2還未被克隆與鑒定。本研究從橡膠樹cDNA中成功克隆出，序列分析表明：的開放閱讀框?yàn)?143 bp，編碼380個(gè)氨基酸，蛋白的分子量為42.9 kDa，理論等電點(diǎn)為8.74，是親水性蛋白且無跨膜結(jié)構(gòu)域。將構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET28a上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)菌株，摸索合適的誘導(dǎo)條件后成功誘導(dǎo)表達(dá)出HbBIN2蛋白。比較HbBIN2在不同的誘導(dǎo)溫度（16、28、37℃）、誘導(dǎo)時(shí)間（3、6、12 h）和IPTG濃度（0.1、0.3、0.5 mmol/L）下的表達(dá)量，結(jié)果表明，HbBIN2在37℃，0.3 mmol/L IPTG誘導(dǎo)12 h的表達(dá)量最大。對(duì)HbBIN2蛋白體外純化條件進(jìn)行探索，結(jié)果表明，100 mmol/L咪唑能將目的蛋白完全洗脫。純化HbBIN2蛋白并進(jìn)行激酶活性鑒定，結(jié)果表明，該蛋白具有激酶活性。該研究為后續(xù)HbBIN2蛋白功能分析和橡膠樹應(yīng)對(duì)低溫脅迫的調(diào)控機(jī)制研究提供參考，為橡膠樹耐寒品種分子育種提供重要的基因資源。

巴西橡膠樹；低溫脅迫；BIN2；蛋白純化；激酶活性

溫度是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量以及地理分布的重要環(huán)境因素[1-2]。低溫能夠使細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致定位在細(xì)胞膜上的蛋白不能正常發(fā)揮作用，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物死亡[3]。為了抵御低溫脅迫帶來的傷害，在長(zhǎng)期自然選擇過程中，植物已經(jīng)進(jìn)化出一系列精密且復(fù)雜的防御機(jī)制來適應(yīng)低溫脅迫，其中較為著名的是ICE-CBF-COR信號(hào)途徑[4]。ICE-CBF-COR轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)反應(yīng)在植物應(yīng)對(duì)低溫脅迫過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。當(dāng)遭遇低溫脅迫時(shí)，被迅速誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)而激活下游一系列冷應(yīng)答基因（cold responsive, COR）的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)植物對(duì)低溫的耐受能力[4]。除了ICE-CBF-COR信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)外，包括油菜素內(nèi)酯（brassinosteroid）在內(nèi)的植物激素在調(diào)控?cái)M南芥低溫脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用[4]。油菜素內(nèi)酯是一種植物甾體激素，在植物生長(zhǎng)、發(fā)育以及應(yīng)對(duì)生物脅迫和非生物脅迫中都發(fā)揮重要作用[4]。外源性施加油菜素內(nèi)酯類似物EBR，可以降低低溫脅迫下番茄幼苗中基因的表達(dá)[5]。糖原合酶激酶GSK3類激酶BIN2（brassinosteroid insensitive 2）是BR（brassinosteroid）信號(hào)通路中的重要調(diào)控因子，也參與調(diào)控植物的生物脅迫和非生物脅迫。有實(shí)驗(yàn)證明在棉花中，GhBIN2（brassinosteroid insensitive 2）與GhJAZ（jasmonate zim-domain）蛋白相互作用，在棉花抗黃萎病中起著負(fù)調(diào)節(jié)作用[6]。在大豆中，（brassinosteroid insensitive 2）提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥和大豆毛狀根的耐鹽性和抗旱性[7]。同時(shí)也有研究表明植物激素BR信號(hào)通路中的幾個(gè)關(guān)鍵因子在植物抵御寒害中起重要作用。例如（brassinosteroid insensitive 1）和能夠正調(diào)控CBFs的表達(dá)，導(dǎo)致下游基因的上升，進(jìn)而正調(diào)控植物的耐寒性[8-9]；此外，通過降低的轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致的表達(dá)量下降，使植物對(duì)低溫脅迫更敏感[10]。因此，是油菜素內(nèi)酯信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，參與調(diào)控包括低溫脅迫在內(nèi)的多種逆境脅迫應(yīng)答。

