DHCR7基因在膀胱癌中的表達(dá)及其與臨床特征及預(yù)后關(guān)系的生物信息學(xué)分析

趙 路，周 洋，黃君富，任章銀

中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400038

膀胱癌(BLCA)是泌尿系統(tǒng)的常見腫瘤，在世界范圍內(nèi)，膀胱癌的發(fā)病率在所有腫瘤中排名第十三位，在美國，男性膀胱癌的發(fā)病率居第四位，僅次于前列腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌[1-2]。依據(jù)腫瘤的浸潤(rùn)程度，可將膀胱癌分為非肌層浸潤(rùn)型膀胱癌和肌層浸潤(rùn)型膀胱癌。初診膀胱癌患者中，約90%的腫瘤類型為尿路上皮癌(其中約75%為非肌層浸潤(rùn)型，約25%為肌層浸潤(rùn)型)，其次為鱗狀細(xì)胞癌，占3%～7%[3-5]。目前，膀胱癌的診斷主要依賴膀胱鏡檢查和病理組織活檢，而治療則依據(jù)腫瘤浸潤(rùn)程度、分期、分級(jí)、是否轉(zhuǎn)移等情況選擇膀胱腫瘤電切術(shù)或根治性全切術(shù)等不同的治療方案。膀胱癌具有高度異質(zhì)性的特點(diǎn)，不同分型的膀胱癌在術(shù)后化療和預(yù)后方面存在明顯差異，并且非肌層浸潤(rùn)型膀胱癌的5年復(fù)發(fā)率為60%～70%，其發(fā)病和復(fù)發(fā)的分子機(jī)制尚未闡明，這給膀胱癌的治療及預(yù)后帶來了極大挑戰(zhàn)[6-8]。膽固醇是構(gòu)成動(dòng)物細(xì)胞膜的基本成分之一，參與維持細(xì)胞膜的完整性和流動(dòng)性，同時(shí)，膽固醇也是膽汁酸、類固醇激素、維生素D的前體物質(zhì)，因此，維持膽固醇的代謝穩(wěn)態(tài)具有重要的生物學(xué)意義。近年來，研究發(fā)現(xiàn)膽固醇代謝參與調(diào)控了腫瘤相關(guān)信號(hào)通路、腫瘤微環(huán)境等，阻斷膽固醇的合成、攝取可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[9-12]。靶向抑制膽固醇合成的他汀類藥物可以通過多種機(jī)制抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[13]。7-脫氫膽固醇還原酶(DHCR7)是參與膽固醇生物合成最后一步的酶類，是維持膽固醇合成和維生素D動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵酶[14]，最新研究表明DHCR7可能參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。頭頸部腫瘤中高表達(dá)的DHCR7與患者的不良預(yù)后有關(guān)，DHCR7基因的甲基化可能通過維生素D途徑增加乳腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)[15-17]，這些研究表明，DHCR7有望成為新的腫瘤治療靶點(diǎn)。為進(jìn)一步探究DHCR7在腫瘤中的表達(dá)及臨床意義，本研究以膀胱癌患者為研究對(duì)象，通過腫瘤有關(guān)數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用生物信息學(xué)方法，探究DHCR7基因在膀胱癌中的表達(dá)及其與臨床預(yù)后的關(guān)系，從腫瘤分子生物學(xué)角度為膀胱癌治療靶點(diǎn)的選擇及預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究通過Gene Expression Omnibus(GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫，檢索“Bladder cancer”，設(shè)定篩選詞：Series、Homo sapiens、Tissue、Expression profiling by array及Expression profiling by high throughput sequencing，篩選膀胱癌基因芯片或高通量測(cè)序數(shù)據(jù)組，選擇GSE13507、GSE32548、GSE32894、GSE48276、GSE128959數(shù)據(jù)組進(jìn)行研究。通過R(R4.0.5)軟件，利用GEOquery、Devtools、AnnoProbe、GEOmirror等R包獲取上述數(shù)據(jù)并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，獲取基因表達(dá)矩陣及臨床信息。通過The Cancer Genome Atlas(TCGA，https://www.cancer.gov/)數(shù)據(jù)庫，設(shè)定限定詞TCGA-BLCA、RNA-seq/FPKM，選擇數(shù)據(jù)庫中膀胱癌患者的RNA-seq數(shù)據(jù)及臨床信息進(jìn)行研究，同時(shí)應(yīng)用Genotype-Tissue Expression(GTEx，https://www.genome.gov/)的表達(dá)數(shù)據(jù)與TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配分析。

