線蟲(chóng)在軌液體培養(yǎng)熒光觀測(cè)關(guān)鍵參數(shù)研究

王 巍， 元姝棋， 邱 輝， 盧盈宇， 張 普， 鐘潤(rùn)濤， 孫野青*

(1.大連海事大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院環(huán)境系統(tǒng)生物學(xué)研究所， 大連 116026；2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 北京 100089)

1 引言

秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans，C. elegans)個(gè)體小，其成蟲(chóng)體長(zhǎng)僅1 mm，全身透明，以細(xì)菌為食，全身共有不到1000 個(gè)細(xì)胞，性別為雌雄同體或雄性，繁殖周期短，既可以在固體線蟲(chóng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基(Nematode Growth Medium，NGM)上生長(zhǎng)，也可以在液體培養(yǎng)基(C. elegansMaintenance Medium，CeMM)中生長(zhǎng)。 野生型N2 線蟲(chóng)在固體培養(yǎng)基上發(fā)育至成蟲(chóng)(經(jīng)歷L1、L2、L3、L4 四個(gè)時(shí)期)僅需2～3 d，在液體培養(yǎng)基中發(fā)育至成蟲(chóng)只需6～7 d[1]。 線蟲(chóng)的一些組織可用基因工程手段融合熒光蛋白來(lái)進(jìn)行熒光標(biāo)記，例如用熒光標(biāo)記線蟲(chóng)的體壁肌肉組織、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等，這些熒光標(biāo)記的線蟲(chóng)可以用來(lái)進(jìn)行針對(duì)性的研究。 線蟲(chóng)對(duì)于空間輻射和微重力的感知與人類及一些哺乳動(dòng)物在細(xì)胞水平相似[2]，并且在空間環(huán)境中具有耐受性好、生保需求少、樣品收集簡(jiǎn)單、易于觀察等優(yōu)點(diǎn)。 由此可見(jiàn)，秀麗隱桿線蟲(chóng)是用來(lái)研究空間生物學(xué)效應(yīng)的一種理想模式生物。

從1992 年的航天飛機(jī)(Space Transportation System，STS)計(jì)劃到2004 年的首次線蟲(chóng)國(guó)際飛行實(shí)驗(yàn)(InternationalCaenorhabditis elegansExperiment First Flight，ICE-FIRST)以及中國(guó)的神舟八號(hào)和實(shí)踐十號(hào)飛行任務(wù)已進(jìn)行多次空間線蟲(chóng)搭載實(shí)驗(yàn)，但樣品都為L(zhǎng)1 期線蟲(chóng)幼體或道爾期線蟲(chóng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后線蟲(chóng)樣品返回時(shí)已為世代混合狀態(tài)或未發(fā)育的道爾期狀態(tài)，未實(shí)現(xiàn)單條線蟲(chóng)在軌完整的生命周期觀察。 為了在中國(guó)空間站實(shí)現(xiàn)單線蟲(chóng)在軌發(fā)育的全周期培養(yǎng)和觀測(cè)，本研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了利用微流控芯片對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行基于液體培養(yǎng)體系的自動(dòng)化無(wú)菌培養(yǎng)方案[3]。 選用了CeMM 來(lái)培養(yǎng)線蟲(chóng)，建立了固體培養(yǎng)轉(zhuǎn)為液體培養(yǎng)的方法[1]，馴化了來(lái)源為固體NGM 生長(zhǎng)的N2 野生型線蟲(chóng)，馴化后的線蟲(chóng)可在完全無(wú)菌的狀態(tài)下生長(zhǎng)繁殖，明確了野生型線蟲(chóng)在CeMM 中的生長(zhǎng)環(huán)境以及生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)測(cè)量的方法。 為了避免出現(xiàn)線蟲(chóng)在發(fā)射上行和在軌實(shí)驗(yàn)等待過(guò)程中無(wú)法有效觀測(cè)發(fā)育和產(chǎn)卵等情況，前期實(shí)驗(yàn)也明確了利用12 ℃低溫進(jìn)行在軌前線蟲(chóng)發(fā)育控制，在軌實(shí)驗(yàn)時(shí)再轉(zhuǎn)移至20 ℃正常觀測(cè)的方案[1]。

