穴位電刺激對卒中后大鼠認知功能及氧化應激水平影響

馬伊笛，孫曉偉，胡曉陽△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

腦卒中是一種以血管阻塞為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是全球第二大死亡誘因，每年可造成約 550 萬人死亡[1]。近年來，我國腦卒中發(fā)病率持續(xù)上升，已成為我國成年人群死亡和傷殘的首位病因[2]。相關(guān)研究顯示，臨床60%以上的腦卒中患者會表現(xiàn)出不同程度的認知功能障礙，嚴重影響患者機體功能恢復及日常生活質(zhì)量，也為患者家庭及社會帶來了不可忽視的負擔[3]。目前，針對卒中后認知功能障礙(Post stroke cognitive impairment，PSCI)尚無特異性治療藥物，臨床常用藥物如膽堿酯酶抑制劑、鈣通道阻滯劑等僅有一些改善作用。針刺作為傳統(tǒng)中醫(yī)治療手段之一，目前已廣泛應用于腦卒中及相關(guān)疾病的恢復期治療且治療效果良好。大量臨床觀察研究表明，針刺可對PSCI起到良好治療作用，但其起效機制尚未明確，仍需深入研究。本研究通過建立大鼠大腦中動脈缺血(MCAO)模型，觀察電刺激百會穴、神庭穴對模型大鼠認知功能與氧化應激水平的影響，并探究其作用機制與PI3k/Akt信號通路的聯(lián)系，以期為穴位電刺激治療卒中后認知功能障礙的相關(guān)研究與臨床應用提供參考。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

36只健康SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(180～220) g，來源為黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心，許可證編號：SCXK(黑)2018-001。大鼠飼養(yǎng)于恒溫(22～25 ℃)、恒濕(65%～70%)、自然采光和自由飲水，嚴格遵循《動物實驗管理條例》要求。

1.2 試劑及儀器

1.2.1 儀器 Super Maze Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)(XR-XM101，上海欣軟信息技術(shù)有限公司)；華佗電子針療儀(SDZ-Ⅱ型，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；臺式冷凍離心機(德國Biofugestratos)；渦旋混勻儀[(Vortex)QL-901，海門市其林貝爾儀器制造有限公司]；酶標儀(美國VersaMax)；大腦中動脈阻塞模型線栓(MSRC43B260PK50，深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；無菌針灸針(環(huán)球牌，蘇州針灸用品有限公司，規(guī)格：0.30 mm×25 mm)；非吸收性外科縫線(3-0)(揚州市華翔醫(yī)療器械廠有限公司)；LEICA819一次性窄刀片(德國徠卡LEICA)。

1.2.2 試劑 SOD試劑盒(上海邦奕DRE20008);MDA試劑盒(上海谷研GOY-E2484);Anti-FLK-1、P13K及phospho-Akt(Ser473)(美國CST公司)；總RNA提取試劑(trizol Ta Ka Ra公司)；RT-PCR技術(shù)盒(Ta Ka Ra公司)；PCR Mix(重慶升博生物科技有限公司)。

2 實驗方法

2.1 模型建立及分組方法

將36只雄性SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周，隨機選取10只大鼠作為假手術(shù)組，切開頸部皮膚，分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈與頸外動脈后消毒切口，縫合皮膚。其余26只大鼠采用Longa線栓法進行造模[4]。以2%戊巴比妥鈉溶液對大鼠進行腹腔注射麻醉，給藥量為50 mg/kg。麻醉后剪開大鼠左側(cè)頸部，鈍性分離肌群，游離頸總動脈、頸內(nèi)動脈與頸外動脈。結(jié)扎頸總動脈近心端和頸外動脈，夾閉頸內(nèi)動脈遠端。于頸總動脈附近1 cm處切口，插入尼龍線至頸內(nèi)動脈，深度約20 mm。完成線栓插入后扎緊動脈殘端，消毒后進行常規(guī)縫合。大鼠清醒后單籠飼養(yǎng)，并參考Longa神經(jīng)功能評價方法對術(shù)后大鼠進行神經(jīng)功能評分。評分方法：無明顯神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)(0分)；提尾時左側(cè)前肢屈曲且不能伸展(1分)；爬行時出現(xiàn)追尾表現(xiàn)或向左側(cè)劃圈(2分)；爬行困難，向左側(cè)傾倒(3分)；意識喪失，不能爬行(4分)。選取1～3分大鼠為成功模型，剔除0分與4分大鼠。假手術(shù)組無死亡，手術(shù)組20只大鼠造模成功，隨機分為模型組與治療組，每組10只。

2.2 干預方式

2.2.1 電針組 造模1 d后開始干預。采用電針干預百會穴、神庭穴，腧穴定位參考《實驗針灸學》《實驗動物常用穴位名稱與定位》確定百會穴、神庭穴位置[5-6]。選用直徑0.3 mm無菌針灸針以30 °斜刺入皮膚，針刺深度約2 mm。進針后連接電針儀，設(shè)置疏密波，電壓峰值6 V，頻率1/20 Hz，以針體輕抖且動物耐受為得氣，持續(xù)治療20 min。治療頻率1次/d，連續(xù)治療14 d。

