木通科花瓣的發(fā)育、微形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)研究

劉 男，蘇 珊，張小卉

(陜西師范大學 生命科學學院，藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室，陜西 西安 710119)

花是被子植物重要的有性繁殖器官，在被子植物進化過程中扮演著重要角色。花瓣作為花的第二輪器官，可能來源于苞片(木蘭目(Magnoliales)和八角目(Illiciales))或雄蕊退化(毛茛目(Ranunculales))[1]，其發(fā)育過程中包含著多種系統(tǒng)演化信息[2]。毛茛目的成熟花瓣形態(tài)多樣，在顏色、大小、形狀、結(jié)構(gòu)、蜜腺、蜜汁成分、表皮細胞類型等方面表現(xiàn)出豐富的多樣性[1,3-9]；其中，花瓣上的蜜腺結(jié)構(gòu)可以產(chǎn)生蜜汁來吸引傳粉者，具有重要的生物學意義[10-14]。

木通科(Lardizabalaceae)作為毛茛目的核心成員之一，其花瓣短小、綠色，被稱為蜜腺葉[15-16]。該科共有9個屬，約50個種，主要分布在亞洲東南部以及南美洲的智利[16-19]。我國木通科的有花瓣類群隸屬于3個分支，分別為大血藤屬(SargentodoxaRehder & E.H.Wilson)的第一分支、串果藤屬(SinofranchetiaHemsl.)的第二分支以及由野木瓜屬(StauntoniaDC.)有瓣亞屬和八月瓜屬(HolboelliaHook.)組成的第三分支。目前，有關(guān)木通科的研究主要集中在系統(tǒng)發(fā)育、花器官發(fā)生發(fā)育、胚胎學、花瓣發(fā)育基因及種質(zhì)資源等方面[20-26]，有關(guān)木通科花瓣的發(fā)育特征、蜜腺結(jié)構(gòu)、花瓣在科內(nèi)是否存在分化等信息匱乏，阻礙了對該類群繁殖生物學及毛茛目花瓣多樣性的進一步認知[22]。

針對上述問題，本研究擬對我國特有或東南亞特有的木通科大血藤屬、串果藤屬及牛姆瓜屬開展以下研究：(1)觀察花瓣的形態(tài)發(fā)育特征；(2)闡明花瓣蜜腺組織的位置及泌蜜方式；(3)比較不同屬花瓣的微形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)特征，分析其祖先花瓣性狀，推斷花瓣在繁育過程中的功能?；谝陨涎芯浚接懩就苹ò甑亩鄻有蕴卣?，為深入了解毛茛目花瓣多樣性及演化問題提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

大血藤(Sargentodoxacuneata(Oliv.) Rehd. Et Wils.)、串果藤(SinofranchetiachinensisHemsl.)和牛姆瓜(HolboelliagrandifloraReaub.)3個屬的植物均于2014年至2016年采自秦嶺區(qū)域(大血藤和牛姆瓜的雌花、雄花、花蕾采自陜西佛坪，串果藤的雌花、雄花、花蕾采自陜西眉縣)。采集的所有花芽和成熟花均固定在2%戊二醛(glutaraldehyde)的固定液中。

1.2 掃描電子顯微鏡法

使用掃描電子顯微鏡觀察花瓣的形態(tài)發(fā)育和微形態(tài)材料，將不同發(fā)育階段的花芽及成熟花在解剖鏡下剝離，分別經(jīng)梯度乙醇逐級脫水、乙酸異戊酯置換后，置于二氧化碳臨界點干燥儀(K850)中進行干燥，再經(jīng)黏臺、噴金鍍膜后，在掃描電子顯微鏡下(日立HITACHI S-3400N)觀察、拍照。

1.3 透明法

將花瓣維管組織分化材料置于5%的NaOH溶液中，60 ℃溫箱過夜，使材料透明；然后使用0.1%的甲苯胺藍染色，在倒置熒光顯微鏡(Leica DM5000B，DFC490成像系統(tǒng))下觀察、拍照。

