慢性萎縮性胃炎患者胃黏膜組織中TFF2、miR-181a、RKIP的表達(dá)及相關(guān)性研究

李 霞，楊 云，王慧緯，王丙信

中國人民解放軍陸軍第八十一集團(tuán)軍醫(yī)院消化內(nèi)科，河北張家口 075000

慢性萎縮性胃炎(CAG)是一種與幽門螺桿菌(Hp)感染密切相關(guān)的疾病，會(huì)造成胃黏膜上皮和腺體萎縮，黏膜肌層增厚及腸上皮化生、不典型增生等，同時(shí)，作為癌前病變，它最終可能導(dǎo)致胃癌的發(fā)生[1-4]。為此，對(duì)CAG的精準(zhǔn)診斷有著非常重要的意義。多種生物標(biāo)志物的表達(dá)都與CAG相關(guān)，比如，三葉因子2(TFF2)、miR-181a和Raf激酶抑制蛋白(RKIP)等，它們?cè)贑AG向胃癌的發(fā)展過程中起保護(hù)胃黏膜和抑制腫瘤的作用[5-7]。但是，以往研究?jī)H淺顯地對(duì)CAG患者的上述生物標(biāo)志物的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，未進(jìn)行與患者臨床特征的關(guān)系研究。因此，本研究采用回顧性分析方法，深入研究了TFF2、miR-181a和RKIP在CAG患者胃黏膜組織中的表達(dá)，并對(duì)3項(xiàng)指標(biāo)與患者臨床特征的關(guān)系進(jìn)行了研究，以期為CAG的診療提供新的手段。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年3月至2021年3月于本院進(jìn)行胃鏡檢查的115例CAG患者為CAG組，均按《中國慢性胃炎共識(shí)意見》[8]標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)過胃鏡檢查和組織病理活檢確診，其中男60例，女55例。同期在本院進(jìn)行胃鏡檢查的體檢健康者120例作為健康對(duì)照組，其中男63例，女57例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)有完善的臨床資料；(2)近1個(gè)月內(nèi)未服用過可能會(huì)對(duì)本研究試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響的藥物；(3)無胃部相關(guān)損傷，適合做胃鏡檢查；(4)無其他器官及免疫系統(tǒng)功能異常；(5)無任何其他可能會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果或不適合進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)的因素。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并胃黏膜糜爛、胃出血、消化性潰瘍等；(2)合并心腦血管或其他器質(zhì)性疾??；(3)合并胃癌等腫瘤。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署了知情同意書。

1.2儀器與試劑 所用儀器主要包括移液器(美國賽默飛公司)、烘箱(德國德菲瑞斯公司)、石蠟切片機(jī)(德國徠卡公司)、攤片機(jī)(東莞科迪儀器有限公司)、IMS圖像分析系統(tǒng)(德國徠卡公司)、光學(xué)顯微鏡(德國徠卡公司)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)儀(美國賽默飛公司)、高壓滅菌鍋(美國施都凱公司)、超低溫冰箱(青島海爾公司)、分光光度計(jì)(美國賽默飛公司)、高速離心機(jī)(美國賽默飛公司)。所用試劑主要包括兔抗人TFF2多克隆抗體(美國SAB公司)、兔抗人RKIP抗體(北京義翹神州科技有限公司)、SP免疫組化試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)、DAB顯色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，1X磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)、Trizol試劑盒(北京酷來博科技有限公司)、RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)、mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國EZBioscience公司)、綠色熒光RNA定量試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)、內(nèi)參基因U6(湖北百奧斯生物科技有限公司)、miR-181a引物(北京擎科生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 在胃鏡檢查過程中，采用活檢鉗采集研究對(duì)象的胃黏膜組織標(biāo)本。

1.3.2免疫組化法檢測(cè)TFF2和RKIP的表達(dá)水平 取受試者胃黏膜組織后，首先采用PBS沖洗，然后經(jīng)過多聚甲醛固定、乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、5 μm切片、貼片、烤片等一系列步驟，制成石蠟切片。隨后，嚴(yán)格按照SP免疫組化試劑盒使用說明書進(jìn)行免疫組化相關(guān)試驗(yàn)。每例研究對(duì)象選擇5個(gè)×400視野，應(yīng)用IMS圖像分析系統(tǒng)采集光密度值，取這5個(gè)視野的平均值作為免疫組化法檢測(cè)結(jié)果。