空間的復(fù)雜環(huán)境尤其是輻射和微重力對(duì)線蟲(chóng)的DNA 損傷、細(xì)胞凋亡、肌肉和神經(jīng)損傷的影響在發(fā)育過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，有必要進(jìn)一步在空間開(kāi)展分子水平的觀測(cè)和驗(yàn)證。 這些研究需要實(shí)現(xiàn)線蟲(chóng)的長(zhǎng)期在軌自動(dòng)化培養(yǎng)以及對(duì)線蟲(chóng)相關(guān)通路熒光標(biāo)志物的觀察。 空間在軌的熒光觀測(cè)實(shí)驗(yàn)由于技術(shù)限制等因素結(jié)果較少，Lei 等[4]在實(shí)踐十號(hào)空間研究中搭載了一種帶有可編程控制溫度、自動(dòng)顯微照相和樣品固定的小鼠胚胎微型培養(yǎng)箱，可以對(duì)小鼠的胚胎細(xì)胞分裂進(jìn)行在軌觀測(cè)。目前還沒(méi)有在軌對(duì)線蟲(chóng)組織層面熒光觀測(cè)的相關(guān)研究，需要在平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)硬件的構(gòu)建，因此構(gòu)建熒光觀測(cè)的方法和實(shí)驗(yàn)條件都需要地面實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。

本文篩選代表性的熒光標(biāo)記線蟲(chóng)，并建立在CeMM 中馴化熒光標(biāo)記線蟲(chóng)和獲取熒光成像指標(biāo)的方法。 實(shí)驗(yàn)分別在12 ℃和20 ℃下測(cè)量熒光線蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程的體長(zhǎng)、體寬、壽命、產(chǎn)卵周期和泳動(dòng)頻率，獲得熒光線蟲(chóng)在發(fā)育時(shí)期的熒光觀測(cè)條件和數(shù)據(jù)，為利用線蟲(chóng)進(jìn)行空間站在軌培養(yǎng)及觀測(cè)的硬件設(shè)計(jì)和技術(shù)要求提供輸入條件。

2 材料與方法

2.1 線蟲(chóng)材料和篩選

秀麗隱桿線蟲(chóng)品系均購(gòu)自美國(guó)線蟲(chóng)遺傳中心(CaenorhabditisGenetics Center，CGC)。

針對(duì)在軌發(fā)育的線蟲(chóng)主要進(jìn)行輻射和微重力協(xié)同效應(yīng)的分析，除野生型線蟲(chóng)外，可以利用微重力感受或輻射感受關(guān)鍵基因熒光標(biāo)記位點(diǎn)的定性和定量分析進(jìn)行效應(yīng)的觀測(cè)。 為了建立熒光線蟲(chóng)培養(yǎng)和觀測(cè)的方法，調(diào)研了對(duì)微重力與輻射產(chǎn)生響應(yīng)并攜帶熒光標(biāo)記位點(diǎn)的線蟲(chóng)。 目前利用線蟲(chóng)進(jìn)行微重力效應(yīng)的研究主要集中在肌肉萎縮、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)與壽命方面[5-7]。 利用線蟲(chóng)進(jìn)行輻射損傷效應(yīng)研究主要集中在基因組突變[8-9]、細(xì)胞凋亡[10]、免疫水平[11]、氧化脅迫[12]等方面。 對(duì)參與以上通路的十幾種關(guān)鍵基因具有熒光標(biāo)記的線蟲(chóng)進(jìn)行篩選(全身或局部大范圍組織能觀測(cè)到熒光)，并利用CeMM 進(jìn)行長(zhǎng)期(≥4 個(gè)月)的馴化得到本文所用2 種熒光標(biāo)記線蟲(chóng)AM141和CZ13799。

2.2 CeMM 配制

CeMM 是多次用在國(guó)際空間站進(jìn)行線蟲(chóng)培養(yǎng)和觀察的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，無(wú)菌無(wú)嗅，包含線蟲(chóng)生長(zhǎng)所需的全部營(yíng)養(yǎng)元素，主要成分包括維生素、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、核苷酸、脂質(zhì)和葡萄糖等。 配制采用Szewczyk 等[13]的化學(xué)定義線蟲(chóng)培養(yǎng)基配制方法。