1.4 熒光染色法

花瓣的蜜腺組織放置在0.05%的苯胺藍溶液中，室溫染色12 h，激發(fā)光波長為500～580 nm，顯微鏡(Leica DFC490)下觀察、拍照。

1.5 半薄切片法

對花瓣結(jié)構(gòu)的固定材料依次進行磷酸緩沖液清洗、1%鋨酸溶液(OsO4)固定、乙醇系列逐級脫水、環(huán)氧丙烷置換、Epon812樹脂包埋、60 ℃聚合48 h、切片機(Leica EM U6型)切片(厚度2 μm)和0.05%甲苯胺藍溶液染色，封固后在倒置熒光成像系統(tǒng)(Leica CTR5000，DFC490)下觀察、拍照。

1.6 透射電子顯微鏡法

成熟花瓣蜜腺細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的觀察采用超薄切片法，材料的包埋方法同半薄切片法(見1.5)，切片厚度為60 nm。將材料置于銅網(wǎng)碳膜上干燥后，依次用2%醋酸鈾溶液(uranyl acetate)染色30 min、2%檸檬酸鉛溶液(lead citrate)染色10 min，清洗干燥后，使用透射電子顯微鏡(日立HT-77000)在電壓60 kV條件下觀察、照相。

1.7 祖先性狀演化分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得木通科10個種的matK、rbcL和trnL-F序列，參考已有研究，選取星葉草科(Circaeasteraceae)獨葉草(KingdoniaunifloraBalf.f. & W.W.Sm.)、毛茛科(Ranunculaceae)黃連(CoptischinensisFranch.)、小檗科(Berberidaceae)南天竹(NandinadomesticaThunb.)、防己科(Menispermaceae)中華青牛膽(Tinosporasinensis(Lour.) Merr.)為外類群[27]，在Genious軟件中進行序列比對，使用Beast v1.4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，將結(jié)果導入Mesquite中，使用MK模型進行祖先性狀重建。

2 結(jié)果與分析

2.1 花的形態(tài)

由花形態(tài)觀察結(jié)果可以看出(圖1)，木通科植物的花小、單性、稀兩性、雌雄同序或異序，常成總狀花序，花器官通常為三基數(shù)。其中，大血藤的花具有萼片6枚，黃綠色，呈花瓣狀(圖1a、1b、1c)；花瓣(蜜腺葉)6枚，黃白色，較小，呈卵形(圖1d)。大血藤雄花具有雄蕊6枚，退化心皮無或少數(shù)(圖1a)；兩性花具有雄蕊6枚，雌蕊10～50枚(圖1b)，雌、雄蕊成熟期不同；雌花具有雌蕊約90枚，螺旋狀生于突起的花托上，花瓣狀退化雄蕊6～11枚(圖1c)。

串果藤的花具有萼片6枚，綠色，外緣紫色，呈花瓣狀；花瓣6枚，較小，呈倒匙形，頂端二裂，黃綠色，發(fā)育后期邊緣為紫色(圖1e、1f)。串果藤雄花具有雄蕊6枚，退化心皮3枚(圖1e)；雌花具有退化雄蕊6枚，心皮3枚(圖1f)。牛姆瓜花具有6枚肉質(zhì)、花瓣狀的萼片(圖1g、1h)，綠白色或紫色；花瓣6枚，微小，近圓形(圖1i)。牛姆瓜雄花中雄蕊6枚，退化心皮3枚；雌花中退化雄蕊6枚，心皮3枚。