1.3.3RT-PCR檢測(cè)miR-181a表達(dá)水平 RT-PCR檢測(cè)參考LUO等[9]的方法并進(jìn)行了適當(dāng)改動(dòng)。按Trizol試劑盒的說明書進(jìn)行RNA的提取，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及純度，嚴(yán)格按照試劑盒說明書內(nèi)容進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最終合成cDNA。隨后，按照RNA熒光定量試劑盒使用說明進(jìn)行RT-PCR。引物序列：miR-181a正向引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTCAC-3′，反向引物為5′-ACACTCCAGCTGGGAACATTCAACGCTGT CG-3′；β-actin正向引物序列為5′-TCGATCGATGCTAGCTAT-3′，反向引物為5′-TAGCATAGCTA GCTAGCT-3′；產(chǎn)物長(zhǎng)度為135 bp。反應(yīng)條件：95 ℃ 6 min預(yù)變性；95 ℃ 10 s變性；60 ℃ 15 s退火；72 ℃ 30 s延伸；50個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，分析熔解曲線，以β-actin作為內(nèi)參照，利用2—ΔΔCt計(jì)算miR-181a表達(dá)水平。

1.4觀察指標(biāo) (1)利用IMS圖像分析系統(tǒng)采集的TFF2和RKIP的光密度值；(2)利用2—ΔΔCt計(jì)算的miR-181a的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1兩組基線資料比較 兩組研究對(duì)象性別及居住地比例、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CAG組有飲酒史、吸煙史比例高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 患者基線資料對(duì)比

2.2兩組TFF2、RKIP和miR-181a表達(dá)水平比較 與健康對(duì)照組比較，CAG組的TFF2和miR-181a表達(dá)水平升高，RKIP表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖1。

2.3不同特征的CAG患者TFF2、RKIP和miR-181a表達(dá)水平比較 不同發(fā)病部位、幽門螺桿菌(Hp)感染史、胃炎/胃癌家族史、飲食習(xí)慣規(guī)律情況CAG患者間的TFF2、RKIP和miR-181a表達(dá)水平不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以胃竇為主的CAG、全胃CAG患者TFF2表達(dá)水平低于以胃體為主的CAG患者(P<0.05)；miR-181a表達(dá)水平在以胃竇為主的CAG、以胃體為主的CAG、全胃CAG中依次升高(P<0.05)；RKIP表達(dá)水平在以胃竇為主的CAG、以胃體為主的CAG、全胃CAG中依次降低(P<0.05)。不同年齡、性別、胃炎/胃癌家族史情況CAG患者間TFF2、RKIP和miR-181a表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 兩組TFF2、RKIP和miR-181a表達(dá)水平比較

2.4TFF2、miR-181a與RKIP表達(dá)水平之間的相關(guān)分析 TFF2表達(dá)水平與miR-181a表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.345，P=0.045)，TFF2、miR-181a表達(dá)水平與RKIP表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)(r=—0.326，P=0.047；r=—0.625，P=0.008)。

2.5Logistic回歸分析影響CAG發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素 Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，年齡≥50歲、發(fā)病部位以胃竇為主、Hp感染、有胃炎/胃癌家族史、飲食習(xí)慣不規(guī)律均為影響CAG發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表4。

注：A為TFF2在健康對(duì)照組中低表達(dá)；B為TFF2在CAG組中高表達(dá)；C為RKIP在健康對(duì)照組中高表達(dá)；D為RKIP在CAG組中低表達(dá)。

表3 不同特征的CAG患者TFF2、RKIP和miR-181a表達(dá)水平比較

表4 Logistic回歸分析影響CAG的風(fēng)險(xiǎn)因素

3 討 論

CAG是一種以胃黏膜萎縮等為主要臨床特點(diǎn)的胃部疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與Hp感染、免疫、年齡、飲食習(xí)慣和遺傳因素等息息相關(guān)，如不給予適度的關(guān)注，易發(fā)展成為胃癌，進(jìn)而危及患者的生命[9-11]。本研究結(jié)果顯示，健康對(duì)照組和CAG組有飲酒史和吸煙史比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示吸煙和飲酒可能是CAG發(fā)生的影響因素。

