利用FQ-RTPCR定性檢測RNA病毒核酸的質量控制要點分析

文/薛達冰

目前，實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(FQ-RTPCR)已經(jīng)廣泛應用于臨床RNA病毒核酸定性檢測。FQ-RTPCR具有許多優(yōu)勢：（1）FQ-RTPCR在封閉的8聯(lián)管中進行，無須進行后處理，產(chǎn)物污染少，假陽性發(fā)生率比較低；（2）能夠實現(xiàn)自動化，結果簡單明了；（3）工作效率高，可以實現(xiàn)樣本高通量檢測；（4）靈敏度高、特異性強，能快速、準確完成核酸樣本檢測。但是，在近期的臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，核酸檢測結果會出現(xiàn)與臨床診斷不符，出現(xiàn)假陽性或假陰性的現(xiàn)象，檢測結果有時會受到質疑。因此，核酸檢測的質量控制是當下臨床檢驗工作者重點關注的問題。為此，本文將從以下三個方面闡述利用FQ-RTPCR定性檢測RNA病毒核酸的質量控制要素，為提高核酸檢測結果準確性提供保障。

1 分析前的質量控制

1.1 樣本運輸與保存

在自然條件下存在著大量的RNA酶。有研究表明，RNA病毒的核酸在室溫條件下極易降解。因此，在RNA病毒樣本采集后，應立即將樣本置于的RNA病毒核酸專用保存液中，并盡快安排送檢，并用冰袋保持樣本處于低溫狀態(tài)。如果采集后的樣本不能及時送檢，則應將樣本存放于4℃中保存。標本送到實驗室后，實驗室工作人員盡快安排檢測，如果樣本能在24h內(nèi)檢測，則可置于4℃保存；若樣本在24小時內(nèi)無法將樣本檢測完畢，則應將樣本放于-70℃冰箱保存。

1.2 實驗室設施

在PCR實驗室，用于進行實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應的儀器主要有實時熒光定量PCR儀、全自動核酸提取儀、生物安全柜、冰箱、移液器、小型低速離心機等。在儀器投入使用前，必須對所有儀器設備進行校準以及性能驗證，評估整套設備的重復性、準確性、最低檢測限等，只有結果符合要求才能投入使用。儀器在使用的過程中不可避免出現(xiàn)儀器老化、性能下降，由此出現(xiàn)儀器系統(tǒng)誤差的情況。定期對核酸檢測的主要儀器進行校準，對校準不通過的儀器因此，需要暫停使用并進行查找原因對癥處理，最后再次進行校準，校準后的儀器通過性能驗證后才能投入使用。對儀器設備定時校準是保證核酸檢測結果準確的關鍵。

1.3 檢測試劑耗材

在核酸檢測過程中主要用到的試劑有核酸提取試劑和核酸擴增檢測試劑。投入使用的核酸提取試劑主要的原理方法有磁珠法、柱提法、煮沸裂解法等。煮沸裂解法是比較簡單的核酸提取方法，但是主要的缺點是提取后的核酸存在較多的雜質，這對后續(xù)的核酸擴增反應有著較大的抑制作用，容易產(chǎn)生假陰性的結果。目前，臨床上使用較多的方法為柱提法和磁珠法，柱提法主要是通過手工進行提取，成本比較低，方法簡單，而且不需要比較高端的儀器設備，主要用于標本量比較少的實驗室，而磁珠法可以實現(xiàn)儀器自動化，核酸提取時間短，可進行高通量提取核酸，適用于大批量標本檢測的實驗室。在選擇核酸提取試劑時，我們建議選擇標本加樣量大，并且最終的核酸洗脫液體積小的提取試劑，以獲得高濃度的病毒RNA，提高檢出率。目前，市場上針對不同的RNA病毒都會有多種相應的核酸擴增檢測試劑，選擇檢測限低、準確度高、重復性好的核酸擴增試劑是提高核酸檢測質量的關鍵。在使用新的品牌試劑或者新批號的試劑前都應對該試劑進行性能驗證，認真評估該試劑的重復性、準確性、最低檢測限等性能，只有檢測結果符合要求才能正式投入使用[8-9]。

RNA病毒核酸檢測的實驗耗材質量的好壞也將直接影響到后續(xù)核酸擴增檢測的結果。我們應使用質量可靠的耗材，包括離心管、八聯(lián)管、各種不同規(guī)格帶濾芯的吸頭。實驗室應對新批號、同一批號不同貨運號的關鍵耗材進行驗收，重點關注實驗耗材的批間差異、抑制物等。此外，我們對八聯(lián)管還應關注其是否存在爆管的可能，應將新批號、同一批號不同貨運號的八聯(lián)管置于擴增儀上進行高低溫多次循環(huán)，觀察八聯(lián)管是否存在爆管。對各種不同規(guī)格帶濾芯的吸頭我們也應關注其密閉性是否良好，對于密閉性不良的帶濾芯的吸頭，退回給廠家，拒絕使用。