2.3 CeMM 培養(yǎng)線蟲(chóng)的馴化及同步化

為了得到適應(yīng)CeMM 液體生存環(huán)境的線蟲(chóng)，需要從NGM 上將線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至CeMM 并進(jìn)行馴化。馴化過(guò)程主要包括同步化得到蟲(chóng)卵、將蟲(chóng)卵轉(zhuǎn)移至小體系CeMM 中除菌培養(yǎng)、初代成蟲(chóng)獲取、多次連續(xù)同步化和培養(yǎng)直至線蟲(chóng)培養(yǎng)體系穩(wěn)定不染菌，線蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程穩(wěn)定在固定期間內(nèi)。 獲取到馴化成功的線蟲(chóng)后，可使用CeMM 進(jìn)行大體系培養(yǎng)[1]。 線蟲(chóng)同步化采用氫氧化鈉/次氯酸鈉裂解法[1]。

2.4 CeMM 培養(yǎng)線蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程生理指標(biāo)分析

測(cè)量生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程指標(biāo)包括從幼蟲(chóng)發(fā)育至成蟲(chóng)的體長(zhǎng)和體寬的增長(zhǎng)、產(chǎn)卵周期和壽命，為微流控芯片尺寸設(shè)計(jì)提供參考支持。 測(cè)量體長(zhǎng)時(shí)選取線蟲(chóng)身體的中間位置，測(cè)量體寬時(shí)選取線蟲(chóng)咽部位置利用畫線法測(cè)量。 測(cè)量產(chǎn)卵周期時(shí)選取單條線蟲(chóng)每天連續(xù)跟蹤觀察，從出現(xiàn)子代幼蟲(chóng)起至子代產(chǎn)卵為止。 壽命測(cè)量使用5-氟尿嘧啶(FudR，5-fluoro-2′-deoxyuridine) 抑制產(chǎn)卵，選取單條線蟲(chóng)每天連續(xù)跟蹤觀察線蟲(chóng)是否存活，繪制存活曲線[1]。 實(shí)驗(yàn)分別在20 ℃和12 ℃兩種溫度下測(cè)量。

2.5 CeMM 培養(yǎng)線蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中泳動(dòng)頻率測(cè)量

線蟲(chóng)在CeMM 中的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)呈現(xiàn)為頭部和身體的隨機(jī)快速左右擺動(dòng)，而非在固體培養(yǎng)基上的正弦曲線擺動(dòng)。 因此通過(guò)泳動(dòng)頻率即每分鐘左右各擺動(dòng)一次的數(shù)目來(lái)體現(xiàn)線蟲(chóng)在液體培養(yǎng)基中的運(yùn)動(dòng)能力。 泳動(dòng)頻率將直接體現(xiàn)線蟲(chóng)受到空間微重力影響的效應(yīng)。 線蟲(chóng)同步化后得到L1 期幼蟲(chóng)，在PCR 管內(nèi)分裝培養(yǎng)，管內(nèi)個(gè)體數(shù)大于5 條，分為兩組(12 ℃和20 ℃)，黑暗培養(yǎng)。 每天從每組中取5 條線蟲(chóng)進(jìn)行視頻錄制，統(tǒng)計(jì)線蟲(chóng)每10 s的泳動(dòng)次數(shù)(線蟲(chóng)左右彎曲1 次計(jì)為1 次泳動(dòng))，共測(cè)量5 次。 計(jì)算5 次泳動(dòng)次數(shù)的平均值，將該數(shù)值乘以6，即為線蟲(chóng)每分鐘的泳動(dòng)頻率。 統(tǒng)計(jì)至線蟲(chóng)生長(zhǎng)為成蟲(chóng)并且產(chǎn)卵后不能區(qū)分當(dāng)代和子代為止。