1.2DHCR7基因表達(dá)分析 應(yīng)用GEPIA2(http://gepia2.cancer-pku.cn)在線分析TCGA及GTEx數(shù)據(jù)庫中正常膀胱組織與膀胱癌組織中DHCR7基因的表達(dá)差異；通過SPSS19.0、GraphPad Prism8.0軟件分析上述TCGA、GEO數(shù)據(jù)庫中DHCR7基因的表達(dá)及臨床病理特征。

1.3生存分析 應(yīng)用X-tile軟件基于Kaplan Meier法對(duì)DHCR7表達(dá)量進(jìn)行生存率評(píng)估，獲取Cutpoints值，按照Cutpoints值將DHCR7表達(dá)水平分為高表達(dá)組與低表達(dá)組。通過GraphPad Prism8.0軟件，應(yīng)用Kaplan Meier法、Log-rank檢驗(yàn)、單因素COX回歸分析TCGA、GEO數(shù)據(jù)庫中DHCR7基因表達(dá)水平與膀胱癌患者總生存期(OVS)、疾病特異性生存期(DSS)、無進(jìn)展生存期(PFS)及無復(fù)發(fā)生存期(RFS)的關(guān)系。

1.4免疫組織化學(xué)法驗(yàn)證DHCR7在正常膀胱組織與膀胱癌組織中的表達(dá)差異 利用Human Protein Atlas(HPA，http://www.proteinatlas.org)數(shù)據(jù)庫中免疫組織化學(xué)法檢測(cè)數(shù)據(jù)，從蛋白水平驗(yàn)證DHCR7在正常膀胱組織及膀胱癌組織中的表達(dá)差異，所用抗體編號(hào)為HPA044280。

1.5蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)及基因富集分析 通過GeneMANIA(http://genemania.org/)數(shù)據(jù)庫，從基因共表達(dá)、基因融合、遺傳相互作用、蛋白質(zhì)同源性等方面構(gòu)建PPI，通過GEPIA2在線分析上述基因與DHCR7基因在膀胱癌中的相關(guān)性；將TCGA中的樣本數(shù)據(jù)，依據(jù)DHCR7的表達(dá)水平分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，通過基因富集分析軟件(GSEA 4.1.0)對(duì)DHCR7基因進(jìn)行富集分析；選擇MSigDB基因集為HallMark及KEGG基因集。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用R軟件、SPSS19.0、GraphPad Prism8等進(jìn)行原始數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。采用t檢驗(yàn)比較不同組織、分型的基因表達(dá)差異；采用Pearson相關(guān)分析法分析蛋白互作基因與DHCR7基因的相關(guān)性；采用Log-rank檢驗(yàn)、單因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析基因表達(dá)與患者生存的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1DHCR7基因在正常膀胱組織及膀胱癌組織中的表達(dá) 通過對(duì)TCGA、GTEx數(shù)據(jù)庫的分析，共獲得28份正常膀胱組織及404份DHCR7基因表達(dá)的膀胱癌組織數(shù)據(jù)，膀胱癌組織中DHCR7基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯高于正常膀胱組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1；GSE13507的研究數(shù)據(jù)顯示，膀胱癌組織中DHCR7的mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯高于癌旁組織和正常膀胱組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

注：P為標(biāo)線對(duì)應(yīng)的兩組間比較的統(tǒng)計(jì)參數(shù)。

注：P為標(biāo)線對(duì)應(yīng)的兩組間比較的統(tǒng)計(jì)參數(shù)。

2.2DHCR7基因在不同分期、分級(jí)、病理分型膀胱癌組織中的表達(dá)差異 GSE13507、GSE32548、GSE32894的研究數(shù)據(jù)顯示，Ta期與T1期、T2期的DHCR7基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；N0期與N1、N2期DHCR7基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；G1、G2、G3級(jí)DHCR7基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。GSE13507的研究數(shù)據(jù)顯示，肌層浸潤(rùn)型、復(fù)發(fā)型膀胱癌組織中DHCR7基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯高于非肌層浸潤(rùn)型膀胱癌組織；GSE32894的研究數(shù)據(jù)顯示，基于LUND 5分法的不同分子分型的膀胱癌組織中，DHCR7基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中，基因未定型膀胱癌組織中DHCR7基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平均高于其他類型(P<0.05)。GSE128959中不同分子分型膀胱癌組織中DHCR7基因mRNA相對(duì)表達(dá)情況與GSE32894中結(jié)果一致。見圖3A～J。