1.4 工作人員

核酸檢驗人員貫穿整個核酸檢測的過程，是影響核酸檢測結果的關鍵。PCR實驗室的手工操作環(huán)節(jié)較多，比較煩瑣，每個環(huán)節(jié)都有可能對最終的結果產(chǎn)生影響。因此，必須保證核酸檢驗人員擁有扎實的理論基礎、規(guī)范的操作、PCR上崗證或核酸檢測合格證、生物安全合格證等。檢測人員必須經(jīng)過培訓并考核合格后方能上崗。在工作的過程中，必須嚴格按照預先制定好的操作規(guī)程進行。此外，實驗室還應定期組織實驗室相關技術人員參加實驗室內(nèi)部比對活動，確保不同技術人員檢測實驗室內(nèi)部比對樣本的實驗結果在可控范圍之內(nèi)，保證實驗結果精確度、準確度在國家允許的范圍內(nèi)。

2 分析中質量控制

試劑配制是RNA病毒核酸檢測的關鍵步驟之一。在配制試劑前，檢驗人員應穿戴好防護用品。例如帽子、口罩、鞋套等，避免外來的核酸片段污染試劑，并保證吸取試劑準確無誤，做到充分混勻，這是保證所后續(xù)檢測質量的關鍵。在利用FQ-RTPCR定性檢測RNA病毒的過程中，每個批次應設置三個陰性質控、一個弱陽性質控，質控品應隨機放到樣品中一起參與提取、擴增的過程。三個陰性質控品主要監(jiān)測提取樣本核酸過程及環(huán)境是否受到污染。我們建議使用弱陽性質控品參與核酸提取、核酸擴增的過程。弱陽性質控能更靈敏反映出核酸檢測體系的檢測水平，監(jiān)測是否存在假陰性的問題；而且弱陽性質控品在提取過程中產(chǎn)生的陽性基因片段氣溶膠污染概率較低。

3 檢測后質量控制

3.1 核酸檢測結果的判讀

判斷某批次的核酸檢測結果是否準確，首先，查看該批次的質控是否在控。如果質控結果為失控，則應對失控的原因進行分析，找出問題。只有質控在控，這一批次的核酸檢測結果才可以正常報告。其次，對于每一份樣本的核酸檢測結果應該按照說明書提示的方法來判讀，不能僅僅根據(jù)個人工作經(jīng)驗來判讀結果，否則極有可能做出錯誤的判斷。

3.2 實驗室污染控制

FQ-RTPCR是一個高靈敏度的技術，微量的靶基因污染都會引起假陽性的結果，因此，PCR實驗室防污染是提高核酸檢測質量的關鍵因素之一。PCR實驗室的技術人員必須嚴格按照實驗室的標準操作規(guī)程進行試驗，以降低實驗室受到核酸污染的風險。在工作時，工作人員必須按照工作的單一方向進行實驗。所有的耗材必須嚴格分區(qū)使用，并在各區(qū)的耗材上寫上各區(qū)的標志，不能將耗材相互串用，否則將會極易引起核酸污染。在工作中要時刻注意可能會引起的核酸污染，在打開樣本蓋子的過程中，應該注意盡量避免在核酸提取板上方打開蓋子，否則會出現(xiàn)樣本攜帶污染，影響結果的準確性。提取核酸后，用于提取核酸的攪拌套應該用密封袋裝好并密封后才丟棄，避免攪拌套攜帶陽性質控的核酸揮發(fā)到樣本處理區(qū)，盡量降低陽性質控的核酸日積月累導致實驗室發(fā)生污染的風險。

我們需要定期對實驗室的工作區(qū)間、儀器設備進行清潔消毒。主要步驟包括：（1）使用75%酒精對精密儀器設備、工作臺面等進行擦拭；（2）在PCR每個區(qū)噴灑75%酒精用于沉降懸浮于空氣中的部分核酸片段；（3）使用濃度為1000mg/L含氯消毒液對實驗室的地面、污染區(qū)等進行徹底消毒；（4）實驗結束后開啟紫外燈照射2h以上，如果有條件可以照射過夜，使得實驗室的基因片段徹底變性。

4 小結

利用FQ-RTPCR定性檢測RNA病毒核酸的整個流程包括檢驗前、檢驗中、檢驗后，其每個細節(jié)都有可能對最終的結果產(chǎn)生比較大的影響。在臨床實踐過程中，如果不嚴格控制檢驗質量，這將會嚴重影響著臨床的正確診療。因此，只有不斷提高FQ-RTPCR的質量控制水平，對檢驗質量進行嚴格把關才能保證檢驗結果的正確性，才能為臨床提供有價值的檢驗報告。