2.2 花瓣的個體發(fā)育及組織分化

在3個屬的植物花瓣原基發(fā)生后，依據(jù)發(fā)育過程中關(guān)鍵性狀出現(xiàn)的特征，可將花瓣形態(tài)發(fā)育過程劃分為4個階段：階段1，原基發(fā)生，花瓣原基為新月形；階段2，暫停發(fā)育(延遲發(fā)育)；階段3，花瓣延展，基部形成柄，發(fā)育為具有短尖的寬卵形或頂端二裂的倒匙形；階段4，花瓣成熟。雌花和雄花的花瓣發(fā)生發(fā)育特征基本相同(圖2、3)。

在大血藤雄花的幼小花蕾中，當雄蕊分化出花粉囊后，在發(fā)育階段3花瓣增大為寬卵形，中央縱向伸長，頂端出現(xiàn)脊狀突起，基部形成明顯的柄部(圖2a、2b、2c)，此時維管束單一無分支(圖3a)。大血藤成熟花瓣為近菱形或倒卵形，高約1.2 mm，有的頂端出現(xiàn)二裂或多裂現(xiàn)象，維管束在中部形成2～3個分支(圖3b)。大血藤雌花和兩性花的花瓣與雄花花瓣發(fā)育特征相似(圖2d、2e、2f)，分泌組織位于頂部，由分泌表皮細胞和位于表皮下的約5層分泌薄壁細胞構(gòu)成(圖3c、3d、3e)。

a、b. 大血藤不同發(fā)育階段的花瓣，標示維管組織的形成過程；c、d. 大血藤花瓣的結(jié)構(gòu)，圖d為圖c的上部放大，指示蜜腺組織結(jié)構(gòu)(箭頭示分泌表皮，星號示變態(tài)氣孔)；e. 大血藤成熟花瓣，指示分化的蜜腺組織(箭頭所示紅色區(qū)域)；f、g. 串果藤花瓣的維管組織分化，指示維管束末端多次分支；h、i. 串果藤花瓣結(jié)構(gòu)，圖i為圖h的分泌區(qū)放大(箭頭示維管束，星號示分泌表皮)；j. 串果藤蜜腺組織分布區(qū)域(箭頭所示)；k、l. 牛姆瓜花瓣的維管組織分化；m、n. 牛姆瓜花瓣結(jié)構(gòu)，圖n為圖m的分泌區(qū)放大；o. 牛姆瓜蜜腺組織分布區(qū)域。

串果藤雄花花瓣在經(jīng)歷延遲發(fā)育后(圖2g)，在階段3發(fā)育為倒梯形，隨后在頂端中央部分出現(xiàn)淺凹(圖2h)和二裂(圖2i)，并在基部形成明顯的柄部(圖2j)，維管束分為2個簡單的分支(圖3f)。開花時，花瓣為頂端二裂的倒匙形，高約1.5 mm(圖2k)，維管束深入瓣部且再次分支(圖3g)。串果藤雌花花瓣的發(fā)育特征與雄花相似(圖2l)，成熟花瓣的分泌組織位于花瓣的瓣部，約占花瓣的2/3(圖3h、3j)，由指狀分泌表皮細胞、5～6層富含淀粉粒的分泌薄壁細胞以及維管束組成(圖3i)。

牛姆瓜的花瓣發(fā)育特征與大血藤花瓣基本相似，開花時雄花花瓣為微小卵形，高約500 μm(圖2m、2n)，具有1條不分支的維管束(圖3k、3l)，分泌組織位于花瓣頂端，由表皮細胞及約6層分泌薄壁細胞組成(圖3m、3n、3o)。雌花的花瓣為約250 μm高的三角形(圖2o)，未見維管束和分泌組織。

2.3 花瓣的表皮微形態(tài)