目前，雖然植物應(yīng)對(duì)低溫脅迫的分子機(jī)制在擬南芥中已經(jīng)研究得比較透徹，但是橡膠樹如何應(yīng)對(duì)低溫脅迫的分子機(jī)理研究仍處于起步階段。橡膠樹是天然橡膠的主要來源，原產(chǎn)地是亞馬遜熱帶雨林。作為典型的熱帶作物，橡膠樹對(duì)低溫脅迫非常敏感[11-12]。寒害是我國(guó)橡膠樹面臨的主要自然災(zāi)害之一，嚴(yán)重影響橡膠樹的生長(zhǎng)發(fā)育和地理分布。因此，研究橡膠樹的抗寒機(jī)制，選育抗寒性強(qiáng)的橡膠樹品種顯得尤為重要。橡膠樹應(yīng)對(duì)低溫脅迫的機(jī)制研究還十分有限，目前橡膠樹中ICE-CBF信號(hào)通路的關(guān)鍵基因[13]、[12, 14]已被相繼克隆和鑒定，但橡膠樹中調(diào)控ICE-CBF信號(hào)通路的關(guān)鍵因子還有待深入研究。在擬南芥中，蛋白激酶BIN2能夠調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子ICE1的穩(wěn)定性進(jìn)而負(fù)調(diào)控植物的耐寒性[10]，橡膠樹中的HbBIN2的功能如何尚不清楚。本研究克隆鑒定了橡膠樹中的基因并表達(dá)和純化了HbBIN2蛋白，同時(shí)分析了HbBIN2蛋白激酶的活性。該研究旨在為后續(xù)HbBIN2蛋白功能分析和橡膠樹應(yīng)對(duì)低溫脅迫應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制研究提供參考，為橡膠樹耐寒品種育種篩選可靠的基因資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

橡膠樹組培苗‘熱研7-33-97’購(gòu)于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所。RNA提取試劑盒購(gòu)于BioTEKE生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司，限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB生物公司，酶、感受態(tài)細(xì)胞、蛋白預(yù)染Marker購(gòu)自TRANS公司。質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)于諾唯贊生物科技股份有限公司，BeyoGold? His-tag Purification Resin、Kinase-Lumi?超強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法激酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司。pET-28a載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1基因擴(kuò)增與生物信息學(xué)分析 以擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)（TAIR）中的AtBIN2蛋白序列為誘餌，在NCBI中用tblastn搜索到橡膠樹中高度同源的基因。提取橡膠樹的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用特異性引物（F: ggatc-cATGGCTGATGATAAG;R: ctcgag-TCATGTCCCAGCCA）擴(kuò)增。用SeqBuil-der對(duì)HbBIN2的序列進(jìn)行分析。利用在線軟件ProtParam（https://web.expasy.org/protparam）和ProtScale（https://web.expasy.org/protscale）對(duì)HbBIN2的理化性質(zhì)及親疏水性進(jìn)行分析，利用TMHMM對(duì)HbBIN2的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，并用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy. org）同源建模HbBIN2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.2 原核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定 將擴(kuò)增出的和pET-28a載體用HⅠ和Ⅰ兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。膠回收酶切產(chǎn)物后用T4連接酶進(jìn)行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α。挑取單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將PCR擴(kuò)增結(jié)果為陽性的送測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET28a-HbBIN2轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）中，并利用菌落PCR驗(yàn)證。

1.2.3 篩選和優(yōu)化原核表達(dá)條件 將重組質(zhì)粒pET28a-HbBIN2轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）中，將經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性的單克隆菌株轉(zhuǎn)接到含有Kan抗生素的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)的菌株按1∶100的比例轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)2～3 h后，測(cè)量值。當(dāng)培養(yǎng)至值為0.6時(shí)，取出1 mL未加IPTG的菌液作為空白對(duì)照，剩余加入不同濃度的IPTG（0.1、0.3、0.5 mmol/L）進(jìn)行誘導(dǎo)。在不同的誘導(dǎo)時(shí)間（3、6、12 h）及誘導(dǎo)溫度（16、28、37℃）進(jìn)行取樣。將收集到的菌體用適量非變性裂解液（50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl, pH 8.0）進(jìn)行重懸，將重懸液和SDS上樣緩沖液混勻后高溫變性。每個(gè)樣品取20 μL，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)pET28a-HbBIN2的原核表達(dá)情況，以找到最優(yōu)的表達(dá)濃度、表達(dá)時(shí)間及表達(dá)溫度。