注：P為標(biāo)線對(duì)應(yīng)的兩組間比較的統(tǒng)計(jì)參數(shù)；A～G為GSE13507、GSE32548、GSE32894研究數(shù)據(jù)中不同分期、分級(jí)膀胱癌組織中DHCR7基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較；H～J分別為不同分子分型的膀胱癌組織中DHCR7基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較，NMIBC為非肌層浸潤(rùn)型膀胱癌，MIBC為肌層浸潤(rùn)型膀胱癌，Recurrent為復(fù)發(fā)型膀胱癌；Infiltrated為未篩選型，UroA為基底樣細(xì)胞A型，SCC-like為鱗狀細(xì)胞癌樣型，UroB為基底樣細(xì)胞B型，GU為基因未定型，Mes為間充質(zhì)細(xì)胞型，Ba/Sq為基底/鱗狀細(xì)胞型，UroA/B/C為尿路上皮型，ScNE為小細(xì)胞/神經(jīng)內(nèi)分泌型。

2.3DHCR7基因與膀胱癌患者預(yù)后生存的關(guān)系 TCGA的研究數(shù)據(jù)顯示，DHCR7高表達(dá)組的OVS低于DHCR7低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=1.700，P=0.000 6)。GSE13507的研究數(shù)據(jù)顯示，DHCR7高表達(dá)組的OVS明顯低于DHCR7低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=2.850，P<0.000 1)，DHCR7高表達(dá)組與DHCR7低表達(dá)組的DSS、PFS比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=3.611、P=0.000 3；HR=4.073、P=0.000 1)。GSE48276的研究數(shù)據(jù)顯示，DHCR7高表達(dá)組的OVS明顯低于DHCR7低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=2.300，P=0.044 2)。見圖4A～F。

注：A 為TCGA數(shù)據(jù)分析中DHCR7高表達(dá)組與DHCR7低表達(dá)組OVS比較；B為GSE13507數(shù)據(jù)分析中DHCR7高表達(dá)組與DHCR7低表達(dá)組OVS比較；C為GSE13507數(shù)據(jù)分析中DHCR7高表達(dá)組與DHCR7低表達(dá)組DSS比較；D為GSE13507數(shù)據(jù)分析中DHCR7高表達(dá)組與DHCR7低表達(dá)組PFS比較；E為GSE13507數(shù)據(jù)分析中DHCR7高表達(dá)組與DHCR7低表達(dá)組RFS比較；F為GSE48276數(shù)據(jù)分析中DHCR7高表達(dá)組與DHCR7低表達(dá)組OVS比較；HR為風(fēng)險(xiǎn)比；P為DHCR7高低表達(dá)組之間生存率比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)。

2.4DHCR7蛋白在正常膀胱組織及膀胱癌組織中的表達(dá)差異 通過HPA數(shù)據(jù)庫免疫組織化學(xué)法檢測(cè)數(shù)據(jù)證實(shí)，DHCR7蛋白在正常膀胱組織中表達(dá)水平明顯低于膀胱癌組織(P<0.05)。見圖5A～C。

2.5DHCR7 PPI及基因相關(guān)性分析 通過GeneMANIA數(shù)據(jù)庫，從基因共表達(dá)、基因融合、遺傳相互作用、蛋白同源性、信號(hào)通路等方面構(gòu)建PPI，其中與DHCR7基因相互作用的蛋白質(zhì)有DHCR24、LBR、MVK、SREBF1、NFYC、SQLE、LSS、SC5D、TM7SF2、HMGCR、FDFT1、ACAT2、MSMO1、HMGCS1、TMEM97、FADS1、FDPS、NSDHL。膀胱癌TCGA數(shù)據(jù)庫中DHCR7基因表達(dá)與部分互作基因的Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，DHCR7基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平與SQLE(r=0.59，P<0.001)，HMGCR(r=0.54，P<0.001)，ACAT2(r=0.50，P<0.001)，HMGCS1(r=0.48，P<0.001)，MSMO1(r=0.48，P<0.001)、MVK(r=0.46，P<0.001)的表達(dá)呈正相關(guān)。

注：A為低分化膀胱癌組織；B為高分化膀胱癌組織；C為正常膀胱組織。

2.6GSEA基因富集分析 基因富集分析顯示，膀胱癌組織中DHCR7基因高表達(dá)組主要富集的基因?yàn)槟懝檀挤€(wěn)態(tài)基因、MTORC1通路基因、過氧化物酶體基因等，KEGG富集分析表明DHCR7基因高表達(dá)組富集的通路為類固醇合成、N-糖基合成、萜類化合物骨架合成等。

