去鐵胺、辛伐他汀治療大鼠慢性硬膜下血腫的研究

張士俊，吳煥成，王延民，李宏偉，胡群亮

（天津市北辰醫(yī)院神經(jīng)外科，天津 300400）

慢性硬膜下血腫屬于一種較為常見(jiàn)的顱內(nèi)出血性疾病，目前該病主要治療手段為鉆孔引流術(shù)，其能延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)5.0%～30.0%[1]。核因子-κB 通過(guò)啟動(dòng)和增強(qiáng)κB 位點(diǎn)的活化，使得腦損傷后出現(xiàn)繼發(fā)性損傷，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。辛伐他汀作為一種內(nèi)源性膽固醇抑制劑，具有減輕腦水腫、改善微循環(huán)等作用[2]。去鐵胺作為一種鐵螯合劑，對(duì)鐵離子具有很強(qiáng)的親和力，能結(jié)合鐵蛋白或與含鐵血黃素結(jié)合的鐵，減少鐵在體內(nèi)的病理性沉積，還可絡(luò)合游離的鐵，結(jié)合鐵蛋白或與含鐵血黃素結(jié)合的鐵。此外，去鐵胺也可滲透血腦屏障，降低腦出血后繼發(fā)的神經(jīng)損傷，在局部腦組織中高濃度蓄積，降低血腫部位鐵離子的含量，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用[3]。本研究主要分析去鐵胺、辛伐他汀治療大鼠慢性硬膜下血腫的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究材料

清潔級(jí)6～8 周齡成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠購(gòu)自北京維通利華公司，嚴(yán)格按照動(dòng)物倫理要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。所有SD 大鼠均飼養(yǎng)于清潔無(wú)菌級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，在標(biāo)準(zhǔn)的12 h 明/暗周期的清潔開(kāi)放環(huán)境中飼養(yǎng)，動(dòng)物房保持標(biāo)準(zhǔn)化的溫度濕度，每籠5 只，供應(yīng)充足的氧氣。去鐵胺購(gòu)自美國(guó)sigma 公司，辛伐他汀購(gòu)自大量TAKARA 公司，Western blot 檢測(cè)試劑盒、蛋白定量檢測(cè)試劑盒都購(gòu)自上海生工公司，二甲苯、無(wú)水乙醇、3.0%雙氧水購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 方法

大鼠稱(chēng)重后使用10.0%的水合氯醛腹腔注射麻醉（4 ml/kg），將大鼠俯臥位放置于大鼠腦立體定位儀上，保證大鼠的前囟和后囟處于同一穩(wěn)定的水平面。切開(kāi)大鼠頭部皮膚，暴露前囟和后囟，逐層分離皮下組織直至顱骨表面。固定微量注射器，以前囟為原點(diǎn)，在前囟前0.2 mm、中線(xiàn)右旁3.0 mm 鉆孔，硬腦膜下注入Ⅶ型膠原酶1 μl（0.2 U），調(diào)整注射速度為0.05 μl/min，注射完畢后留針10 min，無(wú)菌骨蠟封閉小孔并進(jìn)行縫合。造模一周后經(jīng)影像檢查血腫形成，將造模成功的大鼠（n=48）隨機(jī)平分為三組：模型組、辛伐他汀組、去鐵胺組，每組16 只。三組都在造模成功后2 h 經(jīng)腹腔注射生理鹽水、2 mg/kg 辛伐他汀、50 mg/kg 去鐵胺各10 μl，之后每12 h 注射1 次，直至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死。

1.3 觀(guān)察指標(biāo)