2.6 熒光測(cè)量及分析方法

2.6.1 熒光成像

線蟲(chóng)同步化后得到L1 期幼蟲(chóng)并分裝培養(yǎng)(同2.5 節(jié))，測(cè)量時(shí)將線蟲(chóng)吸取至載玻片，使用灼燒法固定，熒光顯微鏡測(cè)定熒光表達(dá)水平(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)510 nm)。 曝光時(shí)間為300 ms 或600 ms，4×及10×物鏡放大，對(duì)線蟲(chóng)個(gè)體熒光成像跟蹤至線蟲(chóng)發(fā)育為成蟲(chóng)。

2.6.2 熒光數(shù)據(jù)分析方法

利用Image-Pro Plus 6.0 軟件，將熒光圖轉(zhuǎn)化為灰度圖，選擇需要測(cè)量的區(qū)域，測(cè)量熒光成像圖片的累積光密度(Integrated Optical Density，IOD)。

3 結(jié)果與討論

3.1 熒光線蟲(chóng)的篩選、馴化

通過(guò)篩選并利用CeMM 進(jìn)行長(zhǎng)期(≥4 個(gè)月)馴化后，選定了2 種參與微重力響應(yīng)通路的關(guān)鍵分子(unc-54 和unc-25)上帶有YFP(Yellow Fluorescent Protein)或GFP(Green Fluorescent Protein)熒光標(biāo)記的線蟲(chóng)AM141 和CZ13799(表1)，作為本文用于建立熒光標(biāo)記線蟲(chóng)在軌培養(yǎng)觀測(cè)方法的初步樣品。

表1 熒光標(biāo)記線蟲(chóng)特征Table 1 Characteristics of fluorescent labeled C.elegans

AM141[rmIs133 (unc-54p::Q40::YFP)][14]為肌球蛋白重鏈unc-54 基因熒光標(biāo)記線蟲(chóng)，在unc-54 基因后連入了40 個(gè)poly Q 重復(fù)片段構(gòu)建而成。 隨著發(fā)育，poly Q 在體壁肌肉層聚集，引起線蟲(chóng)肌肉蛋白功能喪失，產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)障礙從而出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)能力減退現(xiàn)象。 poly Q 片段后融合了YFP，因而可以在熒光顯微鏡下觀察到線蟲(chóng)體壁熒光。該品系線蟲(chóng)通常被用來(lái)研究微重力對(duì)肌肉系統(tǒng)的影響，Qiao 等[15]利用AM141、HA759 等微重力敏感品系在神舟八號(hào)飛行和地面模擬微重力條件下對(duì)線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)能力和生殖能力進(jìn)行了研究，但未發(fā)現(xiàn)空間飛行對(duì)線蟲(chóng)產(chǎn)生顯著性影響。

CZ13799[juIs76 (unc-25p::GFP) ＋lin-15(＋)]為谷氨酸脫羧酶unc-25 基因熒光標(biāo)記線蟲(chóng)，即GABA 生物合成酶[16]，在該基因后融合GFP，使熒光在GABA 能神經(jīng)元中表達(dá)。 研究者通常使用該基因進(jìn)行運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)的研究。 Xu等[17]研究發(fā)現(xiàn)維持谷氨酸能和γ-氨基丁酸能(GABAergic)系統(tǒng)之間的平衡可以減輕小鼠尾懸吊(模擬微重力效應(yīng))引起的認(rèn)知和神經(jīng)缺陷。

將購(gòu)置于CGC 線蟲(chóng)品系庫(kù)的AM141 和CZ13799 線蟲(chóng)從NGM 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行了擴(kuò)繁和同步化培養(yǎng)，將L1 幼蟲(chóng)進(jìn)行了CeMM 馴化。通過(guò)20 次(不短于4 個(gè)月)的連續(xù)馴化和無(wú)菌篩選，AM141 和CZ13799 線蟲(chóng)可以適應(yīng)CeMM 并穩(wěn)定正常生長(zhǎng)及傳代(圖1)。 馴化后的線蟲(chóng)在CeMM 中的發(fā)育周期(從卵至成蟲(chóng))穩(wěn)定，AM141的發(fā)育周期為(10±1)d，CZ13799 的發(fā)育周期為(8±1)d(圖2)。