3 討 論

膀胱癌是一種高侵襲性、高異質(zhì)性的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素參與、多步驟發(fā)展的復(fù)雜病理過程，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。肌層浸潤(rùn)型膀胱癌與非肌層浸潤(rùn)型膀胱癌在診斷、治療、預(yù)后與復(fù)發(fā)等多個(gè)方面有明顯差異。非肌層浸潤(rùn)型膀胱癌預(yù)后相對(duì)較好，術(shù)后5年生存率達(dá)90%，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)70%；肌層浸潤(rùn)型膀胱癌惡性程度高、預(yù)后差，5年生存率在15%～60%[18]?；诎螂装└叨犬愘|(zhì)性的特點(diǎn)，傳統(tǒng)病理組織的分類方法已不能為臨床診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供準(zhǔn)確指導(dǎo)，隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，基于基因組學(xué)、表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)的膀胱癌分子分型逐漸得到認(rèn)可。鑒于此，單個(gè)基因的生物信息學(xué)的研究有助于進(jìn)一步明確膀胱癌異質(zhì)性的機(jī)制和內(nèi)在特征，完善膀胱癌分子分型方案，為臨床診斷、治療與預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)。

DHCR7是參與膽固醇合成終末反應(yīng)的酶類，其作用是將7-脫氫膽固醇(7-DHC)催化生成膽固醇，參與調(diào)控膽固醇與維生素D3的動(dòng)態(tài)平衡[14]。研究發(fā)現(xiàn)膽固醇、維生素D3均參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[12,15-16,19-20]。參與膽固醇代謝的LDLR、SREBP、ACAT-1、LXR等又通過不同途徑參與了腫瘤的演變過程[21-22]。干預(yù)LDLR受體，抑制膽固醇的攝取，可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[23]。維生素D3及其相關(guān)代謝基因與甲狀腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、食管鱗癌的患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，其中DHCR7的基因多態(tài)性通過調(diào)控維生素D的水平增加了甲狀腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)，DHCR7的DNA異常甲基化通過維生素D途徑增加了女性乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)，但具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明[16,22,24-25]。

本研究通過對(duì)TCGA、GEO數(shù)據(jù)庫研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌中DHCR7基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯高于癌旁組織及正常膀胱組織，肌層浸潤(rùn)型、復(fù)發(fā)型膀胱癌組織中DHCR7基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯高于非肌層浸潤(rùn)型膀胱癌組織。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)，膀胱癌組織中DHCR7蛋白表達(dá)水平明顯高于正常膀胱組織。不同腫瘤分期、分級(jí)的膀胱癌組織中DHCR7基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平具有差異性，分期晚、分化程度低的膀胱癌組織中DHCR7的表達(dá)水平明顯高于分期早、分化程度高的膀胱癌組織；此外，不同分子分型的膀胱癌組織中DHCR7基因的表達(dá)具有異質(zhì)性，其中基因未定型膀胱癌組織中DHCR7基因的mRNA表達(dá)水平明顯高于其他類型，以上資料均表明DHCR7基因促進(jìn)了膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過程。生存分析結(jié)果顯示：DHCR7基因表達(dá)水平與患者預(yù)后有關(guān)，DHCR7高表達(dá)組的OVS、PFS、DSS明顯低于DHCR7低表達(dá)組，表明DHCR7高表達(dá)是患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。為進(jìn)一步闡明DHCR7在膀胱癌中可能的作用機(jī)制，通過構(gòu)建PPI和共表達(dá)基因相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，DHCR7基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平與SQLE、HMGCR、ACAT2、HMGCS1、MSMO1、MVK呈正相關(guān)。HMGCR、SQLE均為膽固醇合成中的關(guān)鍵限速酶，HMGCR在胃癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中存在過表達(dá)的現(xiàn)象，過表達(dá)的HMGCR可能分別通過Hedgehog/Gli1、Hippo通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞、膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移[26-28]。靶向抑制HMGCR的他汀類藥物，可以通過抗血管生成、阻斷細(xì)胞周期、抑制上皮間質(zhì)化等途徑發(fā)揮抗腫瘤的作用[13,29-30]，目前已被用于乳腺癌的臨床治療[31-32]。SQLE通過ERK、MYC、PI3K/AKT等多種通路參與腫瘤的形成[33-34]。MVK是甲羥戊酸途徑合成膽固醇的關(guān)鍵酶?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，筆者認(rèn)為DHCR7可能通過協(xié)同HMGCR、SQLE、MVK干預(yù)膽固醇穩(wěn)態(tài)，從而參與了膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展。

本研究通過多個(gè)數(shù)據(jù)庫研究資料，分析了DHCR7基因在膀胱癌與正常膀胱組織中的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)了DHCR7基因與臨床不良預(yù)后的關(guān)系，應(yīng)用生物信息學(xué)方法初步探討了DHCR7參與膀胱癌的可能機(jī)制，為膀胱癌的診斷分型及預(yù)后評(píng)估提供了理論支持。盡管本研究數(shù)據(jù)來源于數(shù)據(jù)庫，缺少基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)支撐，存在一定的局限性，但仍為 DHCR7 基因在膀胱癌中的作用機(jī)制提供了新的研究方向和思路。