1.2.4 重組蛋白純化 將IPTG加入到100 mL菌液中至終濃度為0.3 mmol/L，37℃過夜表達(dá)。將菌體收集在50 mL離心管中，加入5 mL非變性裂解液重懸，樣品置于冰盒內(nèi)，超聲破碎15 min（每次超聲波破碎10 s，停止10 s，以防止樣品過熱導(dǎo)致蛋白降解），4℃離心，5000′，10 min。將上清加入平衡好的His-tag Purification Resin中進(jìn)行蛋白純化，用不同濃度的咪唑（50、100、150 mmol/L）洗脫，收集洗脫液取20 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳，其余存放至?80℃冰箱。

1.2.5 HbBIN2激酶活性檢測(cè) 配制每孔反應(yīng)液BIN2（5 μL）、激酶反應(yīng)緩沖液（Tris-HCl 20 mmol/L、pH 7.5，MgCl210 mmol/L，NaCl 100 mmol/L，ATP 25 mmol/L，DTT 1 mmol/L）、激酶檢測(cè)試劑（50 μL），共100 μL。對(duì)照組為PBS（5 μL）、激酶反應(yīng)緩沖液（45 μL）、激酶檢測(cè)試劑（50 μL）。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組重復(fù)。根據(jù)Kinase- Lumi?超強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法激酶活性檢測(cè)試劑盒說明書制作ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線。在0、0.25、0.5、0.75、1、2、4、8、12、24 h分別檢測(cè)ATP的剩余量。根據(jù)熒光強(qiáng)度得知ATP的剩余量，進(jìn)而計(jì)算出ATP的消耗量。選取反應(yīng)時(shí)間為1 h的熒光強(qiáng)度，根據(jù)ATP的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算激酶活性。HbBIN2激酶活性(U/L)=(△×100 μL)/(斜率××HbBIN2)，△=HbBIN2熒光強(qiáng)度-PBS熒光強(qiáng)度，斜率=ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，=1 h，HbBIN2=5 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbBIN2基因的克隆及生物信息學(xué)分析

利用特異性引物（F: ggatccATGGC-TGATGATAAG;R: ctcgag TCATGTCCC-AGCCA）和高保真酶Prime STARTM，以橡膠樹葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小約1100 bp（圖1A）。經(jīng)Sanger測(cè)序，擴(kuò)增產(chǎn)物基因全長(zhǎng)為1143 bp，與橡膠樹基因組注釋的序列完全相同。利用SeqBuilder對(duì)序列進(jìn)行分析，編碼380個(gè)氨基酸，分子量為42.9 kDa（圖1B）。利用在線軟件ProtParam（https://web. expasy.org/ protparam）對(duì)HbBIN2蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)HbBIN2理論等電點(diǎn)（pI）為8.74，不穩(wěn)定指數(shù)為42.16。利用ProtScale（https://web.expasy.org/ protscale）在線軟件對(duì)HbBIN2進(jìn)行親水性和疏水性分析，結(jié)果表明HbBIN2為親水蛋白（圖1C）。利用SWISS-MODEL（https:// swissmodel. expasy. org）在線軟件構(gòu)建HbBIN2蛋白的三維結(jié)構(gòu)，a-螺旋占總氨基酸數(shù)的36.58%、β-折疊占22.9%、無規(guī)則卷曲占40.53%（圖1D）。對(duì)蛋白HbBIN2進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白無跨膜區(qū)（圖1E）。

圖1 HbBIN2的擴(kuò)增和生物信息學(xué)分析

2.2 原核表達(dá)載體pET28a-HbBIN2的構(gòu)建與鑒定

為了研究蛋白激酶HbBIN2的功能，將HbBIN2構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET28a上，并將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET28a-HbBIN2轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）中。利用引物HbBIN2F/HbBIN2R進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，菌落PCR結(jié)果所得條帶大小與預(yù)期一致（圖2），表明pET28a-HbBIN2成功轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）中，陽性克隆可以用于誘導(dǎo)和純化HbBIN2蛋白。