圖1 適應(yīng)CeMM 的AM141 和CZ13799 線蟲(chóng)生存狀態(tài)Fig.1 Survival status of AM141 and CZ13799 adapted to CeMM

圖2 馴化后的線蟲(chóng)在CeMM 中的發(fā)育過(guò)程Fig.2 Development process of the domesticated nematode in CeMM

3.2 發(fā)育指標(biāo)分析

3.2.1 體長(zhǎng)與體寬

在得到馴化成功的熒光線蟲(chóng)后，跟蹤了CeMM 培養(yǎng)的野生型線蟲(chóng)(N2)及兩種熒光線蟲(chóng)(AM141，CZ13799)在20 ℃和12 ℃溫度下發(fā)育過(guò)程的體長(zhǎng)和體寬的變化情況。 從L1 期開(kāi)始記錄，進(jìn)行至線蟲(chóng)生長(zhǎng)為成蟲(chóng)為止。 每天統(tǒng)計(jì)線蟲(chóng)個(gè)數(shù)不等，最少為8 條，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 野生型線蟲(chóng)和AM141、CZ13799 熒光線蟲(chóng)在20 ℃下發(fā)育的體長(zhǎng)體寬對(duì)比Fig.3 Comparison of body length and body width of N2 and AM141， CZ13799 nematodes under 20 ℃

圖4 野生型線蟲(chóng)和AM141、CZ13799 熒光線蟲(chóng)在12 ℃下發(fā)育的體長(zhǎng)、體寬對(duì)比Fig.4 Comparison of body length and body width of N2 and AM141， CZ13799 nematodes under 12 ℃

從3 種線蟲(chóng)的體長(zhǎng)、體寬發(fā)育趨勢(shì)數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn):20 ℃下，N2 和CZ13799 兩種線蟲(chóng)的平均發(fā)育時(shí)間為8 d，而AM141 的平均發(fā)育時(shí)間較長(zhǎng)，達(dá)到了10 d。 12 ℃下，N2 和CZ13799 兩種線蟲(chóng)的平均發(fā)育時(shí)間為18 d，而AM141 的平均發(fā)育時(shí)間較長(zhǎng)，達(dá)到了21 d。 兩種溫度下線蟲(chóng)發(fā)育至成蟲(chóng)后的尺寸比較為CZ13799 ＞N2 ＞AM141。 相比于20 ℃，在12 ℃低溫下N2 和CZ13799 兩種線蟲(chóng)發(fā)育至成蟲(chóng)的體長(zhǎng)、體寬減少，而AM141 成蟲(chóng)的體長(zhǎng)和體寬卻增加。

從野生型和兩種熒光標(biāo)記線蟲(chóng)的體長(zhǎng)體寬發(fā)育趨勢(shì)中可以看到，線蟲(chóng)在20 ℃和12 ℃兩種溫度下都可以發(fā)育到成蟲(chóng)，但環(huán)境溫度為12 ℃時(shí)線蟲(chóng)從L1 期至成蟲(chóng)的發(fā)育時(shí)間明顯延緩了10 d以上。

3.2.2 產(chǎn)卵周期

對(duì)于產(chǎn)卵量(表2)，20 ℃下N2 與AM141 數(shù)量接近，CZ13799 顯著性多于前兩品系；12 ℃下N2 產(chǎn)卵量與AM141 相較于20 ℃時(shí)沒(méi)有顯著性減少，但CZ13799 線蟲(chóng)產(chǎn)卵量減少一半以上。

表2 野生型線蟲(chóng)和AM141、CZ13799 熒光線蟲(chóng)在兩個(gè)溫度下的產(chǎn)卵量對(duì)比Table 2 Comparison of egg yield of N2 and AM141，CZ13799 nematodes under two temperatures

對(duì)于產(chǎn)卵周期每天統(tǒng)計(jì)線蟲(chóng)個(gè)數(shù)不等，最少為10 條，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖5。 由圖可以看出，20 ℃下AM141 的產(chǎn)卵起始(第8 天) 晚于N2 和CZ13799(第6 天)，并且產(chǎn)卵的持續(xù)時(shí)間明顯延長(zhǎng)；12 ℃下所有線蟲(chóng)產(chǎn)卵開(kāi)始的時(shí)間后移1 周左右，并且AM141 的產(chǎn)卵起始仍晚于 N2 和CZ13799，并一直延長(zhǎng)至第36 天。