①所有大鼠都在治療第5 d 與第10 d 進(jìn)行前肢上抬實(shí)驗(yàn)與前肢應(yīng)用協(xié)調(diào)實(shí)驗(yàn)，前者主要比較左側(cè)上肢成功上抬的百分比，后者評(píng)分為（右側(cè)-左側(cè)）/總觸壁次數(shù)×100.0%。②所有大鼠都在治療第10 d與第15 d 分別處死大鼠，測(cè)定血腫體積，斷頭取腦并固定，利用Image ProPlus 圖像分析軟件計(jì)算血腫體積。③所有大鼠都在治療第10 d 與第15 d進(jìn)行靜脈取血500 μl，離心后取血清，采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清IL-6、TNF-α 含量。④取處死大鼠的血腫周?chē)M織，行Western Blot 檢測(cè)水通道蛋白（aquaporin，AQP）4、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）蛋白表達(dá)水平，每孔蛋白上樣量20 μg，電泳、轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，然后加入一抗（1 ∶500）4 ℃孵育過(guò)夜；洗滌3次后，采用熒光二抗室溫?fù)u床孵育1 h，洗滌3 次后將膜置于Odyssey 凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行曝光，計(jì)算VEGF 與AQP4 蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 23.00 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組件比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組前肢上抬實(shí)驗(yàn)與前肢應(yīng)用協(xié)調(diào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

辛伐他汀組、去鐵胺組治療第5 d、第10 d 前肢上抬實(shí)驗(yàn)值高于模型組，前肢應(yīng)用協(xié)調(diào)實(shí)驗(yàn)值低于模型組，且去鐵胺組前肢上抬實(shí)驗(yàn)值高于辛伐他汀組，前肢應(yīng)用協(xié)調(diào)實(shí)驗(yàn)值低于辛伐他汀組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 三組治療不同時(shí)間點(diǎn)前肢上抬實(shí)驗(yàn)與前肢應(yīng)用協(xié)調(diào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較[（±s），%]

表1 三組治療不同時(shí)間點(diǎn)前肢上抬實(shí)驗(yàn)與前肢應(yīng)用協(xié)調(diào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較[（±s），%]

注：與模型組比較，①P＜0.05；與辛伐他汀組比較，②P＜0.05

組別 例數(shù) 前肢上抬實(shí)驗(yàn) 前肢應(yīng)用協(xié)調(diào)實(shí)驗(yàn)治療第5 d 治療第10 d 治療第5 d 治療第10 d模型組 16 52.59±2.83 52.59±3.11 29.48±3.22 29.40±3.09辛伐他汀組 16 58.29±3.11① 64.02±2.58① 26.98±2.48① 23.68±2.77①去鐵胺組 16 66.20±4.41①② 72.98±3.88①② 24.09±3.11①② 19.28±2.44①②F 值 13.203 17.933 10.003 12.485 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 各組血腫體積變化比較

辛伐他汀組、去鐵胺組治療第10d、第15d 血腫體積低于模型組，且去鐵胺組低于辛伐他汀組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 三組治療不同時(shí)間點(diǎn)血腫體積變化比較[（±s），μl]

表2 三組治療不同時(shí)間點(diǎn)血腫體積變化比較[（±s），μl]

注：與模型組比較，①P＜0.05；與辛伐他汀組比較，②P＜0.05

組別 例數(shù) 治療第10 d 治療第15 d模型組 16 65.33±2.48 65.29±3.11辛伐他汀組 16 55.02±3.22① 45.98±2.58①去鐵胺組 16 40.59±5.18①② 34.58±2.86①②F 值 14.863 18.472 P 值 0.000 0.000

2.3 各組血清IL-6、TNF-α 含量變化比較

辛伐他汀組、去鐵胺組治療第10 d、第15 d血清IL-6、TNF-α 含量低于模型組，且去鐵胺組低于辛伐他汀組（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 三組治療不同時(shí)間點(diǎn)血清IL-6、TNF-α 含量比較[（±s），pg/ml]

表3 三組治療不同時(shí)間點(diǎn)血清IL-6、TNF-α 含量比較[（±s），pg/ml]

注：與模型組比較，①P＜0.05；與辛伐他汀組比較，②P＜0.05

組別 例數(shù) IL-6 TNF-α治療第10 d 治療第15 d 治療第10 d 治療第15 d模型組 16 34.33±2.18 34.98±3.14 45.58±2.19 45.78±2.22辛伐他汀組 16 15.69±1.38① 10.87±1.48① 23.77±3.18① 15.06±1.77①去鐵胺組 16 8.29±1.11①② 6.20±0.28①② 10.22±1.47①② 7.10±0.47①②F 值 25.013 33.203 27.014 34.156 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 各組VEGF 與AQP4 蛋白相對(duì)表達(dá)水平變化比較