2.3 篩選和優(yōu)化原核表達(dá)條件

為了研究HbBIN2在大腸桿菌BL21中的表達(dá)條件，本研究設(shè)置了不同的誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度以及誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行篩選。溫度篩選結(jié)果表明，在IPTG濃度為0.5 mmol/L時(shí)，于16、28、37℃誘導(dǎo)9 h均能誘導(dǎo)出目的蛋白，其中在37℃下HbBIN2誘導(dǎo)量最大，表明37℃為最優(yōu)誘導(dǎo)溫度（圖3A）。在最優(yōu)誘導(dǎo)溫度37℃誘導(dǎo)9 h條件下，比較分析了0.1、0.3、0.5 mmol/L 3個(gè)IPTG誘導(dǎo)濃度，結(jié)果表明，0.3 mmol/L IPTG為最適濃度（圖3B）。將pET28a-HbBIN2菌株在37℃、0.3 mmol/L IPTG濃度下分別誘導(dǎo)3、6、9、12 h，結(jié)果表明HbBIN2在12 h誘導(dǎo)表達(dá)量最大（圖3C）。綜上，HbBIN2蛋白表達(dá)的最優(yōu)條件為37℃，0.3 mmol/L IPTG誘導(dǎo)12 h。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明，在該條件誘導(dǎo)的HbBIN2蛋白大部分為可溶性蛋白（圖3D）。

M: D2000 plus DNA marker.

M: Protein marker；CK：E. coli BL21（轉(zhuǎn)化有pET28a-HbBIN2）菌株在IPTG誘導(dǎo)前的全蛋白。

2.4 蛋白純化

將轉(zhuǎn)化有pET28a-HbBIN2的BL21（DE3）菌株在37℃、0.3 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)12 h，收集菌體并進(jìn)行超聲波破碎，取上清，利用Ni柱進(jìn)行純化。Wash buffer洗滌后，用50、100、150 mmol/L咪唑進(jìn)行梯度洗脫。收集洗滌液及洗脫液，取20 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果表明，50 mmol/L和100 mmol/L咪唑洗脫液（泳道4～5）均能洗脫出目的蛋白HbBIN2, 其中100 mmol/L咪唑?qū)⒛康牡鞍淄耆疵摚▓D4）。

2.5 激酶活性測(cè)定

為了研究HbBIN2的激酶活性，本研究利用激酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)純化的HbBIN2蛋白激酶活性。通過測(cè)定ATP的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)方程=5954+2122，2=0.9945，為ATP的剩余量。在1 h時(shí)，根據(jù)1.2.5中的公式算出HbBIN2的激酶活性為1.098 U/L。反應(yīng)12 h以后，ATP的消耗量趨于平穩(wěn)，不再上升，說明HbBIN2的磷酸化狀態(tài)趨于平穩(wěn)（圖5）。

3 討論

橡膠樹（）是典型的熱帶雨林樹種，對(duì)低溫非常敏感[11]。低溫顯著限制了橡膠樹的地理分布、生長(zhǎng)發(fā)育和膠乳產(chǎn)量[11, 15]。我國(guó)是非傳統(tǒng)植膠區(qū)，橡膠樹經(jīng)常遭遇低溫寒害的影響，提高橡膠樹品種的耐寒性具有重要意義。由于橡膠樹全基因組測(cè)序相對(duì)較晚，并且橡膠樹轉(zhuǎn)基因技術(shù)還不成熟，橡膠樹應(yīng)對(duì)低溫冷脅迫的分子機(jī)制研究還處于起步階段，嚴(yán)重阻礙了利用分子生物學(xué)手段提高橡膠樹冷耐受性的研究?？寺『丸b定橡膠樹低溫應(yīng)答過程中的關(guān)鍵基因及闡明其調(diào)控橡膠樹應(yīng)對(duì)低溫脅迫的機(jī)制對(duì)橡膠樹耐寒品種的選育具有重要意義。為了抵御低溫脅迫帶來的傷害，在長(zhǎng)期自然選擇過程中，植物已經(jīng)進(jìn)化出一系列精密且復(fù)雜的防御機(jī)制來適應(yīng)低溫脅迫，其中研究最為廣泛的是ICE-CBF低溫應(yīng)答信號(hào)途徑[3, 16]。最近研究表明植物激素油菜素內(nèi)酯（BR）能協(xié)調(diào)ICE/CBF冷信號(hào)通路調(diào)控植物耐冷性[3, 17]。例如，BR信號(hào)中的轉(zhuǎn)錄因子BZRⅠ/ BESⅠ和可以激活CBFs和下游基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控植物低溫耐受性。此外，BR信號(hào)通路中的關(guān)鍵激酶BIN2可以通過磷酸化BZRⅠ/BESⅠ，降低和基因的表達(dá)，導(dǎo)致植物的耐寒性降低[8]。進(jìn)一步研究表明，擬南芥的BIN2還能夠磷酸化ICE1，從而導(dǎo)致抑制下游的表達(dá)負(fù)調(diào)控植物低溫耐受性[10]。以上研究表明擬南芥中BIN2是調(diào)控植物低溫應(yīng)答的關(guān)鍵基因，但橡膠樹中的基因還未被克隆與鑒定。本研究成功克隆出，其開放閱讀框?yàn)?143 bp，編碼380個(gè)氨基酸。