圖5 野生型線蟲(chóng)和AM141、CZ13799 熒光線蟲(chóng)在兩個(gè)溫度下產(chǎn)卵情況對(duì)比Fig.5 Comparison of egg laying of N2 and AM141，CZ13799 nematodes under two temperatures

3.2.3 線蟲(chóng)壽命

若要在CeMM 中對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行長(zhǎng)期連續(xù)的壽命跟蹤，就需要排除子代生長(zhǎng)對(duì)母代的干擾，所以本文實(shí)驗(yàn)利用五氟尿嘧啶來(lái)抑制線蟲(chóng)產(chǎn)卵[18]。

在20 ℃狀態(tài)下，N2 平均壽命為48 d，CZ13799 平均壽命為43 d，AM141 平均壽命為41 d；在12 ℃狀態(tài)下，N2 平均壽命為69 d，CZ13799 平均壽命為62 d，AM141 平均壽命為60 d。

從3 種線蟲(chóng)的存活曲線可以發(fā)現(xiàn)(每個(gè)采樣點(diǎn)統(tǒng)計(jì)線蟲(chóng)條數(shù)不少于100，見(jiàn)圖6):20 ℃狀態(tài)下，3 種線蟲(chóng)的平均壽命都在1 個(gè)月以上，最長(zhǎng)可達(dá)70 ～80 d；N2 線蟲(chóng)壽命要長(zhǎng)于CZ13799 和AM141。 12 ℃狀態(tài)下，野生型和熒光線蟲(chóng)的平均壽命都可達(dá)到2 個(gè)月以上，最長(zhǎng)可達(dá)100 ～120 d；3 種線蟲(chóng)的平均壽命在低溫下延長(zhǎng)約20 d 左右，低溫環(huán)境在延緩線蟲(chóng)發(fā)育的同時(shí)，線蟲(chóng)的壽命也相應(yīng)增長(zhǎng)，N2 線蟲(chóng)壽命長(zhǎng)于CZ13799 和AM141，AM141 平均存活時(shí)間最短。

圖6 野生型線蟲(chóng)和AM141、CZ13799 熒光線蟲(chóng)在兩個(gè)溫度下壽命對(duì)比Fig.6 Comparison of longevity of N2 and AM141，CZ13799 nematodes under two temperatures

3.2.4 泳動(dòng)頻率

在20 ℃和12 ℃下，分別對(duì)野生型線蟲(chóng)和熒光線蟲(chóng)進(jìn)行平均泳動(dòng)頻率統(tǒng)計(jì)，從線蟲(chóng)L1 期開(kāi)始，至發(fā)育至成蟲(chóng)結(jié)束(表3)。 由表中可以看出，20 ℃和12 ℃下，野生型線蟲(chóng)的平均泳動(dòng)頻率均高于2 種熒光線蟲(chóng)，綜合比較為N2 ＞AM141 ＞CZ13799。 3 種線蟲(chóng)在20 ℃下的平均泳動(dòng)頻率都高于12 ℃狀態(tài)下的平均泳動(dòng)頻率，低溫條件降低了線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)水平。

表3 野生型線蟲(chóng)和AM141、CZ13799 熒光線蟲(chóng)在2 個(gè)溫度下的平均泳動(dòng)頻率對(duì)比(n＝5)Table 3 Comparison of average swimming motility of N2 and AM141， CZ13799 nematodes under two temperatures (n＝5) 次/min

對(duì)每一種線蟲(chóng)在20 ℃和12 ℃下的發(fā)育指標(biāo)的分析可以發(fā)現(xiàn):相對(duì)于20 ℃常規(guī)培養(yǎng)溫度，12 ℃低溫下線蟲(chóng)也能夠正常存活和發(fā)育并完成生命周期。 但在12 ℃下，線蟲(chóng)的發(fā)育周期延長(zhǎng)，從L1 幼蟲(chóng)至成蟲(chóng)可以持續(xù)2 ～3 周，這個(gè)過(guò)程中沒(méi)有卵的產(chǎn)出和子代的發(fā)育，利用微流控芯片培養(yǎng)時(shí)不會(huì)對(duì)芯片通道造成影響和阻礙，因此可以作為空間在軌實(shí)驗(yàn)前如發(fā)射場(chǎng)等待、上行、在軌對(duì)接等過(guò)程的保持溫度。