在木通科3個屬的植物花瓣中共發(fā)現(xiàn)有5種類型的表皮細胞，其中3種表皮細胞具有分泌功能(圖4)。表皮細胞類型1：細胞形狀為不規(guī)則多邊形，長約40 μm，寬約12 μm，具有分泌功能，細胞表面具有絲狀分泌物(圖4b)。表皮細胞類型2：細胞形狀為不規(guī)則多邊形，長約38 μm，寬約13 μm，不具有分泌功能，細胞表面光滑(圖4c)。表皮細胞類型3：

a. 大血藤雄花花瓣(左圖為近軸面，右圖為遠軸面)；b、c、d. 大血藤雄花花瓣表皮細胞類型，b、c、d分別是圖a中細胞類型1、2、3的放大；e. 圖a中星號所示區(qū)域放大，指示花瓣遠軸端的變態(tài)氣孔器；f.圖e的放大，箭頭示分泌物；g. 串果藤雄花花瓣(左圖為近軸面，右圖為遠軸面)；h. 串果藤表皮細胞類型4，為近圓形分泌細胞；i. 串果藤表皮細胞類型5，為乳突狀分泌細胞；j. 串果藤表皮細胞類型5發(fā)育后期，箭頭示分泌物從破裂的細胞中釋放；k. 串果藤表皮細胞類型3；l. 串果藤表皮細胞類型2，不規(guī)則多邊形非分泌細胞；m. 牛姆瓜雄花花瓣；n. 牛姆瓜表皮細胞類型1；o. 牛姆瓜表皮細胞類型2。圖中數(shù)字代表細胞類型，不同顏色區(qū)域所示細胞類型不同。

細胞呈長矩形，長約60 μm，寬約18 μm，不具有分泌功能，細胞表面光滑或存在橫向條紋(圖4d)。表皮細胞類型4：細胞形狀為近圓形，橫截面直徑約為10 μm，具有分泌功能，表面粗糙，細胞與細胞間存在絲狀分泌物(圖4h)。表皮細胞類型5：細胞形狀為乳突狀，長約8 μm，寬約17 μm，具有分泌功能，細胞表面有條紋，中央有乳狀突起(圖4i)。

大血藤成熟花瓣的表皮細胞共有3種類型。表皮細胞類型1位于近軸面頂端(圖4a、4b)，類型2位于近軸面中部和遠軸端上部(圖4a、4c)，類型3位于花瓣基部(圖4a、4d)。在花瓣遠軸面，分布著少量的變態(tài)氣孔器(圖4a)，分泌的小顆粒堆積在氣孔周圍(圖4e、4f)。

串果藤成熟花瓣的表皮細胞共有4種類型。其中，類型4近圓形分泌細胞位于花瓣近軸面和遠軸面的頂端(圖4g、4h)；類型5乳突狀分泌細胞位于花瓣近軸面的中部，盛花期時，細胞壁破裂，分泌物釋放(圖4i、4j)；類型2和類型3表皮細胞分別位于花瓣的柄部(圖4g、4k)和遠軸端的中部(圖4l)。

牛姆瓜成熟花瓣的表皮細胞僅有2種類型。類型1不規(guī)則多邊形分泌細胞位于雄花花瓣近軸面和遠軸面的頂端(圖4m、4n)，類型2多邊形細胞位于花瓣的中部和基部(圖4m、4o)。雌花花瓣僅具有類型2表皮細胞。

2.4 花瓣的超微結(jié)構(gòu)

木通科3個屬花瓣分泌表皮細胞的外切向壁均具有發(fā)達的微通道，細胞質(zhì)濃厚，含有豐富的淀粉粒、線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，薄壁細胞間存在大量的胞間連絲(圖5、6)。

在大血藤盛花期，花瓣分泌表皮細胞的細胞核較大，內(nèi)切向壁具有明顯的內(nèi)突生長(圖5a、5b、5c、5d)，表皮下的薄壁細胞呈不規(guī)則多邊形，細胞壁迂回折疊，具有豐富的細胞器，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多(圖5e、5f、5g)。細胞間隙發(fā)達，蜜汁貯存其內(nèi)(圖5h)。串果藤花瓣的分泌表皮細胞形態(tài)較為規(guī)則，細胞中淀粉粒豐富(圖6a、6b、6c、6d)，表皮細胞之間、表皮細胞與表皮下的分泌薄壁細胞之間的細胞壁上具有明顯的內(nèi)突生長(圖6e)，篩管與篩管間可見發(fā)達的篩板(圖6f、6g)。牛姆瓜雄花花瓣的分泌表皮細胞壁外側(cè)可見絲狀分泌物(圖6h)，分泌表皮細胞與分泌薄壁細胞之間具有發(fā)達的胞間隙，儲存有蜜汁(圖6i)。