M：Protein marker；1：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌裂解液結(jié)合鎳柱后的穿流液；2～3：Wash buffer洗脫雜蛋白的流出液；4～6：50、100、150 mmol/L咪唑洗脫液。

圖5 HbBIN2自身磷酸化動(dòng)力學(xué)曲線

蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是調(diào)控植物低溫脅迫應(yīng)答的重要蛋白質(zhì)翻譯后修飾調(diào)控方式。ABA信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白激酶OST1（open stomata 1），是第一個(gè)被證明能夠磷酸化ICE1蛋白的激酶，正調(diào)控?cái)M南芥抵御低溫脅迫的能力[18]。在水稻中，OsMPK3可以增強(qiáng)OsICE1蛋白的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性[19]。與此相反的是，擬南芥中的3個(gè)蛋白激酶MPK3、MPK6和GSK3-like BIN2通過磷酸化ICE1，降低ICE1蛋白的穩(wěn)定性及其與下游靶標(biāo)的結(jié)合能力，負(fù)調(diào)控?cái)M南芥的耐寒能力[10, 20-21]。本研究在.BL21（DE3）菌株中成功誘導(dǎo)表達(dá)和純化HbBIN2蛋白。在研究蛋白質(zhì)磷酸化修飾的實(shí)驗(yàn)中，需要利用標(biāo)簽將目的蛋白純化出來，因此經(jīng)常會(huì)將目的蛋白與標(biāo)簽融合。標(biāo)簽的帶電荷情況、大小、親水性等是影響目的蛋白可溶性表達(dá)的重要因素。本研究采用的是His蛋白標(biāo)簽，研究表明使用His蛋白標(biāo)簽后，HbBIN2在上清和沉淀中均有表達(dá)，且在上清中的表達(dá)量比沉淀中多。在純化HbBIN2蛋白的過程中，增加融合蛋白與鎳柱基質(zhì)低溫結(jié)合時(shí)間，可提高His標(biāo)簽蛋白與鎳柱的結(jié)合效率。在wash buffer中添加2 mmol/L咪唑，可提高目的蛋白純度。激酶活性實(shí)驗(yàn)證明所純化的HbBIN2蛋白具有激酶活性，并且本課題組未發(fā)表數(shù)據(jù)證明HbBIN2可以和橡膠樹低溫應(yīng)答途徑中的關(guān)鍵蛋白相互作用，暗示HbBIN2可能通過磷酸化該蛋白來調(diào)控橡膠樹的耐寒性。我們將利用Phos-tag gel電泳-免疫印跡結(jié)合的蛋白質(zhì)磷酸化分析方法做進(jìn)一步的驗(yàn)證。

激酶調(diào)控自身活性的最普遍方式之一就是自身磷酸化。有報(bào)道表明，擬南芥中的AtBIN2能夠磷酸化自身的Y200位點(diǎn)來改變自身的激酶活性[22]。Y200位點(diǎn)自身磷酸化后能夠?qū)е碌鞍准っ窧IN2活化，使其能夠磷酸化特異性底物[23]。但融合蛋白的標(biāo)簽、蛋白的穩(wěn)定性等都可能影響激酶活性。本研究表明，HbBIN2蛋白具有自身磷酸化的激酶活性，His標(biāo)簽并不影響B(tài)IN2的激酶活性，為進(jìn)一步研究其磷酸化位點(diǎn)和功能，探究BIN2在橡膠樹抗寒中的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為橡膠樹耐寒品種育種提供可靠的基因資源。

[1] DING Y, SHI Y, YANG S. Advances and challenges in uncovering cold tolerance regulatory mechanisms in plants[J]. The New Phytologist, 2019, 222(4): 1690-1704.