不同的熒光線蟲(chóng)發(fā)育時(shí)期的體長(zhǎng)、體寬、產(chǎn)卵、壽命與野生型相比都有一定區(qū)別，因此在軌的換液頻率與觀測(cè)時(shí)間與野生型相比需要不同的流程。 目前兩種熒光標(biāo)記線蟲(chóng)的體長(zhǎng)、體寬與野生型相比變化范圍在10%左右，在微流控芯片設(shè)計(jì)角度需要進(jìn)一步考慮該問(wèn)題。

3.3 熒光線蟲(chóng)的熒光指標(biāo)及發(fā)育過(guò)程中的變化

3.3.1 熒光標(biāo)記線蟲(chóng)的熒光狀態(tài)

利用光源為激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)510 nm 的熒光顯微鏡進(jìn)行熒光成像，兩種熒光線蟲(chóng)的熒光狀態(tài)如圖7 所示。 在10 倍物鏡放大下可清晰看到AM141 線蟲(chóng)體壁的熒光點(diǎn)分布，該熒光點(diǎn)即為融合了黃色熒光蛋白的unc-54p::Q40 聚集點(diǎn)。 CZ13799 線蟲(chóng)也可觀察到神經(jīng)網(wǎng)的分布。

圖7 AM141、CZ13799 兩種線蟲(chóng)熒光狀態(tài)(10×)Fig.7 Fluorescence status of AM141 and CZ13799 nematode (10×)

根據(jù)在軌實(shí)驗(yàn)裝置熒光成像技術(shù)指標(biāo)的要求，裝置實(shí)際的物鏡放大倍數(shù)在1.7 ～2.5 倍左右，因此利用實(shí)驗(yàn)室最低物鏡4 倍(換算實(shí)際放大倍數(shù)為2.66 倍)進(jìn)行成像，曝光時(shí)間分別設(shè)定為300 ms 和600 ms。 最終明確600 ms 的成像曝光時(shí)間能夠基本滿足2 種熒光線蟲(chóng)的在軌發(fā)育過(guò)程成像需求(圖8)，能夠?qū)崿F(xiàn)線蟲(chóng)熒光強(qiáng)度的測(cè)量。

圖8 AM141、CZ13799 兩種線蟲(chóng)熒光狀態(tài)(4×)Fig.8 Fluorescence status of AM141 and CZ13799 nematode (4×)

AM141 和CZ13799 線蟲(chóng)在20 ℃和12 ℃下從L1 至成蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中的熒光狀態(tài)如圖9、10所示。

圖9 AM141 線蟲(chóng)在20 ℃和12 ℃發(fā)育過(guò)程熒光成像(4×)Fig.9 Fluorescence imaging of AM141 during development under 20 ℃and 12 ℃( 4×)

在20 ℃和12 ℃兩種溫度下，AM141 和CZ13799 線蟲(chóng)在發(fā)育過(guò)程中基本可實(shí)現(xiàn)熒光成像。 20 ℃時(shí)，由于前兩天線蟲(chóng)體型較小，AM141和CZ13799 線蟲(chóng)的熒光點(diǎn)在4 倍時(shí)較為模糊，在第3 天后可以觀察清楚；12 ℃時(shí)則為第11 天以后可觀察清楚。 此結(jié)果可以作為在軌線蟲(chóng)加載和熒光觀測(cè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)限制的輸入條件。 在20 ℃和12 ℃下，4 倍成像均可實(shí)現(xiàn)發(fā)育過(guò)程中熒光強(qiáng)度的測(cè)量。