2.2.2 模型組和假手術(shù)組 除每日同時間抓取固定30 min外，不給予任何干預措施。

2.3 指標檢測與觀察方法

2.3.1 Morris水迷宮實驗 于治療14 d后開展Morris水迷宮實驗。采用大鼠通用型圓形水迷宮裝置，水池尺寸120 cm×60 cm，設(shè)置水深25 cm，水溫23 ℃。水池分為4個象限，于第3象限中心放置圓形平臺，平臺尺寸為高23 cm、直徑10 cm。將大鼠面向池壁隨機放入1個象限，計時60 s，記錄其找到平臺時間(即逃避潛伏期)。超過60 s未找到平臺，則視為逃避潛伏期60 s。訓練頻率2次/d，每次間隔20 min，持續(xù)訓練5 d。第6天將平臺撤走，將大鼠于原先象限對側(cè)放入水池，記錄大鼠逃避潛伏期及目標象限停留時間與穿越原平臺次數(shù)。

2.3.2 組織取材 Morris水迷宮行為學測試結(jié)束后，頸椎脫臼處死大鼠后斷頭取出完整腦組織。預冷PBS沖洗后，每組取5份腦組織用濾紙吸干，用于腦組織含水量檢測；3份腦組織按1：9重量體積比例加入PBS勻漿后以5 000 r/min離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)移至EP管中-80℃貯存，用于SOD、MDA含量檢測；兩份腦組織置于EP管中液氮保存，用于PI3k、Akt mRNA檢測。

2.3.3 腦組織含水量檢測 濾紙吸干后天平稱取腦組織濕重，稱量完畢后將腦組織置于110 ℃恒溫干燥箱中干燥，48 h后稱重，記為腦組織干重。全部稱量完畢后計算腦組織含水量。腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

2.3.4 腦組織SOD、MDA含量檢測 取-80 ℃保存的上清液于恒溫水浴鍋中復溫。復溫后，根據(jù)試劑盒要求依次添加已配置好的試劑，添加結(jié)束后充分混勻。采用多功能酶標儀于450 nm波長處進行檢測。

2.3.5 腦組織PI3k、Akt mRNA相對表達水平檢測 取液氮中保存的腦組織，Trizol法提取總RNA后進行反轉(zhuǎn)錄。熒光定量PCR測定PI3K及Akt mRNA的相對表達量。反應條件為：95 ℃預變性1 min,95 ℃變性5 s,60 ℃退火10 s，40次循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，按照2-△△Ct法分析PI3k及Akt mRNA相對表達水平。引物序列見表1。

表1 PI3k、Akt mRNA引物序列

2.4 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1 各組認知功能比較

Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組逃避潛伏期顯著延長，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，治療組逃避潛伏期有所縮短，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組目標象限停留時間及穿越原平臺次數(shù)均降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，治療組目標象限停留時間及穿越原平臺次數(shù)有所增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠認知功能比較

3.2 各組腦組織含水量比較

對比3組大鼠腦組織含水量，發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較，模型組腦組織含水量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，治療組腦組織含水量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腦組織含水量

3.3 各組腦組織SOD、MDA含量比較

對比3組大鼠腦組織SOD及MDA水平發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)比較，模型組腦組織SOD含量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，MDA含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，治療組腦組織SOD含量顯著增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，MDA含量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠腦組織SOD、MDA含量

3.4 各組腦組織PI3k、Akt mRNA相對表達水平比較

對比3組大鼠腦組織PI3k、Akt mRNA相對表達水平發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較，模型組腦組織PI3k、Akt mRNA相對表達水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與模型組比較，治療組PI3k、Akt mRNA相對表達水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5、圖1。

表5 各組大鼠腦組織PI3k、Akt mRNA相對表達水平

注：圖中曲線從右到左依次為假手術(shù)組、模型組和治療組。

4 討論

PSCI被認為是腦卒中主要并發(fā)癥之一，目前，我國已成為卒中終身風險最高和疾病負擔最重的國家[7]。PSCI是氧化應激、炎癥反應等多因素共同作用的結(jié)果。其中，作為參與了血管損傷與神經(jīng)元損傷、腦內(nèi)淀粉樣病變等多個病理過程的重要機制，氧化應激在PSCI發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，針對這一機制的相關(guān)治療手段研究具有重要意義[8]。SOD、MDA是衡量機體的抗氧化能力的重要指標，其中SOD具有清除超氧陰離子的作用，而MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物[9-10]。本實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)神庭穴、百會穴電刺激治療后，MCAO大鼠腦組織SOD含量升高、MDA含量降低，說明電針治療百會穴、神庭穴可調(diào)節(jié)機體抗氧化能力，進而起到保護腦組織的作用。