2.5 木通科花瓣祖先性狀重建

木通科祖先性狀重建分析表明(圖7)，木通科祖先具有花瓣(52.5%)；基部的大血藤屬和串果藤屬祖先節(jié)點性狀顯示花瓣存在(分別是51.2%和56.6%)；次基部的貓兒屎屬花瓣在演化過程中發(fā)生丟失；在由八月瓜屬等6個屬組成的分支中，花瓣狀態(tài)較為復雜，其祖先節(jié)點的狀態(tài)為花瓣存在(58.0%)。

a. 分泌表皮細胞，展示發(fā)達的線粒體；b. 表皮細胞外切向壁放大，箭頭指示豐富的微通道；c. 表皮細胞內(nèi)切向壁，星號指示內(nèi)突生長；d. 表皮細胞與表皮下的分泌薄壁細胞，箭頭指示胞間連絲；e、f、g. 分泌薄壁細胞；h. 分泌薄壁細胞間發(fā)達的胞間隙。E. 表皮細胞; ER. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng); IS. 細胞間隙; M. 線粒體; N. 細胞核; P. 質(zhì)體; PA. 薄壁組織; PL. 胞間連絲; W. 細胞壁。

3 討論

3.1 木通科花瓣的形態(tài)發(fā)育特征及性狀分析

木通科為毛茛目的核心類群[20]，而毛茛目植物花瓣(蜜腺葉)被認為是從典型的不育雄蕊進化而來[1, 26, 28]。毛茛目(除領(lǐng)春木科無花瓣外)各科花瓣由于早期發(fā)育特征不同，最終形成的花瓣形式多樣，其花瓣在發(fā)育過程中會出現(xiàn)凸起或凹陷，成熟花瓣表現(xiàn)出管狀、囊狀、二唇狀、高腳杯狀等立體結(jié)構(gòu)[9]。在小檗科中，花瓣早期邊緣加厚，中央會形成淺凹或在基部產(chǎn)生一對突起，最終形成卵形、漏斗狀或扇形的成熟花瓣；防己科的花瓣在發(fā)育后期，頂端會產(chǎn)生對折、二裂或卷折[28-29]。木通科為單系支[27]， 在木通科有花瓣的類群中， 分布在南美洲的拉氏藤屬(LardizabalaRuiz & Pav.)和勃奎拉屬(BoquilaDecne.)仍鮮有報道，但本研究結(jié)果表明，大血藤屬、串果藤屬、牛姆瓜屬的花瓣早期發(fā)育特征較為相似，其花瓣發(fā)育均經(jīng)歷了延遲，并在發(fā)育階段3后產(chǎn)生分歧。串果藤的花瓣橫向生長較快，頂端產(chǎn)生二裂；大血藤和牛姆瓜的花瓣由寬卵形逐漸發(fā)育為柄部分化不明顯、頂端尖的倒卵形(大血藤)或卵圓形(牛姆瓜)。木通科大多數(shù)類群在演化過程中保留了祖先具有花瓣的性狀特征，但在少數(shù)屬中出現(xiàn)了花瓣丟失現(xiàn)象。

a、b、c、d.串果藤分泌表皮細胞，a展示淀粉粒，b展示外切向壁(箭頭示豐富的微通道)，c、d分別示內(nèi)切向壁的內(nèi)突生長(星號所示)和胞間連絲(箭頭指示胞間連絲)；e. 串果藤分泌薄壁細胞，展示豐富的線粒體(M)；f. 串果藤導管分子與篩管分子；g. 串果藤篩管分子，展示篩板； h. 牛姆瓜分泌表皮細胞，箭頭指示外切向壁上的微通道；i. 牛姆瓜分泌薄壁細胞，展示淀粉粒和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。E. 表皮細胞; ER. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng); M. 線粒體; N. 細胞核; P. 質(zhì)體; PA. 薄壁組織; PL. 胞間連絲; Se. 篩質(zhì)元素; V. 容器元素; W. 細胞壁。