辛伐他汀組、去鐵胺組治療第10 d、第15 d的VEGF 與AQP4 蛋白相對(duì)表達(dá)水平低于模型組，且去鐵胺組低于辛伐他汀組（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 三組治療不同時(shí)間點(diǎn)VEGF 與AQP4 蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

表4 三組治療不同時(shí)間點(diǎn)VEGF 與AQP4 蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

注：與模型組比較，①P＜0.05；與辛伐他汀組比較，②P＜0.05

組別 例數(shù) VEGF AQP4治療第10 d 治療第15 d 治療第10 d 治療第15 d模型組 16 4.59±0.32 4.57±0.24 5.10±0.27 5.13±0.18辛伐他汀組 16 2.77±0.23① 2.11±0.38① 3.17±0.22① 2.74±0.38①去鐵胺組 16 1.33±0.22①② 0.78±0.11①② 1.45±0.15①② 0.89±0.09①②F 值 19.373 22.477 18.766 21.094 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

3.1 去鐵胺可降低大鼠的血腫體積

本研究結(jié)果顯示，辛伐他汀組、去鐵胺組治療第10 d、第15 d 血腫體積低于模型組，且去鐵胺組低于辛伐他汀組（P＜0.05），表明相對(duì)于辛伐他汀，去鐵胺治療大鼠慢性硬膜下血腫能降低血腫體積。分析可知，他汀類(lèi)藥物能降低血低密度脂蛋白膽固醇水平，改善血管內(nèi)皮功能，抑制血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，穩(wěn)定粥樣斑塊，被廣泛用于心腦血管缺血性事件的一、二級(jí)預(yù)防。辛伐他汀是脂溶性他汀類(lèi)藥物，血腦屏障通透率高，易在血腫腔及顱內(nèi)聚集，對(duì)血管及炎癥的調(diào)節(jié)作用更強(qiáng)，更有利于血腫吸收及恢復(fù)[4]。而去鐵胺可通過(guò)降低游離鐵的羥自由基活性，催化血紅素的降解，增加血紅素加氧酶-1 的轉(zhuǎn)錄，防止羥基自由基的形成，并通過(guò)抑制谷氨酸介導(dǎo)的興奮性毒性來(lái)阻止血紅蛋白的神經(jīng)毒性作用，有利于血腫的吸收[5]。

3.2 去鐵胺可改善大鼠的神經(jīng)功能

辛伐他汀組、去鐵胺組治療第5 d、第10 d 前肢上抬實(shí)驗(yàn)值高于模型組，前肢應(yīng)用協(xié)調(diào)實(shí)驗(yàn)值低于模型組，且與去鐵胺組前肢上抬實(shí)驗(yàn)值高于辛伐他汀組，前肢應(yīng)用協(xié)調(diào)實(shí)驗(yàn)值低于辛伐他汀組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明相對(duì)于辛伐他汀，去鐵胺治療大鼠慢性硬膜下血腫可改善大鼠的神經(jīng)功能。慢性硬膜下血腫是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，包括溶血、炎癥因子大量釋放、補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、腦血流量改變等。辛伐他汀上調(diào)內(nèi)源性一氧化氮合酶，刺激一氧化氮合成，從而起到舒張血管、抑制平滑肌增生和血小板聚集的作用；抑制超氧化物的合成，阻礙血管平滑肌釋放氧自由基，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)的神經(jīng)毒性，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)功能[6]。而去鐵胺，一種自然產(chǎn)生的鐵螯合劑，參與維持腦鐵代謝，且大腦能產(chǎn)生鐵蛋白。鐵蛋白合成主要通過(guò)鐵或非鐵介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，而且腦內(nèi)鐵蛋白水平上調(diào)可能參與神經(jīng)保護(hù)，可減輕慢性硬膜下血腫后與血紅蛋白相關(guān)的腦水腫，抑制神經(jīng)元死亡，可防治神經(jīng)功能缺損和腦萎縮[7]。