中醫(yī)認為，PSCI在中醫(yī)學屬“中風”“健忘”“呆病”“癡癥”等范疇，其病機包括腎精虧虛、髓海失充、痰濁血瘀和清竅痹阻等，最終引起神機失用，臨床表現(xiàn)為記憶力、理解力、定向力與空間能力減退等癥狀。針灸作為中醫(yī)中多種非藥物治療方式之一，被廣泛應用于多種疾病的治療，并因其具有應用范圍廣、起效迅速、療效顯著、副作用小、操作簡便與成本低廉等優(yōu)勢，在世界范圍內(nèi)日益普及。中醫(yī)認為，針刺可以通過刺激腧穴，起到疏通氣血、調(diào)和陰陽的作用，進而取得益智健腦，奉養(yǎng)“元神”的功效，所以在神志疾病中應用尤為廣泛。近年有多項臨床研究表明，針刺治療有助于降低腦卒中后遺癥發(fā)病率，并可有效緩解認知障礙癥狀。張含等選取50例卒中后輕度認知障礙患者分別在腦血管病基礎(chǔ)治療外給予單純認知康復訓練治療和認知康復配合頭穴針灸法治療，通過統(tǒng)計患者MoCA評分、MMSE評分及ADL評分觀察各組療效，結(jié)果顯示基礎(chǔ)治療配合頭穴針灸法可有效改善患者認知功能，提高患者日常生活能力[11]。楊金華等對70例PSCI患者分別采用常規(guī)基礎(chǔ)治療結(jié)合康復訓練療法和在基礎(chǔ)治療與康復訓練基礎(chǔ)上配合針刺進行治療，通過對比采用不同療法的兩組患者的瞬時記憶評分、蒙特利爾認知評估和延遲記憶評分、血管性癡呆辨證分型表中腎實質(zhì)功能不全評分以及兩組患者治療前后的事件相關(guān)電位P300的潛伏期及波幅變化情況，發(fā)現(xiàn)針刺能有效改善PSCI患者的認知功能和中醫(yī)證候評分，配合針刺的治療總效率高于單純常規(guī)療法[12]。此外還有靳三針聯(lián)合多奈哌齊治療PSCI，通督調(diào)神針法治療PSCI等相關(guān)臨床研究，均顯示針刺可對卒中后患者的認知功能恢復起到良好促進作用[13-14]。電針是一種將針刺與微電流刺激相結(jié)合的治療方法，通過在毫針針刺得氣后施以脈沖電流以輔助傳統(tǒng)行針手法，加強針刺的療效。與常規(guī)針刺相比，電針具有刺激量強、方便靈活和針感持久等優(yōu)勢，目前已廣泛應用于臨床。本實驗對MCAO模型大鼠百會穴、神庭穴施以電刺激治療，發(fā)現(xiàn)與模型組比較，治療組逃避潛伏期縮短、目標象限停留時間延長和穿越原平臺次數(shù)增加，并通過對比各組大鼠腦組織含水量發(fā)現(xiàn)電針治療后腦組織含水量明顯降低。實驗結(jié)果提示電針百會穴、神庭穴可有效改善卒中大鼠認知功能，減輕腦水腫癥狀。

PI3k/Akt信號轉(zhuǎn)導通路是機體內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導途徑之一，與多個信號通路及生理功能聯(lián)系密切，可見于多種疾病如癌癥、糖尿病、心血管疾病與神經(jīng)系統(tǒng)疾病等相關(guān)機制研究。有相關(guān)研究顯示，PI3k/Akt信號通路可通過磷酸化GSK-3β、活化Nrf2等機制減輕氧化應激對腦組織和神經(jīng)細胞的損傷[15]。目前，臨床上應用的多種神經(jīng)保護藥物如阿托伐他汀、異丙酚和雌二醇以及腦缺血預處理技術(shù)、亞低溫技術(shù)等均可通過調(diào)節(jié)PI3k/Akt通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本研究通過qPCR法檢測模型大鼠腦組織PI3k及Akt mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)與模型組相比，治療組PI3k及Akt表達均有所提升，說明電刺激神庭穴、百會穴可激活大鼠PI3k/Akt信號通路，結(jié)合酶聯(lián)免疫結(jié)果推測，其可能是神庭穴、百會電針法治療PSCI機制之一。

綜上所述，電刺激百會穴、神庭穴可改善腦卒中大鼠認知功能，減輕卒中大鼠腦水腫癥狀，提高大鼠機體抗氧化水平，其作用機制可能與激活PI3k/Akt信號通路有關(guān)。在今后的研究中，可對百會穴、神庭穴電針治療卒中后認知障礙的具體下游機制進行進一步探索研究，為臨床治療卒中后認知障礙提供更可靠、更明確和更具實踐意義的臨床診療依據(jù)及研究基礎(chǔ)。