[2] SONG Y, ZHANG X, LI M, YANG H, FU D, LV J, DING Y, GONG Z, SHI Y, YANG S. The direct targets of CBFs: in cold stress response and beyond[J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2021, 63(11): 1874-1887.

[3] SHI Y, DING Y, YANG S. Molecular regulation of CBF signaling in cold acclimation[J]. Trends in Plant Science, 2018, 23(7): 623-637.

[4] CORVALáN C, CHOE S. Identification of brassinosteroid genes in[J]. BMC Plant Biology, 2017, 17(1): 5.

[5] LEE J, SHIM D, MOON S, KIM H, BAE W, KIM K, KIM Y H, RHEE S K, HONG C P, HONG S Y, LEE Y J, SUNG J, RYU H. Genome-wide transcriptomic analysis of BR-def-icient Micro-Tom reveals correlations between drought stress tolerance and brassinosteroid signaling in tomato[J]. Plant Physiology and Biochemistry: PPB, 2018, 127: 553-560.

[6] SONG Y, ZHAI Y, LI L, YANG Z, GE X, YANG Z, ZHA-N-G C, LI F, REN M. BIN2 negatively regulates plant defe-nce againstinand cotton[J]. Plant Biotechnology Journal, 2021, 19(10): 2097-2112.

[7] WANG L S, AN-YU S U, XIAO-XIA W U, CHEN Q S, XIN D W, ZHAO-MING Q I, ZHANG C, SI-NAN L I, JIN Y M, MO L I. Overexpression of, a soybean glycogen synthase kinase 3 gene, enhances tolerance to salt and drought in transgenic arabidopsis and soybean hairy roots[J]. Journal of Integrative Agriculture, 2018, 17(9): 1959-1971.

[8] LI H, YE K, SHI Y, CHENG J, ZHANG X, YANG S. BZR1 positively regulates freezing tolerance via CBF-dependent and CBF-independent pathways in[J]. Molecular Plant, 2017, 10(4): 545-559.

[9] ZHAO J, PENG P, SCHMITZ R J, DECKER A D, TAX F E, LI J. Two putative BIN2 substrates are nuclear components of brassinosteroid signaling[J]. Plant Physiology, 2002, 130(3): 1221-1229.

[10] YE K, LI H, DING Y, SHI Y, SONG C, GONG Z, YANG S. BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE2 negatively regulates the stability of transcription factor ICE1 in response to cold stress in[J]. The Plant Cell, 2019, 31(11): 2682- 2696.

[11] PRIYADARSHAN P M, HOA T T T, HUASUN H, GONALVES P DE S. Yielding potential of rubber () in sub-optimal environments[J]. Journal of Crop Improvement, 2005, 14(1/2): 221-247.

[12] CHEN W J, WANG X, YAN S, HUANG X, YUAN H M. The ICE-like transcription factor HbICE2 is involved in jasmonate-regulated cold tolerance in the rubber tree ()[J]. Plant Cell Reports, 2019, 38(6): 699-714.

[13] CHENG H, CAI H, FU H, AN Z, FANG J, HU Y, GUO D, HUANG H. Functional characterization ofCRT/DRE binding factor 1 gene revealed regulation potential in the CBF pathway of tropical perennial tree[J]. PLoS One, 2015, 10(9): e0137634.

[14] YUAN H M, SHENG Y, LU Y Q, CHEN W J, TANG X, HUANG X. Overexpression ofHbICE1 enhances cold tolerance in[J]. Frontiers in Plant Science, 2017, 8: 1462.

[15] MAI J, HERBETTE S, VANDAME M, CAVALOC E, JULI-EN J L, AMEGLIO T, ROECKEL-DREVET P. Contrasting strategies to cope with chilling stress among clones of a tropical tree,[J]. Tree Physiology, 2010, 30(11): 1391-1402.

[16] GONG Z, XIONG L, SHI H, YANG S, HERRERA-ES-TR-ELLA L R, XU G, CHAO D Y, LI J, WANG P Y, QIN F, LI J, DING Y, SHI Y, WANG Y, YANG Y, GUO Y, ZHU J K. Plant abiotic stress response and nutrient use efficiency[J]. Science China Life Sciences, 2020, 63(5): 635-674.

[17] BARRERO-GIL J, SALINAS J. CBFs at the crossroads of plant hormone signaling in cold stress response[J]. Molecular Plant, 2017, 10(4): 542-544.