3.3 去鐵胺可抑制大鼠血清IL-6、TNF-α 的表達(dá)

辛伐他汀組、去鐵胺組治療第10 d、第15 d血清IL-6、TNF-α 含量低于模型組，且去鐵胺組低于辛伐他汀組（P＜0.05），表明相對(duì)于辛伐他汀，去鐵胺治療大鼠慢性硬膜下血腫能抑制血清IL-6、TNF-α 的表達(dá)。慢性硬膜下血腫可誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)與細(xì)胞毒性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中鐵超載為導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和預(yù)后不良的關(guān)鍵因素。促炎細(xì)胞因子可通過(guò)多種途徑參與慢性硬膜下血腫引起的炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)神經(jīng)元壞死、缺失，是機(jī)體病理生理變化及繼發(fā)性炎癥損傷的重要環(huán)節(jié)。慢性硬膜下血腫可引起繼發(fā)性炎癥損傷，促炎因IL-6、TNF-α 在炎癥反應(yīng)中起重要作用，IL-6、TNF-α 的表達(dá)調(diào)控機(jī)制對(duì)于制定慢性硬膜下血腫的防治策略具有重要意義[8]。辛伐他汀不僅可通過(guò)降血脂途徑發(fā)揮作用，而且還可通過(guò)改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、消炎等途徑，對(duì)腦血管疾病發(fā)揮一定的防治作用。辛伐他汀可通過(guò)抑制NF-κB 通路來(lái)降低IL-6、IL-8、TNF-α 表達(dá)，同時(shí)通過(guò)降低白細(xì)胞遷移、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)等抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而縮小腦梗死的體積，減輕炎癥損傷。而去鐵胺對(duì)離子鐵具有極高的特異性和親和力，能與離子鐵快速結(jié)合形成去鐵敏-鐵復(fù)合物，從而排出體外阻斷羥自由基的形成，具有清除腦組織氧自由基和激活缺氧反應(yīng)基因等作用，可減輕慢性硬膜下血腫模型中相關(guān)鐵蛋白的表達(dá)，減輕腦內(nèi)鐵超載現(xiàn)象，從而可以抑制神經(jīng)元變性和細(xì)胞死亡，更加有效抑制炎癥因子的表達(dá)[8]。

3.4 去鐵胺可抑制大鼠的VEGF 與AQP4 蛋白的表達(dá)

辛伐他汀組、去鐵胺組治療第10d、第15d的VEGF 與AQP4 蛋白相對(duì)表達(dá)水平低于模型組，且去鐵胺組低于辛伐他汀組（P＜0.05），表明辛伐他汀、去鐵胺能夠促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，有效調(diào)節(jié)患者炎癥以及血管生成，促進(jìn)血腫吸收。慢性硬膜下血腫后腦組織VEGF 表達(dá)增加，后者可通過(guò)促分裂原活化蛋白激酶途徑上調(diào)AQP4 水平。AQP4 在神經(jīng)系統(tǒng)分布廣泛，具有多種亞型，在體內(nèi)水穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中有著重要作用，與血腦屏障功能存在相關(guān)性。辛伐他汀可增強(qiáng)相關(guān)因子的表達(dá)活性，進(jìn)而促進(jìn)正常血管的增生以及病理性血管的修復(fù)及成熟，進(jìn)而抑制VEGF 與AQP4 的表達(dá)。而去鐵胺可通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和增殖，進(jìn)一步減少神經(jīng)炎癥，抑制自由基的產(chǎn)生，減輕神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，減少鐵離子在體內(nèi)的病理性聚積，避免進(jìn)一步加重腦損傷，從而有利于抑制VEGF 與AQP4 的表達(dá)[9]。

總之，相對(duì)于辛伐他汀，去鐵胺治療大鼠慢性硬膜下血腫既能抑制血清IL-6、TNF-α 的表達(dá)，也能抑制VEGF 與AQP4 蛋白的表達(dá)，從而降低血腫體積，改善神經(jīng)功能。