3.3.2 線蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程的熒光強(qiáng)度變化

圖10 CZ13799 在20 ℃和12 ℃發(fā)育過(guò)程熒光成像(4×)Fig.10 Fluorescence imaging of CZ13799 during development under 20 ℃and 12 ℃(4×)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證低倍顯微放大能否分析出線蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中的熒光強(qiáng)度的變化，對(duì)熒光線蟲(chóng)累積光密度進(jìn)行測(cè)量，物鏡放大倍數(shù)選擇為4 倍。 初步能夠得到AM141 與CZ13799 兩種熒光線蟲(chóng)在兩種溫度下發(fā)育過(guò)程中的熒光強(qiáng)度累積光密度(IOD)變化，繪制散點(diǎn)圖并添加趨勢(shì)線，如圖11、12 所示(線蟲(chóng)每天統(tǒng)計(jì)條數(shù)為3)。

圖11 兩種溫度下AM141 發(fā)育過(guò)程中的熒光強(qiáng)度變化Fig.11 Changes in fluorescence intensity of AM141 during development under two temperatures

由以上兩種線蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中全身熒光強(qiáng)度的散點(diǎn)圖可以看出，在20 ℃和12 ℃兩種溫度條件下，兩種線蟲(chóng)的熒光強(qiáng)度都隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而增強(qiáng)，說(shuō)明4 倍成像可以對(duì)兩種熒光線蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中的全身熒光變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

對(duì)于AM141 來(lái)說(shuō)，12 ℃低溫對(duì)發(fā)育到成蟲(chóng)的線蟲(chóng)熒光表達(dá)沒(méi)有明顯的影響(成蟲(chóng)平均熒光強(qiáng)度均在3×106量級(jí))；而對(duì)于CZ13799 線蟲(chóng)，12 ℃低溫對(duì)成蟲(chóng)的熒光表達(dá)產(chǎn)生了影響(由20 ℃的3.5×106降低到12 ℃的2×106)，說(shuō)明CZ13799 線蟲(chóng)的神經(jīng)發(fā)育狀態(tài)可能會(huì)被低溫所抑制。

圖12 兩種溫度下CZ13799 發(fā)育過(guò)程中的熒光強(qiáng)度變化Fig.12 Changes in fluorescence intensity of CZ13799 during development under two temperatures

4 結(jié)論

本研究基于中國(guó)空間站微流控芯片培養(yǎng)并監(jiān)測(cè)線蟲(chóng)的需求，建立了篩選空間環(huán)境敏感熒光標(biāo)記線蟲(chóng)和熒光成像分析的方法，并研究不同線蟲(chóng)品系在發(fā)育過(guò)程中的生理指標(biāo)差異，為在軌液體培養(yǎng)和熒光觀測(cè)提出關(guān)鍵參數(shù):

1)本文研究篩選具有微重力感受或輻射感受關(guān)鍵基因熒光標(biāo)記位點(diǎn)的熒光線蟲(chóng)，線蟲(chóng)需全身或局部大范圍組織能產(chǎn)生熒光，并能通過(guò)CeMM 進(jìn)行長(zhǎng)期(≥4 個(gè)月)的馴化，篩選出兩種熒光標(biāo)記線蟲(chóng)AM141 和CZ13799。

2)不同熒光標(biāo)記線蟲(chóng)的體長(zhǎng)、體寬與野生型相比變化范圍在10%左右，在微流控芯片通道設(shè)計(jì)需要考慮該變化；不同的熒光線蟲(chóng)發(fā)育時(shí)期的產(chǎn)卵、壽命與野生型相比均有區(qū)別，因此在軌的換液頻率與觀測(cè)時(shí)間與野生型相比需要不同的觀測(cè)流程。

3)AM141、CZ13799 兩種線蟲(chóng)熒光參考觀測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm、曝光時(shí)間為600 ms，4 倍低倍物鏡可以監(jiān)測(cè)熒光線蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中的全身熒光強(qiáng)度變化。

4)12 ℃溫度環(huán)境可以延長(zhǎng)野生型線蟲(chóng)及熒光線蟲(chóng)的發(fā)育周期，延緩產(chǎn)卵起始時(shí)間和壽命，可以作為空間在軌實(shí)驗(yàn)前如發(fā)射場(chǎng)等待、上行、在軌對(duì)接等過(guò)程的保持溫度。