3.2 木通科花瓣蜜腺組織的結(jié)構(gòu)及泌蜜方式

毛茛目的花瓣既有簡單的片狀結(jié)構(gòu)，也有復雜的立體結(jié)構(gòu)，其蜜腺在花瓣上的位置和結(jié)構(gòu)也存在不同[1-2, 12, 30-32]，有的類群蜜腺隱藏在花瓣基部的鱗片、短囊或距內(nèi)(如毛茛屬(RanunculusL.)、耬斗菜屬(AquilegiaL.)、淫羊藿屬(EpimediumL.))[7,33-34]，而有的類群蜜腺暴露在簡單微小的花瓣瓣部(如紅毛七屬(CaulophyllumMichx.)、蝙蝠葛屬(MenispermumL.))[35-36]。維管組織的參與程度與蜜汁分泌量密切相關(guān)[12]，毛茛科中不同屬植物的蜜腺組織結(jié)構(gòu)不同，如飛燕草屬(ConsolidaGray)的蜜距中既有木質(zhì)部又有韌皮部，而耬斗菜屬和烏頭屬(AconitumL.)的蜜距中僅有韌皮部伸入到分泌薄壁細胞之間[32]。蜜汁通常通過微通道或表皮細胞外切向壁破裂釋放到細胞外[33-34]。

在本研究中，木通科3個屬的花瓣為簡單的片狀，蜜腺組織位于花瓣瓣片頂端，由分泌表皮細胞和5～6層分泌薄壁細胞組成，偶有維管束參與分泌活動(串果藤屬)。蜜汁通過微通道、分泌表皮細胞壁破裂等方式泌出，與毛茛科的蜜汁排出方式相符[33-34]；此外，大血藤花瓣還有變態(tài)的氣孔作為泌蜜通道，這種泌出方式在被子植物中較為普遍[37]。

圖7 MK模型重建木通科祖先花瓣狀態(tài)Fig.7 Reconstruction of ancestral petal state using MK model

當前，有關(guān)木通科的傳粉生物學研究較少，有學者曾根據(jù)大血藤屬的綠色花推斷其可能為風媒傳粉[22]，但本研究表明該科花瓣具有分泌功能，且在大血藤的兩性花中觀察到了訪花昆蟲，因此該科植物的傳粉方式和繁殖策略有待進一步深入研究。

4 結(jié)論

通過對木通科3個屬花瓣的個體發(fā)育特征進行比較，發(fā)現(xiàn)在木通科有花瓣類群中，不同分支上的花瓣在發(fā)育時期頂端出現(xiàn)了二裂、變尖、基部伸長等不同變化，并最終造成花瓣形成了頂端二裂的倒匙形、倒卵形、寬卵形等形態(tài)。木通科3個屬的成熟花瓣均具有分泌功能(除牛姆瓜的雌花花瓣)，蜜腺組織位于花瓣頂端，分泌組織由分泌表皮細胞和分泌薄壁細胞構(gòu)成，蜜汁多通過表皮細胞壁微通道、變態(tài)氣孔或表皮細胞壁破裂的方式向外界釋放。木通科祖先性狀重建分析結(jié)果表明，其祖先具有花瓣特征(52.5%)，在演化過程中大多數(shù)類群保留了祖先狀態(tài)，即存在花瓣，少數(shù)類群丟失了花瓣特征。