TFF2是三葉因子家族的一員，三葉因子家族成員還包括TFF1和TFF3。其中，TFF2可通過在胃部和十二指腸等消化器官中進(jìn)行特異性表達(dá)，通過抑制胃酸的分泌，與黏液蛋白結(jié)合等降低胃黏膜可能受到的傷害，并與表皮生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)胃黏膜的保護(hù)和修復(fù)[12]。生理情況下，TFF2主要來自于胃竇并表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)[13]。本研究結(jié)果顯示，TFF2表達(dá)水平在有Hp感染史、胃炎/胃癌家族史患者中升高，表明TFF2表達(dá)水平升高可能伴隨著CAG的發(fā)展進(jìn)程。同時(shí)，以胃竇為主的CAG和全胃CAG患者的TFF2表達(dá)水平低于以胃體為主的CAG患者(P<0.05)，胃竇部位的功能損傷可能會(huì)抑制TFF2的表達(dá)，從而使胃部逐漸喪失自我保護(hù)功能。除此之外，規(guī)律的飲食習(xí)慣也可對(duì)CAG產(chǎn)生重要影響，且應(yīng)減少過熱、過咸及辛辣食物的食用。miR-181a與細(xì)胞的多種功能都有聯(lián)系，比如，在胃炎的發(fā)展中，miR-181a表達(dá)水平與多種因素有關(guān)，可以作為反映病情的參考指標(biāo)[14]。又比如，miR-181a在癌癥的發(fā)病機(jī)制中，既可以作為癌基因的誘導(dǎo)因素，又可以通過對(duì)癌基因進(jìn)行抑制，從而限制腫瘤的發(fā)展[15-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)病部位、Hp感染史、胃炎/胃癌家族史、飲食習(xí)慣規(guī)律情況的CAG患者間miR-181a表達(dá)水平不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CAG是發(fā)生胃癌的前兆，因此，miR-181a的表達(dá)水平升高很可能預(yù)示著患者癌癥風(fēng)險(xiǎn)的逐步增大。RKIP是一種小分子保守蛋白，能夠調(diào)節(jié)信號(hào)通路，對(duì)ERK信號(hào)進(jìn)行負(fù)調(diào)控[19]。RKIP在人體的廣泛表達(dá)可以有效抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[20]。TFF2表達(dá)水平與RKIP表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.326，P=0.047)，表明胃黏膜組織隨著病情的惡化，對(duì)癌細(xì)胞的抑制力也在逐漸降低。miR-181a的高表達(dá)和RKIP的低表達(dá)，協(xié)同增加了CAG向胃癌轉(zhuǎn)變的風(fēng)險(xiǎn)。

許多研究者對(duì)上述生物標(biāo)志物在CAG中的表達(dá)水平進(jìn)行了相關(guān)研究，例如，XU 等[21]、FOX等[22]及文娜等[12]發(fā)現(xiàn)，TFF2在CAG組織中的表達(dá)水平明顯升高，且其表達(dá)水平與胃癌前病變的病理嚴(yán)重程度密切相關(guān)。許辰等[14]探究了miR-181a的表達(dá)水平與CAG患者的病情及預(yù)后之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-181a在CAG組織中的表達(dá)水平上調(diào)，且其表達(dá)水平與患者腸化生等臨床病理參數(shù)及預(yù)后相關(guān)。吳紅艷等[23]發(fā)現(xiàn)CAG患者的RKIP表達(dá)水平降低，RKIP有望作為CAG的一種診斷指標(biāo)。以上研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TFF2、RKIP、miR-181a表達(dá)水平與CAG患者的病情關(guān)系密切,可作為預(yù)測(cè)胃癌發(fā)生、發(fā)展及判斷預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。本研究通過Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，年齡≥50歲、發(fā)病部位以胃竇為主、Hp感染、有胃炎/胃癌家族史、飲食習(xí)慣不規(guī)律均為影響CAG發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，若患者具有以上因素中的任何一種，均需要對(duì)其加強(qiáng)隨訪，并予以積極治療，這對(duì)促進(jìn)患者康復(fù)并降低癌變風(fēng)險(xiǎn)意義重大。

綜上所述，TFF2、RKIP和miR-181a表達(dá)水平在CAG患者的胃黏膜組織中升高，應(yīng)對(duì)年齡≥50歲、發(fā)病部位以胃竇為主、有Hp感染、有胃炎/胃癌家族史、飲食習(xí)慣不規(guī)律患者加強(qiáng)隨訪。