[18] DING Y, LI H, ZHANG X, XIE Q, GONG Z, YANG S. OST1 kinase modulates freezing tolerance by enhancing ICE1 stability in[J]. Developmental Cell, 2015, 32(3): 278-289.

[19] ZHANG Z, LI J, LI F, LIU H, YANG W, CHONG K, XU Y. OsMAPK3 phosphorylates OsbHLH002/OsICE1 and inhibits its ubiquitination to activateand enhances rice chilling tolerance[J]. Developmental Cell, 2017, 43(6): 731-743.

[20] LI H, DING Y, SHI Y, ZHANG X, ZHANG S, GONG Z, YANG S. MPK3- and MPK6-Mediated ICE1 phosphorylation negatively regulates ICE1 stability and freezing tolerance in[J]. Developmental Cell, 2017, 43(5): 630-642.

[21] ZHAO C, WANG P, SI T, HSU C C, WANG L, ZAYED O, YU Z, ZHU Y, DONG J, TAO W A, ZHU J K. MAP kinase cascades regulate the cold response by modulating ICE1 protein stability[J]. Developmental Cell, 2017, 43(5): 618- 629.

[22] KIM T W, GUAN S, SUN Y, DENG Z, TANG W, SHANG J X, SUN Y, BURLINGAME A L, WANG Z Y. Brassinosteroid signal transduction from cell-surface receptor kinases to nuclear transcription factors[J]. Nature Cell Biology, 2009, 11(10): 1254-1260.

[23] PENG P, YAN Z, ZHU Y, LI J. Regulation of theGSK3-like kinase BRASSINOSTEROID-INSE-NSITIVE 2 through proteasome-mediated protein degradation[J]. Molecular Plant, 2008, 1(2): 338-346.

Cloning, Expression, Purification and Enzyme Activity Analysis of Protein Kinase HbBIN2 from

GUO Jing, YUAN Hongmei*

College of Tropical Crops, Hainan University / Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresource, Haikou, Hainan 570228, China

Rubber tree (Muell. Arg) is the exclusive commercial source of natural rubber because of its high productivity and superior product quality. Low temperature is a major abiotic stress that disadvantageously affect rubber tree growth and development, and ultimately limit ecological distribution. However, the underlying mechanisms ofcold stress response remain elusive. Identifying cold response genes in rubber tree and understanding the mechanisms regulating cold stress is of great potential value. BIN2 (Brassinosteroid Insensitive 2), a serine/threonine protein kinase, plays an important role in plant responses to cold stress, but HbBIN2 inhas not been cloned and characterized. In this study,gene was successfully cloned from. The open reading frame ofincluded 1143 nucleotides and encoded 380 amino acids, with predicted molecular mass of 42.9 kDa. The theoretical isoelectric point (pI) of HbBIN2 was 8.74. HbBIN2 was a hydrophilic protein, which had no transmembrane domain. The full-length CDS ofwas inserted into the polyclone sites betweenHⅠ andⅠ of the prokaryotic expression vector pET-28a for generating the recombinant plasmid pET28a-HbBIN2. The recombinant plasmid pET28a-HbBIN2 was transformed intoBL211 (DE3) strain to induceHbBIN2 protein expression. By comparing the expression levels of HbBIN2 at different induction temperatures (16, 28, 37℃), induction time (3, 6, 12 h) and IPTG concentration (0.1, 0.3, 0.5 mmol/L), The results demonstrated that the optimal induction expression condition of HbBIN2 was at 37℃ for 12 h with 0.3 mmol/L IPTG. In addition, the purification conditions of HbBIN2 proteinwere then explored, and the optimal concentration of imidazole for purifying HbBIN2 was 100 mmol/L. The kinase activity assay demonstrated that the purified HbBIN2 had kinase activity i. This study would lay a foundation for further research on the functional analysis of HbBIN2 protein and the regulatory mechanism ofcold stress response, and provide elite gene resource forrubber tree breeding for cold resistance.

;low temperature stress; BIN2; protein purification; kinase activity

S794.1

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.10.001

2022-01-28；

2022-02-28

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 31870245）；海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 321RC478）。

郭 靖（1995—），女，碩士研究生，研究方向：作物遺傳育種。*通信作者（Corresponding author）：袁紅梅（YUAN Hongmei），E-mail：yuanhongmei@hainanu.edu.cn。